Нейроендокринна імунна функція Cistanche Deserticola та її продуктів для приготування рисового вина на моделі щурів, індукованих глюкокортикоїдами-Ⅰ

1. Вступ

Цистанш пустеля, який називають «женьшенем пустелі», — це традиційна китайська медицина, яку століттями використовували як ян-тонізуючу траву дляактивізація нирок і зміцнення ян[1]. Вісім видів і одна варіаціяЦистанхея трав'яна були зареєстровані лише в КитаїCistanche deserticolaYC Ма іЦистанка трубчаста(Schenk) Wight зафіксовані в Китайській фармакопеї [2]. Фармакологічні дослідження показали цеCistanches Herbaвиявляє нейропротекторну [3], імуномодулюючу [4], кардіопротекторну [5], противтомну [6], протизапальну [7], гепатопротекторну [8], антиоксидантну [9], антибактеріальну [10], проносну [11] та протипухлинну дію ефекти [12]. Широкий спектр зареєстрованих біологічних дій цього роду пояснюється його складним і різноманітним фітохімічним складом.Cistanche deserticolaмістить фенілетанолові глікозиди, іридоїди, полісахариди [13] та ін. Вміст фенілетаноїдних глікозидів найвищий у вихідних лікарських речовинах [14].

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЗДІЙСНЕННЯ НИРОК PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Обробка китайської Materia Medica (CMM) є традиційною фармацевтичною технікою для задоволення різних вимог щодо лікування, дозування та виготовлення препаратів відповідно до теорії традиційної китайської медицини. Ці перероблені продукти називаються шматочками відвару, які використовуються в клініках. Обробка спрямована на підвищення ефективності для зниження токсичності необроблених лікарських засобів. Китайська фармакопея 2015 року зафіксувала, що товсті скибочки цистанчі (CD) і цистанчі, пропарені на рисовому вині (WCD), можна використовувати як шматочки відвару в клініці. Наша дослідницька група показала, що проносний ефект був полегшений, а антистаріння та підбадьорливий вплив на нирки-ян були посилені після того, як цистаншу приготували на пару з рисовим вином [15].

При синдромі нирково-янг-дефіциту порушується функція осі гіпоталамус-гіпофіз-наднирники-вилочкова залоза (ГПАТ) [16]. Пацієнти з дефіцитом нирок-ян також мають значну імунну дисфункцію. Дисфункція осі HPA тісно пов'язана з імунодефіцитом. Теорія нейроендокринної імунної мережі (NEI) показує, що імунна та нейроендокринна системи мають спільні багато лігандів і рецепторів [17], а гіпоталамус вважається стрижнем, який зв’язує нейроендокринну систему з імунною.

У цьому дослідженні ми відтворили дефіцит нирок-ян у модельних щурів з ін’єкцією екзогенного кортикостероїду та дослідили механізм дефіциту нирок-ян у відповідь на різні продукти обробки Cistanche deserticola з точки зору ендокринної імунної функції.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали та реагенти

Cistanche deserticola було зібрано в Alashan Neimenggu у 2019 році та ідентифіковано як висушені м’ясисті стебла Cistanche deserticola YC Ma професором Яньцзюнь Чжаєм (Фармацевтична школа Ляонінського університету традиційної китайської медицини, Китай). Зразки ваучерів зберігалися в технологічному центрі переробної техніки Ляоніна.

Стандартні сполуки аджуголу були придбані у Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Ченду, Китай); цистанозид F,ехінакозид, цистанозид А та ізоактеозидбули придбані у Must Company (Сичуань, Китай); актеозид був придбаний у Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Далянь, Китай). Ацетонітрил і метанол класу MS були придбані у Merck KGaA (Дармштадт, Німеччина). Мурашину кислоту класу HPLC було придбано у Merck KGaA (Дармштадт, Німеччина). Рисове вино було придбано у Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Чжецзян, Китай).

Кортикостерон (CAS: 50-22-6, чистота > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), таблетки chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), АКТГ щурів, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2 та IL-10 ELISA набори були придбані в Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Набір щурів кортизолу ELISA надано BOSK Co., антитіло CD4 щурів, антитіло CD8a (№ 561833 і 559976), лізат еритроцитів (Solarbio, R1010), буферний розчин PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM і праймери -актину вище та нижче були надані компанією Guangzhou Invitrogen Co. Набір для зворотної транскрипції (№ RR037A) і набір для синтезу кДНК (№ 10000068167) були надані компанією Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Хлороформ, ізопропанол, 75% етанол і уретан Усі розчини були аналітично чистими та виготовлені компанією Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Надчисту воду було отримано за допомогою системи Milli-Q (18,2 МОм, Мілліпор, Массачусетс, США).

2.2. Експериментальні прилади

Ферментний маркер (Thermo, модель 3530911931), автоматична машина для миття пластин (модель HBS- 4009), цифровий вимірювач сили на дисплеї (модель VICTOR- 50N), високошвидкісна морозильна центрифуга (модель Sigma 3k15). ), ультрамікро спектрофотометр (модель B-50Q), генний ампліфікатор (модель L96G), кількісна ПЛР флуоресценції в реальному часі (модель StepOne), проточний цитометр (модель AC66051710132), парафіновий мікротом (модель Laika), мікроскоп (Olympus). , модель BS-53) і прилад для чистої води (модель F7JA36507).

2.3. Підготовка зразків для UPLC-Q-TOF-MS і фармакологічних експериментів

WCD був оброблений з тієї ж партіїЦистанш пустеляв нашій лабораторії. Для приготування WCD сухі шматки CD (товщиною 5 мм) (100 г) заливали рисовим вином (30 мл), пропарювали при високому тиску (1,25 кПа) протягом 4 годин, а потім сушили при 55 градусах.

Грубі порошки CD і WCD замочували 10 рази в 95% етанолі протягом 0,5 години, екстрагували зі зворотним холодильником 3 рази протягом 1 години, фільтрували, а фільтрати об’єднували 3 рази. Етанол відновлювали при зниженому тиску та отримували екстракт для введення. Екстракт (1 мл) додавали до 50% метанолу, доводячи загальний об’єм до 20 мл, і зберігали при 4 градусах для аналізу вмісту.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Умови UPLC-QqQ-MS для аналізу екстрактів CD та WCD

2.4.1. Аналітичні умови LCThMS

Для збору та обробки даних використовувалася система UPLC-MSThMS з програмним забезпеченням MassLynx 4.1 Analyst. Аналітичною колонкою був Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм) при температурі 40 градусів C. Рухома фаза був 0.1% водний розчин мурашиної кислоти (А) і ацетонітрил, що містить 0,1% мурашиної кислоти (Б). Градієнт елюції становив 0.00–1.00 хв з 3% B, 1,01–2.00 хв з 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} хв з 12% B, 3,01–4.00 хв з 15% B, 4,01–5.00 хв з 20% B, 5,01–6.00 хв з 22 % B, 6,01–8.00 хв з 25% B і 8,01–9.00 хв з 10% B. Швидкість потоку становила 0,3 мл·год хв, а об’єм ін’єкції становив 1,0 мкл.

У режимі негативних іонів використовувався потрійний четвірний мас-спектрометр Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA), оснащений джерелом іонізації з електророзпиленням (ESI). Десольватаційним газом був азот зі швидкістю потоку 500 л/год при температурі 250 градусів. Усі виявлені сполуки вимірювали в режимі моніторингу множинних реакцій (MRM); Таблиця 1 показує енергетичні параметри, а таблиця 2 показує калібрувальні криві для аналізованих компонентів.

2.4.2. Приготування еталонних речовин

Тубулозид А (3.02 мг), ехінакозид (3.00 мг), 2'-ацетилактеозид (2,34 мг), актеозид (2,45 мг), ізоактеозид (0,61 мг), цистанозид F ( 2,14 мг), салідрозид (3,39 мг), геніпозидієву кислоту (2,84 мг), аджугол (1,58 мг) і каталпол (2,39 мг) розчиняли в метанолі для приготування основного розчину. Базовий розчин розбавляли метанолом для отримання відповідних концентрацій для робочих стандартних розчинів. Всі приготовлені розчини перед використанням зберігали при 4 градусах.

