Багатокомпонентні режими вакцинації проти Chlamydia Trachomatis з прайм-бустером індукують відповіді антитіл і Т-клітин і прискорюють очищення від інфекції в моделі приматів, відмінних від людини Ⅱ

Матеріали та методи

Вакцинні антигени та ад'юванти

У цьому дослідженні використовувалися різні вакцинні антигени та ад’юванти: вакцинний антиген CTH522 на основі MOMP (11) вводили внутрішньом’язово (ВМ) з ад’ювантом CAF01 (42) або гідроксидом алюмінію (AlOH) або інтраназальним шляхом ( В) без ад'юванта. Плазмідна ДНК-вакцина, pcDNA3.1-MOMP, була отримана шляхом клонування консенсусного MOMP у плазмідний вектор pcDNA3.1 (14) та введена внутрішньошкірним (ID) шляхом з електропорацією (EP) у спину. Рекомбінантна вакцина проти аденовірусу людини серотипу 5 (rHuAd5), що експресує MOMP (HuAd5-MOMP), була виготовлена ​​шляхом гомологічної рекомбінації консенсусного MOMP (AAC45154.1) у вектор pAL1112 плазміди HuAd5 з делецією E1 і E2 і введена внутрішньом’язово (14). . Модифікована вакцина коров’ячої віспи Ankara-MOMP виробництварекомбінуючий консенсус MOMP(AAC45154.1) у плазміду p3186 і аттенуйований вектор MVA (14) і вводити черезвнутрішньом'язовий шлях.

Натисніть тут, щоб отримати протизапальний засіб Cistanche

C. trachomatis серовар D запас

Серовар D Chlamydia trachomatis (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) було отримано з Американської колекції типових культур (ATCC, Манассас, Вірджинія) і розмножено в HeLa{ {2}} клітини, зібрані та очищені, як описано Caldwell et al. (43). Запас C. trachomatis SvD зберігали при -80 градусі в 0,2 М сахарозі, 20 мМ фосфату натрію (pH 7,4) і 5 мМ глутамінової кислоти (SPG), а концентрацію одиниць, що утворюють включення (IFU), визначали в клітини HeLa-229 і клітини Маккоя.

Нелюдиноподібні примати

Тридцять макак cynomolgus (Macaca fascicularis) вагою від 3 до 5 кг були включені в дослідження, проведене в установах NHP рівня біобезпеки 3 (ABSL3) IDMIT («Моделі інфекційних захворювань та інноваційні методи лікування» в CEA «Commissariat à l'Energie Atomique,» Фонтеней-о-Роз, Франція; номер акредитації D92- 032-02). Протоколи були схвалені інституційним етичним комітетом «Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives» (CEtEA №44) під номером A14-026. Дослідження було дозволено «Міністерством досліджень, інновацій та освіти» під реєстраційним номером APAFIS#720-201505281237660. Усі тварини перед дослідженням отримали негативний результат на SIV, SHIV, STLV (мавлячий Tlymphotropic virus), вірус герпесу B, філовірус, SRV-1, SRV-2 і підтвердили серонегативність на хламідійну інфекцію. Усі експериментальні процедури проводились відповідно до європейських рекомендацій щодо догляду за тваринами ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", директива 2010/63/UE, 22 вересня 2010 р.).

Протоколи щеплень

30 макак були випадковим чином розділені на 6 груп по 5 тварин у кожній. Різні режими первинної вакцинації для 6 груп детально проілюстровано на малюнку 1. Під час усіх вакцинацій макак вводили седацію кетаміну хлоргідратом (10 мг/кг маси тіла внутрішньом’язово). CTH522 (85 мкг на тварину) вводили внутрішньом’язово (ВМ) з ад’ювантом CAF{{20}}1 (625 мкг/125 мкг) або ад’ювантом AlOH (0,425 мг). ), як показано на Фігурі 1. Внутрішньом’язову імунізацію проводили об’ємом 0,6 мл у праве стегно (М. quadriceps) тварини. Інтраназальну (IN) імунізацію CTH522 (30 мкг на тварину) проводили за допомогою пристрою Vaxinator, з’єднаного зі шприцом на 1 мл, з двома послідовними введеннями по 0,25 мл, по одному в кожну ніздрю. Вакцину DNA-MOMP вводили внутрішньошкірно (ID) шляхом електропорації (EP) у шкіру спини. 6 повторних об’ємів по 0,1 мл було введено ID (загалом 1 мг) з подальшим ЕР за допомогою системи Nepagen™ (налаштування: 6 квадратних імпульсів по 10 мс з інтервалами 90 мс при 110 В, (300- 700 мА)) . Вакцину hAd5-MOMP вводили внутрішньом’язово з дозою 1011 вірусних частинок в 1 мл на тварину. Вакцину MVA-MOMP вводили внутрішньом’язово в дозі 4*108 БІО на тварину в об’ємі 0,5 мл**. Групі, яка раніше не отримувала щеплення, вважали контрольною групою.

