Нано-молочні білково-слизові комплекси: характеристика і протипухлинний ефект Частина 2

За додатковою інформацією звертайтесяtina.xiang@wecistanche.com

Клацніть посилання, щоб дізнатися частину 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Матеріали і методи

3.1. Матеріали

Лушпиння Plantago ovata (subgoal) і дозрівають плоди Ziziphus Spina-Christi (Nabeq) були придбані у Гізи, Єгипет; концентрат молочного білка (МП,81,3% білка) був придбаний у компанії Fonterra (Окленд, Нова Зеландія). Казеїнові і сироваткові білки в ГДК в значній мірі знаходяться в їх рідній і схожій, міцелярної, формі з тими, що містяться в молоці. Всі використовувані хімічні речовини були аналітичної чистоти.

3.2.Приготування слизу ізабгольської лушпиння (IHM) та слизу Набега (NabM)

Слиз лушпиння Ізабгола (IHM) і слиз Набек (NabM) були приготовлені за методом, описаним Ель-Максудом та ін [5]. Коротко приготували суспензію ізабгольской лушпиння шляхом розчинення 1,2 г в 100 мл дистильованої води і очищеної розчином ацетону. Отриманий гель зберігався в холодильнику (4-5°C) до використання.

Для NabM дозрілі плоди Набека ретельно промивали водопровідною водою, щоб видалити бруд. Свіжі плоди відокремлювали від насіння і змішували з дистильованою водою в співвідношенні 1:10(ж/в) після розрізання на невеликі шматочки. Суміш змішали за допомогою лабораторного блендера(Toshiba Mixie, Японія) і дали постояти 12 год в холодильнику.

Потім слизовий екстракт центрифугували при 2000 об / хв протягом 30 хвилин і фільтрували через муслінову тканину. Отриману в'язку розчинну слиз випали в осад ацетоном. Отримана сира слиз зберігалася в холодильнику до використання.

В аналітичних цілях слиз сушили в повітряній печі при 40°Канд-землі за допомогою кульового млина MM400 (Retsch, Німеччина). Виміряно хімічний склад порошку слизу лушпиння псиллію (PHMP) та слизистого порошку Nabeq (NabMP). Вологість, білок, жир, зола, сира клітковина та загальний вміст вуглеводів становили 8,49, 0,34,0,21,2,13,13,1,53 та87,44% для PHMP та 9,18,4,72,2,05,2,69,1,70,та78,26% для NabMP відповідно. Отриманий порошок зберігали при прохолодній температурі (4-5°С) до подальшого аналізу.

Натисніть, щоб дізнатися більше інформації

3.3. Приготування білково-слизових комплексів молока (МПМК)

Комплекси молочного білка (МП) з IHM і NabM готувалися за морром та ін.з деякими модифікаціями [44]. Концентрат молочного білка був відновлений в дистильованій воді (10%). Отриманий колоїд молочного білка був змішаний з IHM і NabM в співвідношенні 1:3 (о/о). РН суміші відрегулювали до 10 і залишали стояти на 10 хв. Після цього рН знизили до 3,5 за допомогою 0,1 Н НКл і залишили ще на 10 хв. Потім рН був відрегульований до рН 4,6 за допомогою 0,5 М NaOH для збору фільтрації MPMCby на фільтрувальному папері: MP, а також отриманий MPMC були висушені шляхом ліофілізації при -45°CC протягом 24 годин за допомогою ліофілізатора Novalyphe-NL500, Savant Instruments, Holbrook, NY, США.

3.4. Фізико-хімічні та функціональні характеристики

вимірювання 3.4.1.pH

РН отриманих продуктів при 10% розчині вимірювали за допомогою каліброваного рН-метра (HANNA, HI 902 м, Німеччина).

3.4.2.Визначення об'ємної щільності (BD), щільності прослуховування (TD) та індексу Карра

Порошок МПМК насипали в мірний циліндр об'ємом 50 мл об'ємом до 25 мл, що відповідає невикористаному об'єму, а потім 5-10 разів постукували, поки не було відзначено подальшої зміни обсягу порошку, що відповідає прослуханому об'єму.