2.5. Підготовка та групування моделей тварин

Самці щурів SD (180–220 г) були придбані у Liaoning Changsheng Biotechnological Co., номер дозволу на тварин: SCXK (Liao) 2015–0001. Усіх щурів утримували у вільному доступі до їжі та води при температурі 25 градусів і відносній вологості 30–50%. Перед дослідами тварин утримували протягом 7 днів.

Сто щурів випадковим чином розділили на 10 групи: група холостого контролю (BC), група модельного контролю (MC), група позитивного контролю (PC), контрольна група рисового вина (WC), група високої дози CD (CD). -HD), група середньої дози CD (CD-MD), група низької дози CD (CD-LD), група високої дози WCD (WCD-HD), група середньої дози WCD (WCD-MD) та WCD низькодозова група (WCD-LD). Дози CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD і CD-LDThWCD-LD становили 5,48 gTh (кг ∙ d), 2,74 gTh (кг ∙ d) і 1,37 gTh (кг ∙ d) відповідно. Доза для групи ПК становила 1,646 gTh (кг ∙ d), а для групи WC — 1 млTh100 г протягом 40 днів. На 6-й день після введення щурам підшкірно вводили водну суспензію кортикостерону (кортикостерон + 0.1% диметилсульфоксид + 0.1% Твін-80 + 0.9% хлорид натрію), за винятком для групи BC [18]. Концентрація кортикостерону становила 5 гТл, доза 0,1 мл/100 г. Щурам у групі BC вводили фізіологічний розчин + 0.1% диметилсульфоксид + 0.1% Tween- 80 + 0.9% хлорид натрію шляхом ін’єкції в тій самій дозі.

2.6. Визначення функцій осі HPA

2.6.1. Тест на вагу, температуру та силу утримання

Кожні 3 дні проводили вимірювання ваги, кожні 6 днів вимірювали температуру. під час експерименту. На 39-й день вимірювали максимальну силу задньої кінцівки хватаметром. Щурів помістили на гладкі платформи, змушуючи задні кінцівки хапатися за стовп. Щури інстинктивно хапають будь-який предмет, щоб не рухатися назад, коли тягнуть за хвіст, поки сила тяги не перевищить хватку. Коли щур втрачав зчеплення, попередній підсилювач міг автоматично зафіксувати максимальну силу зчеплення.

2.6.2. Визначення рівня Т, CRH, АКТГ, CORT і кортизолу в сироватці крові

Через годину після останнього введення щурам анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції розчину уретану (20 gTh100 мл). Потім відбирали зразки крові, центрифугували при 3500 r протягом 15 хвилин для отримання сироватки та зберігали при -20 градусах. Концентрації T, CRH, ACTH, CORT і кортизолу вимірювали за допомогою наборів ELISA для щурів відповідно до інструкцій виробника.

2.6.3. Спостереження під мікроскопом

Морфологічну структуру тканини надниркових залоз досліджували за допомогою НЕ фарбування. Тканину надниркових залоз фіксували в 10% параформальдегіді, зневоднювали в етанолі, робили прозорою розчином ксилолу, вбудовували звичайними методами, нарізали на шматочки товщиною 4 мкм, депарафінізували розчином ксилолу, гідратували градієнтом етанолу, а потім фарбували гематоксиліном і еозином фарбувальний розчин. Після того, як пластину зробили прозорою за допомогою ксилолу, її запечатали нейтральною смолою та спостерігали під мікроскопом.