Колекція зразків

Під час усіх процедур відбору проб макак заспокоювали хлоргідратом кетаміну (10 мг/кг маси тіла внутрішньом’язово). Кров збирали за допомогою стегнової венепункції на тижнях 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Цервіко-вагінальну рідину для виявлення антитіл збирали за допомогою Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL). , США) на тижнях 4, 8, 16, 18, 20, 22 і 24. Зразки шийно-вагінального відділу для виявлення хламідійного навантаження збирали звичайними тампонами з плоским замком (Mast Diagnostic - ref.: 552C/10). Після контакту зі слизовою піхви та шийки матки тампон помістили у флакон із середовищем UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) і зберігали на льоду.

Вагінальна провокаційна інфекція 5*107 IFU C. trachomatis SvD

Тварин вводили седацію кетаміну хлоргідратом (10 мг/кг внутрішньом’язово), клали в вентральне положення з піднятими стегнами та травматично наносили 1 мл інокулята безпосередньо на слизову оболонку піхви на переході між піхвою та шийкою матки за допомогою шприца на 1 мл. Кожній тварині давали дозу 5*107 IFU. Тварині дозволяли залишатися у вентральному лежачому положенні з піднятими стегнами протягом короткого часу після інокуляції.

Імуноферментний аналіз

CTH522специфічні антитілау зразках сироватки крові та мазків були виявлені непрямим ІФА. Планшети Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Данія) покривали CTH522 (0,5 мкг/мл) протягом ночі при 4 градусах. Ізотипи IgG та IgA були виявлені за допомогою HRP-кон’югованих антитіл, специфічних проти IgG приматів (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75.{{10) }}) та IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, США, 1:50.000). Реакції візуалізували за допомогою субстрату TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Данія) і зупиняли 0,5 М сірчаною кислотою. Планшети зчитували на рідері ELISA при 450 нм з корекцією при 650 нм. Позитивний контроль (сироватка з попереднього дослідження) використовувався як внутрішній стандарт для корекції варіацій між чашками. Дві лунки проводили без субстрату як негативний контроль на кожному планшеті. Титри антитіл розраховували як величину, зворотну найбільшому розведенню зі значенням оптичної густини (OD), вищим за порогове значення. Відсікання визначали за середнім значенням вибірки в день 0 плюс 2*SD.

Пептидний масив і аналіз

Пептидний масив CTH522 був розроблений з трьох екземплярів іммобілізованих 15-мерних пептидів, що перекриваються 14 амінокислотами, які були надруковані на функціональних предметних стеклах та інкубовані із зразками сироватки JPT Peptide Technologies, Берлін. Коротко кажучи, масив інкубували із зразками сироватки, зібраними на 24-му тижні, і пептидні комплекси IgG візуалізували за допомогою біотинільованого козячого антимавпячого IgG і стрептавідину Alexa Fluor® 647. Слайди сканували за допомогою сканера з високою роздільною здатністю при 635 нм і дані повідомляли як довільні одиниці флуоресценції. Середнє значення потрійних значень було визначено, якщо коефіцієнт варіації був більшим за 0.5, використовувалися лише 2 найближчих значення. 10 відсотків сигналу максимальної інтенсивності (65 535) використовувалися як межа дляпозитивна відповідь, а середнім сигналам нижче цього порогу було присвоєно значення, що відповідає половині порогового значення (3277).