Об'ємна щільність, щільність, що прослуховується, і індекс Карра визначалися за допомогою наступних рівнянь [45]:

(1) BD = маса/ невикористаний об'єм

(2) TD = маса/прослуханий об'єм

(3) Індекс Карра (%)= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Індекс водопоглинання (WAI) та індекс розчинності води (WSD)

Розчинність води і показники водопоглинання МП і МПМК досліджувалися за методикою, описаної Ягком і Гогусом з деякими модифікаціями [46]. Зразки(0,5 г) диспергувалися в дистильованій воді об'ємом 10 мл при 25°Цині в центрифужній трубці. Простоявши 30 хв, з інверсією труб кожні 5 хвилин, зразки центрифугували зі швидкістю 3500 об/хв протягом 15 хв. Фільтрат був перенесений на алюмінієву пластину і висушений протягом 3 годин при температурі 105 °C. Була зафіксована вага гелю, що залишився, і WSI і WAI були визначені наступним чином:

(4) WAI(г/г)= Збільшення маси гелю/Суха вага зразка

(5) WSI%= Вага сухих сухих сухих речовин у супернатанті ×100/Суха маса зразка

3.4.4. Засвоюваність молочного білка

Засвоюваність білка визначалася за Абд Ель-Гані та ін [47]. Коротко проби МП і МПМК були дисперговані в дистильованій воді в концентрації 6,38 мг/мл, а рН відрегулювали до 8,0. Один мілілітр свіжоприготованого ферментного фондового розчину (1,6 мг/мл трипсину, 3,1 мг/мл хімотрипсину та 1,3 мг/мл ЕР амінопептидази1

(ERAP1)змішувався з білковою суспензією при 37°C. РН був зафіксований через 10 хв, а активність ферментів визначалася за допомогою казеїну в якості еталона. Для розрахунку засвоюваності білка було використано наступне рівняння [47]:

(6)% Засвоюваність = 210,46-18,10 (рН)

3.5.Фенольні фракції ПГМ і НабМ

Фенольні сполуки зразків слизу за допомогою hplc-аналізу проводилися за протоколом, описаним Elsayed et al. [48]. Коротко екстракт слизу був проаналізований за допомогою системи HPLC серії Agilent 1260 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, Каліфорнія, США). Поділ проходили за допомогою колони С18 (100 мм×4,6 мм і.д.,5 ум). Рухома фаза містила (А) воду 0,2% Н3ПО4, (В) метанол і (С) ацетонітрил при витраті 0,6 мл/хв. Градієнтний елют був за наступною схемою: 0-11 хв (96%А., 2% В);11-13 хв (50% А,25%Б);13-17хв (40% А,30%Б);17-20,5 хв (50%Б,50%С);і 20,5-30 хв (96% А,2% Б). Довжина хвилі виявлення (УФ-детектора,284 нм) була встановлена на рівні 284 нм. Розмір ін'єкції становив 20 мкл, а температура колонки підтримувалася на рівні 30°C. З'єднання були відомі, порівнюючи час їх утримання з часом автентичних стандартів. Для оцінки складених величин використовувалися калібрувальні криві.

3.6.Загальний вміст фенолу та флавоноїдів у МП ТА МПМК

Вміст поліфенолів визначалося методом Фоліна-Чіокалтеу з деякими модифікаціями [5]. Коротко,2,8 мл мілі-Qwater, що містить 10 мг МП або MPMC, були змішані з 2 мл 2% карбонату натрію і 0,1 мл 50% реактиву Folin-Ciocalteau. Після 30 хв інкубації при кімнатній температурі поглинання реакційної суміші вимірювали на рівні 750 нм проти деіонізованої води у вигляді заготовки за допомогою спектрофотометра (Hitachi, Model 100-20). Галова кислота (GA) використовувалася як стандартна фенольна сполука, і була побудована стандартна крива семи точок (0-200 мг/л). Результати були виражені у вигляді міліграмових еквівалентів галової кислоти на грам білка (GAE/g).

флавоноїдивміст визначався за допомогою хлоридно-алюмінієвого методу, як це раніше описувалося Abedelmaksoud et al. з деякими модифікаціями [5]. Коротко,2,8 мл мілі-Q води, що містить 10 мг МП або МПМК, змішували з 0,1 мл 10% гексагідрату хлориду алюмінію і 0,1 мл 1 М ацетату калію. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 40 хв абсорбція реакційної суміші вимірювалася в 415 нм проти деіонізованої води в якості заготовки. Кверцетин використовувався як стандарт з використанням стандартної кривої семи точок (0-50 мг/л). Загальний вміст флавоноїдів виражався у вигляді міліграмових еквівалентів кверцетину (QE/g).

