Частина 1 Нейропротекторні ефекти фенілетаноїдних глікозидів у моделі хвороби Альцгеймера in vitro

Чи реальний нейропротекторний ефект Cistanche?

ЦЗЯНХУА ЯН1*, БОВІ JU1,2*, ЯО ЯН1, ХУАНЬ ХУАНЬ СЮ1,

SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 і JUMPING HU2

1 відділення фармації Першої філійної лікарні; 2 відділ природних ліків,

Фармацевтичний коледж Сіньцзянського медичного університету, Урумчі, Сіньцзян 830011, КНР

Одержано 08.01.2016 р.; Прийнято 6 січня 2017 року

Анотація.

Це дослідження мало на меті дослідити нейропротекторні ефектифенілетаноїдні глікозиди(PhGs) на H2O2- та -амілоїдному пептиді (A )1-42-індуковане пошкодження клітин PC12 як in vitro модель хвороби Альцгеймера (AD). Оптимальні умови індукції були встановлені шляхом скринінгу різних часів інкубації та концентрацій. Клітини PC12 обробляли 0.5 мкМ A 1-42 і H2O2 у присутності PhGs протягом 24 годин, а потім життєздатність клітин оцінювали за допомогою аналізу MTT; також вимірювали виділення лактатдегідрогенази (LDH) і вміст малонового діальдегіду (MDA). Оптимальними умовами для створення моделі AD були обробка клітин PC12 0,5 мкМ A 1-42 протягом 48 годин або 25 мкМ H2O2, розчиненої в DMEM з PBS. PhG у концентраціях 5, 25 і 50 мкг/мл підвищували життєздатність і знижували вивільнення LDH і MDA клітинами PC12, пошкодженими A 1-42 або H2O2. На завершення модель ушкодження клітин PC12, викликаного A 1-42- і H2O2-, була успішно створена. Показано, що PhG мають значний нейропротекторний ефект проти A 1-42- або H2O2-індукованого пошкодження клітин.

Для отримання додаткової інформації звертайтеся до:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola має багато ефектів, натисніть тут, щоб дізнатися більше

вступ

Хвороба Альцгеймера (AD), нейродегенеративний розлад із клінічними характеристиками прогресуючої втрати пам’яті та порушення когнітивних функцій (1), є найпоширенішою причиною деменції у всьому світі (2). Фінансові витрати є величезними через поширеність AD (3). Отже, необхідно терміново розробити відповідні засоби для управління та профілактики AD.

Патогенез AD тісно пов'язаний з накопиченням нейрофібрилярних клубків і сенільних бляшок (SP) в уражених областях мозку (4,5). Повідомлялося, що -амілоїдний пептид (A), головний компонент SPs, відіграє причинну роль у прогресуванні AD, оскільки має токсичну дію на нейрональні клітини (6). Фрагменти A, включаючи A 1-40, A 25-35 і A 1-42, були створені шляхом розщеплення білка-попередника амілоїду (7). Було виявлено, що нейротоксичність A 1-42 значно вища, ніж A 25-35 і A 1-40, і A 1-42 здатний індукувати модель AD (1,{ {13}}). Окислювальний стрес може брати участь у патогенезі AD і є основним механізмом, що лежить в основі A-індукованої нейротоксичності (11-13). Кілька досліджень показали, що A 1-42 викликає внутрішньоклітинне накопичення активних форм кисню (АФК), що призводить до окислення ліпідів і білків, пошкодження ДНК і активації сигналізації контрольних точок клітинного циклу (1, 14, 15). Надмірна кількість H2O2 може призвести до окисного пошкодження та індукувати апоптоз клітин PC12 (16). Таким чином, націлювання на окислювальний стрес може бути багатообіцяючим підходом до розробки терапевтичних стратегій для інгібування A-індукованої нейротоксичності при AD. Герба (Х.)Цистанхе, китайський фітопрепарат, який зазвичай використовується в материковому Китаї для живлення нирок і поповнення есенції та крові, використовувався для лікування втрати пам’яті та старечого запору (17).Фенілетаноїдний глікозид(PhG), один із основних компонентів H.Цистанхе, покращує порушення апоптозу нейронів, спричиненого A 25-35, завдяки своїм антиоксидантним ефектам (18,19). Попереднє дослідження виявило п’ять основних компонентів із загальної кількості PhG, а самеактеозид, 2'-ацетилактеозид, ехінакозид, цистанозиди таізоактеозид(20). Серед цих компонентівактеозидіехінакозидповідомлялося про нейропротекторну дію на нейротоксичність, спричинену A 25-35- або H2O2- (21-23). Наприклад, Ву та інші (24) припустили, щоактеозидіехінакозидпокращення когнітивної дисфункції, викликаної A 1-42. Це дослідження мало на меті дослідити захисні ефекти PhGs у клітинній моделі щурів in vitro AD.