2.6.4. Імуногістохімічне фарбування експресії білка Bax, Bcl-2, каспази-3, Fas і FasL у наднирковій залозі

Фіксовані у формаліні залиті парафіном зрізи надниркових залоз щурів депарафінізували та регідратували після розрізання товщиною 4 мкм. Для блокування активності ендогенної пероксидази зрізи попередньо інкубували в блоці пероксиду водню протягом 10 хв. Зрізи занурювали в 0.01 М цитрат (pH 6,0) і нагрівали до кипіння. Процедуру повторюють через 5-10 хв. Після охолодження зрізи промивали PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 рази, залишали при кімнатній температурі приблизно на 5 хв і промивали PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 рази. Додавали 5% блокуючий розчин BSA при кімнатній температурі, а надлишок рідини на зрізі струсили через 20 хвилин. Додавали розведені первинні антитіла, специфічні для FasTh FasL, Bcl-2ThBax і каспази-3 (1:100, розведені PBS), та інкубували при 37 градусах протягом 1 години або 4 градусів протягом ночі. Зрізи промивали 2–3 рази PBS (pH 7,2–7,6). Потім додавали біотинільований козячий антимишачий IgG, зрізи сушили при 20–37 градусах протягом 20 хвилин і промивали PBS (pH 7,2–7,6) 4 рази протягом 5 хвилин. Після ретельного промивання в PBS зрізи інкубували із сумішшю реагентів A і B протягом 30 хвилин, інкубували з PBS протягом 45 хвилин і, нарешті, проявляли субстратом DAB (DAKO) протягом 30 хвилин перед тим, як злегка контрастно фарбували гематоксиліном, зневоднювали, і змонтовано.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПІДСИЛЕННЯ СЕКСУАЛЬНОГО ВІДЧУТТЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Визначення імунних функцій

2.7.1. Розрахунок індексу імунних органів

Через годину після останнього введення щурам анестезували шляхом внутрішньочеревної ін’єкції розчину уретану (20 гТх100 мл), а потім видаляли селезінку та вилочкову залозу та негайно зважували в стерильному ковпаку. Коефіцієнти маси селезінки або тимуса (%) � маса селезінки або тимуса (мг) Маса тіла (г).

2.7.2. Виявлення субнабірів Т-лімфоцитів у периферичній крові

Спленоцити та гемоцити інкубували з моноклональними антитілами анти-CD4 (PE) та анти-CD8 (FITC) протягом 30 хв у темряві. Додавали 2 мл лізату еритроцитів і розчин перемішували за допомогою вортексу. Розчин залишали в темряві на 10 хв і центрифугували 5 хв. Супернатант видаляли, а потім розчин промивали 3 рази охолодженим льодом PBS і ресуспендували в пермеабілізувальному розчині PBS. Принаймні 10 000 клітин аналізували за допомогою проточної цитометрії протягом 1 години після кожного фарбування Mab.

2.7.3. Визначення рівня IL-10, IL-6, IL-2, TNF- та IFN-c у сироватці крові

Через годину після останнього введення щурам анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції розчину уретану (20 гТх100 мл) і брали кров із черевної аорти. Кров центрифугували при 3500 r протягом 15 хвилин для отримання сироватки та зберігали при -20 градусах. Концентрації IL-10, IL-6, IL-2, TNF- та IFN-c були виявлені за допомогою наборів ELISA для щурів відповідно до інструкцій виробника.

2.8. Експресія CaM у тканинах гіпоталамуса та гіпофіза

Тотальну РНК екстрагували з тканин гіпоталамуса та гіпофіза за допомогою TRIzol. Зворотну транскрипцію проводили на 10 мкл загальної РНК згідно з інструкціями виробника. Рівні кількості кДНК аналізували за допомогою кПЦР у присутності барвника, що зв’язує дцДНК (Promega, США) і системи ПЛР у реальному часі CFX 96 (Bio-Rad, США), щоб дослідити різні гени за умов початкової активації в 95 градусів протягом 10 хвилин, 40 циклів денатурації при 95 градусах протягом 15 секунд і подовження відпалу при 60 градусах протягом 1 хвилини.

Праймери для CaM і -актину наведені в таблиці 1, а -актин використовувався як внутрішній контроль. Кожен зразок нормалізували за допомогою різниці в критичних порогових значеннях (Ct) між цільовим геном і -актином. Для опису результату було використано наступне рівняння: ΔΔCt � (цільовий ген Ct − Ct-ген актину) експериментальна група − (цільовий ген Ct − Ct-ген актину) контрольна група. Потім порівнювали рівні мРНК кожного зразка, використовуючи експресію 2- ΔΔCt цільового гена. Результати кожної групи усереднювали (табл. 3).

2.9. Статистичний аналіз

Усі дані аналізували за допомогою програмного забезпечення SPSS (версія 19.0, SPSS Institute Inc., Чикаго, Іллінойс). Відмінності між групами аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу повторних вимірювань (ANOVA). Результати виражали як середнє ± стандартне відхилення (SD) за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 6.0, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Відмінності зі значенням P менше ніж 0.05 вважалися статистично значущими.

3. Результати експерименту

3.1. Аналіз UPLC-QqQ-MS

Щоб досягти найкращого розділення, форми піку та короткого часу аналізу, у нашому попередньому експерименті були вивчені хроматографічні умови, включаючи колонку, рухому фазу та програму градієнта. Типові хроматограми з режимом MRM представлені на рисунку 1.

З таблиці 4 видно, що вміст фенілетаноїдних глікозидів у WCD збільшився порівняно з CD, особливо ехінакозиду та актеозиду, тоді як вміст іридоїдів у WCD зменшився.

3.2. Регламент для функції осі HPA

3.2.1. Тест на вагу, температуру та силу утримання

У щурів групи MC та експериментальних груп симптоми ниркової недостатності поступово виявлялися після введення кортикостерону. Симптоми, такі як втрата ваги, гіпотермія, втрата блиску волосся, втрата духу, затримка реакції та значне зниження споживання води та активності, значно покращилися в групах CD та WCD. На малюнку 2(a) показано зміни ваги. Вага кожної з груп препаратів збільшилася, особливо в групах CDHD та WCD-HD. Приріст ваги в групі МС був найнижчим. На малюнку 2(b) показано зміни температури, які були найнижчими в групі MC, а температура підвищилася в групах WCD-HD, WCD-MD і WCD-LD.

На малюнку 2(c) показано, що сила утримування зросла для групи BC та кожної з експериментальних груп, а група WCD-MD була найвищою, що продемонструвало, що ознаки слабкості, спричинені дефіцитом нирок-ян, покращилися після введення.

3.2.2. Рівні T, CRH, ACTH, CORT і кортизолу

На рисунку 3 показано, що порівняно з групою BC рівень T, CRH, ACTH і CORT у сироватці крові щурів знизився (P < 0.01), а рівень кортизолу знизився (P < 0.05) у групі MC. Порівняно з групою MC рівень T у групах WCD-HD та WCD-MD підвищився (P < 0.01), рівень CRH у WCD-LD, Групи WCD-MD та WC покращилися (P <{24}}.01), вміст АКТГ збільшився в групах CD-HD, WCD-MD та WCD-HD (P <0,01), рівень CORT підвищився в групах У групах CD-MD, WCD-MD і WCD-HD (P <0,01) і посилено в групах CDHD і WCD-LD (P <0,05), а рівень кортизолу підвищився в кожній із груп препаратів.

3.2.3. Результати спостереження під мікроскопом

Тканини надниркових залоз можна розділити на корковий шар і мозковий шар. Кортикальні шари включають кулястий, пучковий і сітчастий шари. Клітини містять більше ліпідів, а мозковий шар складається переважно з клітин феохромоцитоми та невеликої кількості фіброзної тканини. Як показано на малюнку 4, ми виявили, що в групі BC все було нормально, тоді як у групі MC кора надниркових залоз мала очевидну гіперплазію, клітинну атрофію та збільшення щільності. Цибулинна смужка потовщилася, а прозора пучкова зона, вузька сітчаста зона та дрібніші клітини показали нерівномірне забарвлення та капілярну конгестию. У групі ПК було видно кортикальні та медулярні межі. Клітини кулястої та пучкової смуг розташовувалися рівномірно, морфологічна структура відновлювалася. Таке ж краще відновлення спостерігалося в групах WCD, а ефекти в групі WCD-MD були кращими, ніж у групах WCD-HD і WCD-LD. Морфологія надниркової залози в групах CD була не такою хорошою, як у групах WCD.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%