3.7. Антиоксидантна активність МП та МПМК

Загальна здатність до падкування вільних радикалів МП і МПМК оцінювалася за допомогою трьох різних антиоксидантних аналізів: стабільних 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразил(DPPH), Азино-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонова кислота (ABTS) і радикалів гідроксилу радикала (HS), як раніше описував El-Maksoud et al. [5].

3.8. Амінокислотний профіль МП і МПМК

Зразки білка були гідролізовані кислотою з використанням 6 N HCl відповідно до Peksa et al. [49. Автоматизований амінокислотний аналізатор (AAA 400, INGOs Ltd.) використовувався для визначення амінокислот.

3.9. Реологічні властивості

Зразки були підготовлені так, як описав Барнс [50], з деякими модифікаціями. В'язкість 2,5%(ш/ш)розчину при рН7 визначалася при 25±1°C за допомогою віскометра Брукфілда (DV-II+ Pro, Rheocalc Software, Німеччина). Напруга (σ)і в'язкість (n) були нанесені як функція швидкості зсуву. Було розраховано індекс узгодженості(K) та індекс поведінки потоку (n) моделі степеневого закону:

Значення n дорівнює 1 для ньютонівських рідин і варіюється від 0 до 1 для рідин, які розріджують зсув і перевищують 1 для зсувно-згущувальних рідин [51].

3.10.Диференціальна скануюча калориметрія (ДСК)

Теплові властивості МП і МПМК вимірювалися за допомогою диференціального скануючого калориметра (PerkinElmer, США). Зразки(4-6 мг) поміщали в алюмінієву пластину і герметизували. Потім кожну каструлю нагрівали до 350°С з потоком сухого газу азоту при 20 мл хв-І при швидкості нагрівання 10°С хв-1. З ендотермічного піку термограми DSC оцінювалася температура початку денатурації, максимальна температура переходу і точка деградації [52]. Було визначено значення перехідної ентальпії (АГ) з області під ендотермічним піком на кривій DSC, а в якості еталона використовувався порожній алюмінієвий піддон.

3.11. Інфрачервона спектроскопія фур'є-трансформування (FTIR)

Інфрачервоні спектри від 600 до 3500 см-I вимірювалися при 25 °Cusing спектрофотометр FTIR (QFA Flex, США) за допомогою ослабленого методу повного відображення з використанням роздільної здатності 4 см-I і отримання 10 сканувань в секунду.

3.12. Трансмісійна електронна мікроскопія

Мікроструктура МП і МПМК була візуалізована за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа (JEOL, JEM 1400 Flash, Японія) на 80 кВ. Застосовано кріо-стадію при методі негативного фарбування [53].

3.13.Біологічні дослідження на МП та МПМК

3.13.1.In Протипухлинна активність Vitro

Всі клітинні лінії, використані в цьому експерименті, були отримані з Американської колекції культури типу (ATCC, Manassas, VA, США). У цьому аналізі були використані дві ракові клітинні лінії людини: аденокарцинома молочної залози (MCF-7, ATCCHTB-22TM) і гепатоцелюлярна карцинома (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Для порівняння також були протестовані неракові лінії фібробластів шкіри BJ-1(ATCC(8) CRL-2522TM) та епітеліальна молочна залоза MCF-12F (ATCC CRL-10782TM). Клітинні лінії були вирощені в модифікованому середовищі Орла Дульбекко (DMEM/висока глюкоза, HyCloneTM, США), доповненому 10% сироваткою великої рогатої худоби плода (FBS, Gibco, Бразилія), 100 U/mL пеніциліном, 100 уг/мл стрептоміцином та 25 нг/мл амфотерицину B(Sigma, Oakville, ON, Canada) та культивованим при 37°C з 5%CO, у зволоженому інкубаторі. Культурне середовище через день замінювали свіжим середовищем. Коли клітини досягли 70% впадання, їх від'єднали, використовуючи 0,25% трипсин-EDTA(1X) Гібко, Канада, і перевели в нову культурну колбу. Після другого проходу клітини були трипсинізовані і пластинчасті в 96-лунковій пластині в концентрації 2×10* клітин/свердловини. Після 24 год інкубації середовище зціджували, а клітини двічі промивали ПБС, а потім обробляли 200 мкл культурального середовища, що містить різну концентрацію зразків білка (1, 5,10 і 20 уг/мл). Доксорубіцин HCl(4 уг/мл) використовувався як позитивний контроль, тоді як клітини, оброблені необтяженим середовищем, бралися за негативний контроль. Пластини інкубували при 37°КК протягом 24 год іпротиракові засоби,активність зразків була визначена за допомогою нейтрального аналізу червоного поглинання згідно з Repetto et al. [54]. Коротко, після інкубаційного періоду, середовище замінили на 150 ул нейтрального червоного барвника(100 мг/мл), розчиненого в середовищі без сироватки, а клітини інкубували при 37°КК протягом 3 год. Далі клітини промивали ПБС, а також додавали 150 мкл елюціонного середовища (EtOH/AcCOOH,50∶1) з подальшим м'яким струшуванням протягом 10 хв для забезпечення повного розчинення. Абсорбція вимірювалася на рівні 540 нм за допомогою зчитувача пластин мікротріатора (BioTek,96 Well Plates, ELX808, США).