Матеріали та методи

ПідготовказPhGs. Загальні PhG були екстраговані зH. Цистанхеяк описано раніше (25). Висушене на повітрі стеблоH. Цистанхе подрібнювали в порошок і екстрагували перколяцією 80% EtOH. Перколят випарювали при зниженні температури

тиску з подальшим повторним суспендуванням у відповідній кількості Н₂O₂(100 мкмоль/л). Суміш виділяли на колонці з макропористою смолою SP-825 (Mitsubishi Chemical, Токіо, Японія) і елюювали 0, 30, 50, 70 і 90 відсотками EtOH у воді. Щоб отримати фракцію, збагачену PhG, 30-50% елюентів EtOH концентрували та сушили при зниженому тиску. Ультрафіолетову (УФ) спектрофотометрію проводили для визначення загального PhG. Змістехінакозидіактеозидвизначали за допомогою рідинної хроматографії високого тиску згідно з попереднім протоколом (26). Використовували колонку Hypersil ODS-2 (4,6x250 мм, 5 мкм; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Далянь, Китай), яку підтримували при кімнатній температурі. Рухомими фазами були метилціаніди та вода, що містила 0.4% фосфорної кислоти (об./об.; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина). Швидкість потоку становила 0,75 мл/хв, а довжину хвилі встановлювали на 333 нм.

Культура клітинімедикаментозне лікування.Клітинну лінію феохромоцитоми щурів PC12 надав доктор Хе Чуньхуй, медична школа Сіньцзянського медичного університету (Урумчі, Китай). Клітини культивували в середовищі Ігла, модифікованому Dulbecco з високим вмістом глюкози (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, США), що містило 10 відсотків фетальної бичачої сироватки (Sangon Biotech Co. Ltd., Шанхай, Китай), 100 Од/мл. пеніциліну та 100 ОД/мл стрептоміцину в інкубаторі при 37˚C, що містить 5% CO₂і 95 відсотків повітря. Після досягнення 80% злиття клітини обробляли 0,25% трипсину та пасували.

Щоб усунути вплив самого препарату на ріст клітин PC12, був проведений експеримент щодо токсичності. Коротше кажучи, клітини PC12 (3x10⁴клітин/мл) висівали в 96-лункові планшети по 100 мкл/лунку та інкубували при 37˚C протягом ночі. Після відкидання супернатанту до холостої групи додавали 200 мкл повного DMEM, тоді як клітини в групах втручання обробляли PhG у різних дозах (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 та 200 мкг/ мл). Після інкубації клітин при 37°C протягом 48 годин до кожної лунки додавали 20 мкл розчину МТТ (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Після інкубації протягом 4 годин супернатант видаляли і додавали 150 мкл диметилсульфоксиду на лунку з наступним перемішуванням протягом 10 хвилин. Значення оптичної густини (OD) при 490 нм визначалися за допомогою пристрою для зчитування планшетів ELISA.

A 1‑ 42‑індукованийПК12пошкодження клітини.Пептид 1-42, придбаний у Bioss Biotech (Пекін, Китай), розчиняли у воді (100 мкг/мл). Згодом суміш інкубували при 37°C протягом 4 днів і зберігали при 4°C перед використанням.