Тест нейтралізації in vitro

Аналіз нейтралізації in vitro проводився для перевірки здатності сироваткових антитіл, індукованих вакциною, нейтралізувати хламідійну інфекцію клітин HaK in vitro. Аналіз в основному дотримувався протоколу, описаного раніше (44). Спочатку зразки сироватки окремих тварин інкубували при 56 градусах протягом 30 хвилин для інактивації комплементу. Запас хламідій (SvD, SvE та SvF) змішували та інкубували з серійними розведеннями інактивованої сироватки від кожної з вакцинованих тварин протягом 30 хвилин, а потім інокулював на моношар клітин HaK у 96-планшетах з плоским дном у лунках у дублікатів. Після 30 годин інкубації клітини та включення фіксували та візуалізували за допомогою поліклональної кролячої сироватки проти Ct043 і вторинного антитіла, міченого флуоресценцією (Alexa Flour 488, козячий антикролячий IgG, A11008, Life Technologies) у розведенні 1:500 . Підрахунок включень проводили вручну в 20 полях зору при 40-кратному збільшенні (інвертований флуоресцентний мікроскоп Olympus IX71). Нейтралізацію розраховували як відсоткове зменшення середньої кількості IFU порівняно з пулом сироваток тварин контрольної групи (наївних).

Фарбування внутрішньоклітинних цитокінів PBMC та аналогічна цитометрія

РВМС виділяли та ({{0}} x 106) ресуспендували в 150 мкл повного середовища, що містить 0,2 мкг кожного костимулюючого антитіла CD28 і CD49b. Стимуляцію проводили в 96 лунках/планшетах з використанням 2 мкМ кожного пулу пептидів або SEB (як позитивний контроль) або окремого середовища (як негативний контроль). Брефелдин А додавали до кожної лунки в кінцевій концентрації 10 мкг/мл і планшет інкубували при 37°C, 5% CO2 протягом ночі. Потім клітини промивали, фарбували життєздатним барвником (фіолетовий, флуоресцентний реактивний барвник, Invitrogen), фіксували та пермеабілізували за допомогою реагенту BD Cytofifix/Cytoperm. Зразки пермеабілізованих клітин потім зберігали при -80° перед процедурою фарбування. Фарбування антитіл проводили в один етап після пермеабілізації. Всі вживаніантитіланаведені в таблиці 1. Після 30 хв інкубації на льоду в темряві клітини промивали буфером BD Perm/Wash. Клітини підраховували за допомогою LSR II (BD) одразу після процедури фарбування, а для аналізу даних використовували програмне забезпечення FlowJo.

ТАБЛИЦЯ 1. Антитіла, що використовуються для фарбування маркерів імунних клітин і внутрішньоклітинних цитокінів

Виявлення вагінальної хламідійної ДНК методом якісної ПЛР

Аналіз Abbott RealTime CT/NG (ABBOTT, Rungis, France) — це аналіз полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) in vitro для прямого якісного виявлення плазмідної ДНК для геномів CT (C.trachomatis) і NG (N. gonorrhoeae). . Нуклеїнову кислоту екстрагували із зразків UTM (універсального транспортного середовища) на M2000SP, а ампліфікацію проводили на M2000SP відповідно до інструкцій виробника. Результати виражали як порогове значення циклу (Ct).

Статистичний аналіз

Усю статистику проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (версія 8.1.2). Ненормально розподілені дані були проаналізовані за допомогою непараметричних тестів; Критерій Крускала–Уолліса та тести множинного порівняння Данна для визначення значущості різниці між групами. Криві, що показують відсоток ПЛР-негативних тварин, порівнювали зі статистичним тестом логарифмічного рангу (Mantel-Cox). Порівняння вважалися статистично значущими, якщо значення P < 0.05 (P < 0.05). Подальші рівні значущості позначені зірочками *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Заява про наявність даних

Оригінальний внесок, представлений у дослідженні, включено до статті/додаткового матеріалу. Подальші запити можна направляти відповідному автору.