де Ac - поглинання контролю, а As - поглинання зразка. Відсоток загибелі клітин, представлений як цитотоксичність(%), і концентрація, яка вбиває 50% клітин (IC50), була розрахована для кожного зразка.

3.13.2.Визначення рівня білків p53, Bax, Caspase-3 та Bcl-2

Клітинні рівні ключових маркерів білка апоптозу були визначені після 24 годин після лікування ІКСО МП і МПМК. Коротко, клітини Hep G-2, MCF-7, Bj-1 та MCF-12F були засіяні по 5× 10* клітин/свердловини в 6-лункових пластинах. Після 24 год інкубації зі зразками при 37 °C клітини збиралися і лізувалися, а потім центрифугувалися при 10 000 об/хв протягом 20 хв при 4°C. Концентрація білка була кількісно визначена в супернатанті за допомогою Бредфордського аналізу [55]. Активність Caspase-3 аналізувалася за допомогою колориметричного пробірного набору (Abcam, ab39401)згідно з інструкцією виробника [56]. Коротко кажучи, до 50 ул субстрату каспази було додано 10 мг білка, а кінцевий об'єм відрегулювався до 200 мкл за допомогою реакційного буфера при 37 °C, а суміш інкубували протягом 1 год у темряві з подальшим вимірюванням концентрації каспази-3 при 405 нм.

Рівень проапоптотичного маркера p53, асоційованого X(Bax) та антиапоптотичного маркера В-клітинної лімфоми-2(Bcl-2) були визначені в лізаті клітин за допомогою імуноферментного аналізу Assay Simple Step ELISA відповідно до інструкцій виробника (ab207225, ab119506 та ab199080; Abcam, США), відповідно [57,58].

3.13.3.Пошкодження ДНК, індуковане захистом від окисного стресу

Аналіз пошкодження ДНК був проведений, як раніше описував Леба та ін [59] з невеликою модифікацією. Коротко,3 мкл інгібітора рибонуклеази плазміди RNH1(NM_203387)Людський мічений клон ORF 10 мкг/мкл були змішані з реагентом Фентона (5 мМ Н2О2 і 0,3 мМ FeSO4 і 0,6 мМ ЕДТА), а кінцевий об'єм відрегулювався до 25 мкл за допомогою фосфатного буфера (H2POA, 8,3 мМ, рН 7,4). Потім розчин інкубували протягом 20 хв при температурі 37°C. Для оцінки антиоксидантної захисної здатності МП та МПМК від пошкодження ДНК, індукованих реагентом Фентона, перед інкубацією було додано 5 мкг/мл МП/НабМ, МП/ІХМ та МП. ДНК плазміди RNH1 (3 мкл, 10 мкг/мкл) використовувалася як контроль захисту ДНК.

3.13.4 Аналіз геномного пошкодження ДНК на основі ПЛР

Ген Homo sapiens methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) посилювався за допомогою ПЛР з геномної крові, раніше витягнутої зі здорових зразків крові за допомогою стандартного набору для екстракції ДНК [60]. ДНК інкубували протягом 10 хвилин реагентом Фентона або без нього, доповненим MP або MPMC. Фрагмент 198-bp був посилений за допомогою форвардних 5'-TGAAGGAAGGTGTCTGCGGGA-3' і зворотних 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTGTG-3'primers. Використовуючи 50 нг пролікованої ДНК, ПЛР-підсилення проводилося після наступного термоциклера (94 °C протягом 5 хв, потім 25 циклів денатурації, 30-х при 94°C; відпал, 30-х при 60°C; і розширення,30 с при 72°C) протягом 25 циклів і 1 заключного циклу розширення при 72°C протягом 5 хв. Зразки ПЛР-реакції були застосовані для електрофорезу агарозного гелю (2%).

3.13.5. Профілювання експресії генів методом RT-qPCR

Проведено аналіз експресії генів ключових про- та антиапоптотичних маркерних генів з клітинами HepG-2, MCF-7, Bj-1 та MCF-12F, підданими впливу отриманих даних IC50 (таблиця 3) за 72 год. Коротко, загальна РНК була витягнута за допомогою загального набору для очищення РНК (QIAGEN., Thorold, ON, Канада) згідно з інструкцією виробника. cDNA

синтез здійснювався так, як раніше описував Абул-Саунд та ін [61]. Програми підсилення та специфічність Амплікону ПЛР були виконані та оцінені за допомогою теплового циклера Rotor-Gene O 5-Plex HRM (Qiagen, Німеччина) з Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Німеччина), як це було раніше задокументовано за стандартними протоколами [61]. Використовувалися такі праймери: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer Assay (QT00023947); В-клітинна лімфома 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011); Bcl-2-подібний білок Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00031192); і ген 18S rDNA house-keeping (HK) Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). Плр-програма теплового циклування та аналіз експресії генів для визначення зміни складки відносно гена 18S були по суті виконані, як повідомлялося раніше [61].

3.14.Статистичний аналіз

Отримані результати виражалися як середнє ± стандартного відхилення. Статистика була досягнута за допомогою SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, США). Багаторазовий тест Дункана використовувався для визначення істотних відмінностей між усіма зразками, а відмінності вважалися значними при р<>

4. Висновки

На закінчення, це дослідження показало, що змішування молочного білка зполісахаридичерез диференціацію розчину рН є підходящою методикою для комплексоутворення. Отримані в результаті комплекси слизової молочного білка (МПМК) мають значно вищі фенольні іфлавоноїди,вміст, ніж молочний білок (МП). Результати DSC показали, що комплексоутворення МП полісахаридами значно підвищило теплову стійкість зі зміщенням температури денатурації. Були проведені аналізи FTIR для виявлення функціональних груп, досліджено поведінку потоку підготовлених комплексів. WSI і WAI молочного білка були збільшені за рахунок комплексоутворення з NabM або IHM. ТЕМ використовувався для візуалізації мікроструктури підготовлених комплексів. З іншого боку, очікується, що отримані молочні білкові комплекси зі слизом ізабгольського лушпиння (HM) або mucilage Nabeq (NabM) перевершать нативні молочні білки за антиоксидантним і протипухлинним ефектом. Таким чином, MPMC виявляв унікальні протипухлинні властивості проти модельного раку молочної залози та клітинних ліній печінкової карциноми (MCF7 та HEPG2 відповідно), що доведено нейтральним аналізом червоного поглинання.

MPMC покращив обидваАнтиоксидантта антирозповсюджувальна активність. Каспази є ключовими білками-регуляторами, які причетні до індукції апоптозу. Апрегуляція транскриптів білка каспази 3 і мРНК (рис. 9А, В) контролюють інші білки на шляху апоптозу, який характеризується колапсом мітохондріальної мембрани з вивільненням цитохрому, індукованого Баксом, і активацією каспази 9, що веде до подальшого залучення каспази 3. Ап-регуляція Casp3, p53 і Bax разом зі зменшенням експресії Bcl-2 виявила, що MPMCinduced apoptosis індукція, де апрегуляція p53 буде стимулювати експресію Bax, що, в свою чергу, буде викликати вивільнення цитохрому c з подальшою активацією каспази-9 і-3. Більш того, відомо, що Bcl-2 інгібує вивільнення цитохрому с. У нашому дослідженні було показано, що зниження регуляції Bcl-2, викликаної MPMC, полегшує неопукціоноване вивільнення цитохрому c, викликане Bax, і подальший апоптоз.

Протипухлинний ефект білково-полісахаридних комплексів забезпечує подальше просвітлення щодо застосовності цих комплексів, які будуть використовуватися при розробці доступних та ефективних методів лікування раку з мінімальними побічними ефектами.