Клітини PC12 висівали в 96-лункові планшети (3xl0)⁴клітин в 100 мкл на лунку). Після 24-годинного культивування для прилипання 50 мкл A 1-42 у різних кінцевих концентраціях (0, 0.25, 0,5, 1, 1,5 або 2 мкМ) розчиняють у безсироватковій DMEM з наступною інкубацією протягом 24, 48, 72 або 96 годин. Життєздатність клітин оцінювали методом МТТ. Оптимальна концентрація A 1-42 становила 0,5 мкМ. Клітини PC12 (3x10⁴клітин на лунку) обробляли різними дозами PhG ({{0}}, 0.5, 5, 25 або 50 мкг/мл) у присутності 0,5 мкМ A {{8 }} протягом 24 год. Життєздатність клітин оцінювали методом МТТ.

H₂O₂‑індукованийПК12пошкодження клітини. Клітини PC12 висівали в 96-лункові планшети (3xl0)⁴клітин по 100 мкл на лунку). Після культивування

протягом 24 год для прихильності, 100 мкл H₂O₂у різних кінцевих концентраціях ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 і 500 мкМ), розчинених у DMEM з або без PBS (0,01 моль/л), додавали з наступною інкубацією протягом 24 години Життєздатність клітин оцінювали методом МТТ. Оптимальний H₂O₂Для встановлення визначали концентрацію та розчинникв пробірцімодель AD.

клітини PC12 (3xl0)⁴клітин на лунку) обробляли різними дозами PhG ({{0}}, 0,5, 5, 25 і 50 мкМ). Після 24-годинного культивування для зчеплення клітини PC12 обробляли 100 мкл H₂O₂розчиняють у DMEM з PBS у присутності PhGs протягом 24 годин. Життєздатність клітин оцінювали методом МТТ.

лактатдегідрогеназа (ЛДГ)аналіз вивільнення. Пошкодження клітин оцінювали шляхом вимірювання активності LDH у супернатанті клітин PC12 за допомогою набору LDH відповідно до протоколу виробника (номер за каталогом 20150604; Інститут біоінженерії Nanjing Jiancheng, Нанкін, Китай). Коротше кажучи, двічі дистильована H₂O, {{0}}.2 мкмоль/мл піровиноградної кислоти, матричний буфер і буфер коензиму I додавали послідовно через 48 годин після обробки препаратом. Після інкубації при 37˚C протягом 15 хвилин додавали 2,4-динітро-фенілгідразин. Згодом до кожної лунки додавали 250 мкл 0,4 М розчину NaOH. Супернатант збирали після інкубації протягом 30 хв при кімнатній температурі. Потім виміряли абсорбцію при 450 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів.

Вимірюваннязмалоновий діальдегід(MDA). MDA вимірювали в надосадовій рідині клітин PC12 за допомогою комерційного набору (кат. № 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) згідно з протоколом виробника. Коротше кажучи, зневоднений спирт та інші реагенти додавали по порядку з подальшою інкубацією на водяній бані при 95˚C протягом 40 хв. Суміш центрифугували при 1006xg і 25˚C протягом 10 хв після охолодження. Потім супернатант використовували для визначення вмісту MDA. Згодом абсорбцію вимірювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів при 532 нм.

Оцінка з захисний ефекти з ехінакозид і актеозид проти нашої ери в пробірка. Клітини PC12 висівали з щільністю 3xl0⁴клітин/лунку в {{0}}планшетах з лунками (100 мкл/лунку). Клітини інкубували з препаратами, включаючи ехінакозид (номер за кат. 111670-200503; Національні інститути контролю за харчовими продуктами та ліками, Пекін, Китай) та актеозид (номер за кат. 111530-200505; Національні інститути контролю за харчовими продуктами та ліками ) у різних концентраціях (0,5, 25 та 50 мкг/мл). Згодом клітини обробляли A 1-42 або H₂O₂протягом 24 годин, і життєздатність клітин вимірювали методом МТТ.

Статистичний аналіз. Значення виражаються як середнє ± стандартне відхилення. Для міжгрупових порівнянь використовували t-критерій Стьюдента. Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Чикаго, Іллінойс, США). П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Результати

Кількісне визначення PhG з H. Cistanches.УФ-спектри екстрагованих PhG, а також стандартних розчинівехінакозиді актеозиду були зареєстровані, і результати показали, що УФ-спектри були послідовними (рис. 1). УФ спектрофотометрія

показали, що вміст PhG становив 87,6 відсотка. Результати ВЕРХ показали, що вміст ехінакозиду та актеозиду був

37,7 та 17,8 відсотка відповідно (рис. 2).

РішучістьзвідеалPhGконцентрація. Порівняно з холостою групою, PhG при 75, 100, 125, 150, 175 та 200 мкг/мл мав значний інгібуючий ефект на клітини PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 відсотків (рис. 3). Таким чином, PhGs у концентрації 5, 25 та 50 мкг/мл використовували для обробки клітин PC12 у подальших експериментах через те, що вони не впливають на життєздатність клітин.

A 1‑42‑індукованийПК12пошкодження клітини.Порівняно з контрольною групою життєздатність клітин у групі пошкодження 0,5 мкМ A 1-42 становила 63 відсотки (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">в пробірціМодель AD.

Також визначали активність клітин PC12, оброблених 0.5 мкМ A 1-42 в присутності безпечних доз PhG (5, 25 і 50 мкг/мл) протягом 24 годин. У порівнянні з модельною групою (П<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">

H₂O₂‑індукованийПК12пошкодження клітини. Життєздатність клітин PC12, оброблених 25 мкМ H₂O₂розчинений у DMEM з PBS становив 56,43 відсотка. Життєздатність клітин PC12, оброблених 200 мкМ H₂O₂розчиненого в DMEM без PBS становив 71,64 відсотка (Таблиця I). Таким чином, клітини PC12, оброблені 25 мкМ H₂O₂розчинені в DMEM з PBS були обрані як оптимальні умови для створення моделі AD.

Порівняно з контрольною групою життєздатність клітин у модельній групі становила 48,8 відсотка (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">

Рівень PhG та життєздатність клітин PC12, оброблених PhG у концентраціях 5, 25 та 50 мкг/мл, становили 54, 57 та 64 відсотки відповідно (Таблиця II).

PhG пригнічують спричинене пошкодженням вивільнення LDH клітинами PC12. Порівняно з контрольною групою вміст ЛДГ у супернатанті пошкоджених клітин PC12 був підвищений, який інгібувався PhG залежно від концентрації. Цей результат показав, що PhG мають значний нейропротекторний ефект на клітини PC12 (рис. 6).

інгібується PhG залежно від концентрації. Цей результат показав, що PhG має значний нейропротекторний ефект на клітини PC12 (рис. 7). PhG і його компоненти ехінакозид і актеозид рятують життєздатність пошкоджених клітин PC12. Порівняно з модельною групою лікування актеозидом значно підвищило життєздатність A 1-42-пошкоджених клітин PC12 залежно від дози. PhG та ехінакозид також значно підвищили життєздатність A 1-42-пошкоджених клітин PC12 у всіх перевірених концентраціях (рис. 8A).

Порівняно з модельною групою актеозид значно підвищив життєздатність клітин PC12, оброблених H₂O₂. PhG також підвищили життєздатність клітин PC12, оброблених H₂O₂, тоді як ефект не був значущим при концентраціях 5 і 25 мкг/мл (рис. 8B). Крім того, ехінакозид підвищував життєздатність клітин на 25 мкг/мл.

Підсумовуючи, актеозид, PhGs та ехінакозид мали значний нейропротекторний вплив на клітини PC12, які були пошкоджені A 1-42 або H₂O₂.