Декларація етики

Дослідження на тваринах було розглянуто та схвалено «Comité d'Ethique en Experimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives» (CEtEA №44) під номером заяви A14-026. Дослідження було дозволено «Міністерством досліджень, інновацій та освіти» під реєстраційним номером APAFIS#720-201505281237660.

Авторські внески

Задумані та розроблені експерименти: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Виконав досліди: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Випускаються вакцини та антигенні конструкції: ІР, ПМ, АО. Проаналізовано дані: JD, EL, FF, IR, HJ. Склав та відредагував статтю: JD, EL, FF. Кожен із перелічених співавторів зробив значний внесок у роботу шляхом розробки та розробки концепції та/або збору, аналізу та інтерпретації даних. Усі автори долучилися до статті та схвалили подану версію.

Подяки

Ми дякуємо Fondation Dormeur, Вадуц, за пожертву підрозділу Viral Evolution and Transmission Unit лабораторних інструментів, які стосуються цього проекту.

Конфлікт інтересів FF, IR, PA та AWO є співавторами патентної заявки на вакцини проти хламідіозу [WO2014146663A1]. Усі права були передані Statens Serum Institut, датській некомерційній державній установі. Решта авторів заявляють, що дослідження проводилося за відсутності будь-яких комерційних або фінансових відносин, які можна було б витлумачити як потенційний конфлікт інтересів.

Примітка видавця. Усі претензії, викладені в цій статті, належать виключно авторам і не обов’язково відображають претензії їхніх афілійованих організацій чи видавця, редакторів і рецензентів. Будь-який продукт, який може бути оцінений у цій статті, або претензії, які може зробити його виробник, не гарантуються та не схвалені видавцем.

Список літератури

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N та ін. Глобальні оцінки поширеності та захворюваності на чотири виліковні інфекції, що передаються статевим шляхом, у 2012 році на основі систематичного огляду та глобальної звітності. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Лонгботтом Д., Култер Л.Ж. Хламідіози тварин і зоонозні наслідки. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Хаггерті К.Л., Готліб С.Л., Тейлор Б.Д., Лоу Н., Сю Ф., Несс Р.Б. Ризик наслідків після генітальної інфекції Chlamydia trachomatis у жінок. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Додет Б. Сучасні бар’єри, виклики та можливості для розробки ефективних вакцин проти ІПСШ: точка зору виробників вакцин, біотехнологічних компаній та фінансових агентств. Вакцина (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Бранхем RC, Куо CC, Клес Л., Холмс К.К. Кореляція імунної відповіді господаря з кількісним відновленням Chlamydia trachomatis з ендоцервіксу людини. Infect Immun (1983) 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Коттер Т.В., Мен К., Шен З.Л., Чжан І.Х., Су Х., Колдуелл Х.Д. Захисна ефективність моноклональних антитіл, специфічних до білка основної зовнішньої мембрани, імуноглобуліну a (IgA) та IgG у мишачій моделі інфекції статевих шляхів Chlamydia trachomatis. Infect Immun (1995) 63(12):4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Дослідження на нокаутних мишах показують, що захист від хламідій вимагає клітин TH1, що виробляють IFN-гамма: чи це вірно для людей? Scand J Immunol (1997) 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x

8. Гондек DC, Олів AJ, Старий Г, Старнбах М.Н. CD4 плюс Т-клітини є необхідними та достатніми для забезпечення захисту від інфекції Chlamydia trachomatis у верхніх статевих шляхах мишей. J Immunol (2012) 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Армітаж CW, О'Міра CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Оцінка інтра- та позаепітеліального секреторного IgA при хламідійних інфекціях. Імунологія (2014) 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Різні результати після трансцитозу IgG, націленого на внутрішньоклітинні та позаклітинні антигени хламідій. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Захист від інфекції Chlamydia trachomatis і патологічних змін верхніх статевих шляхів за допомогою стимульованих вакциною нейтралізуючих антитіл, спрямованих на VD4 білка основної зовнішньої мембрани. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 Т-клітинний резидентний імунітет підвищує захист, але не є обов’язковим у стратегії вакцинації проти генітальної інфекції chlamydia trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Запитуйте ще:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/телефон: плюс 86 15292862950

Додайте до кошика добавку цистанш:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop