Метформін полегшує нейрокогнітивні порушення під час старіння через активацію шляху AMPK/BDNF/PI3K. ЧАСТИНА 1

Уповільнення розвитку нейрокогнітивних порушень, пов’язаних з віком, було складним завданням. Ми оцінили терапевтичні ефекти метформіну при старінні, спричиненому d-галактозою. Крім того, ми вивчили потенційні молекулярні механізми, які можуть відповідати за ефект метформіну проти старіння. Тридцять щурів-самців порівну розділили на 1 — контрольну групу, яка отримувала фізіологічний розчин, 2 — групу d-галактози (D-gal), яка отримувала d-галактозу (100 мг/кг/день) шляхом промивання шлунка протягом восьми тижнів, і група 3—d-галактози плюс метформін (D-gal плюс Met), яка отримувала d-галактозу плюс метформін (200 мг/кг/день) шляхом промивання шлунка протягом восьми тижнів. Була проведена нейрокогнітивна оцінка. Було проведено вимірювання запального, окисного стресу та біомаркерів BDNF. Була оцінена експресія генів AMPK і PI3K. Тканини гіпокампу розсікали для гістопатологічних та імуногістохімічних досліджень. D-gal призводив до нейрокогнітивних порушень, підвищення запальних біомаркерів, змінених маркерів окисного стресу, зниження BDNF і зниження експресії синаптофізину та Bcl2 із збільшенням експресії каспази-3 та зниження регуляції генів AMPK і PI3K. Нейродегенеративні зміни були присутні в гіпокампі. Метформін значною мірою відновив індуковані D-gal нейродегенеративні зміни. Ми прийшли до висновку, що метформін може полегшити спричинений віком нейрокогнітивний дефіцит шляхом полегшення нейрозапалення, ослаблення окисного стресу, зменшення апоптозу, а також сприяння синаптичній пластичності. Ці механізми можуть бути опосередковані через активацію шляху AMPK/BDNF/PI3K.

Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають сильну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанхе має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і може поглинати активні форми кисню, запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.

Натисніть на Cistanche мовою урду про АНТИ СТАРІННЯ

【Для отримання додаткової інформації: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Скорочення

D-gal d-галактоза

АФК Активні форми кисню

IL-1 Інтерлейкін-1

IL-1 Інтерлейкін-1

IL-6 Інтерлейкін-6

IL-10 Інтерлейкін-10

TNF - фактор некрозу пухлини

BDNF Нейротрофічний фактор головного мозку

AMPK AMP-активована протеїнкіназа

PI3K/Akt Фосфатидилінозитол 3-кіназа/протеїнкіназа B

RT-PCR. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою

EPM Піднятий плюс лабіринт

Затримка передачі TL

MDA малоновий діальдегід

СОД Супероксиддисмутаза

MPTP Перехідна пора мітохондріальної проникності

H&E Гематоксилін і еозин

Синтаза оксиду азоту, індукована iNOS

NF-κB Ядерний фактор-κB

LTP Довгострокове потенціювання

Постійна втрата фізіологічної функції, розумової спритності та пам’яті, що відбувається зі старінням, є багатогранним процесом, який може бути спровокований загибеллю нейронних клітин1. За прогнозами, до 2030 року очікувана тривалість життя в багатьох країнах перевищить 85 років2. Через зниження якості життя людей похилого віку та пов’язані з цим економічні та особисті витрати когнітивні порушення, пов’язані зі старінням, стали серйозною соціальною проблемою. Крім того, старіння мозку є основною причиною розвитку нейродегенеративних захворювань, які часто прогресують незворотно3. В даний час існує небагато або зовсім немає ефективних методів лікування нейрокогнітивних порушень, пов’язаних зі старінням4.

d-галактоза (D-gal), моносахарид, який міститься в молочних продуктах, зазвичай перетворюється на глюкозу ферментами. Однак тривале системне застосування D-gal може становити значну небезпеку для здоров’я5. Попередні дослідження показали, що постійна системна доставка D-gal щурам може перетворити їх на моделі старіння та вікових нейродегенеративних розладів6. Модель старіння D-gal має кілька переваг перед моделлю природного старіння, включаючи можливість зосередитися виключно на процесі старіння. У моделі природного старіння супутні захворювання, включаючи діабет і гіпертензію, є складними змінними7.

Вважається, що D-gal викликає біохімічні аномалії, подібні до тих, що спостерігаються в старіючому людському мозку, такі як зниження активності антиоксидантних ферментів і ослаблення холінергічних нейронів. Розширені кінцеві продукти глікації, які пов’язані як з нормальним старінням, так і з патофізіологією багатьох захворювань, утворюються шляхом взаємодії D-gal з аміногрупами білка. Тварини, яких отримували D-gal, викликали нейрозапалення, пошкодження мітохондрій та окислювальне пошкодження внаслідок розвитку активних форм кисню (АФК), а також проблеми звикання до новизни, недоліки просторового навчання та когнітивних функцій8.

Запалення може бути ключовим фактором погіршення когнітивних функцій у людей похилого віку. Високі рівні інтерлейкіну-6, IL-1, фактора некрозу пухлини та С-реактивного білка пов’язують із підвищеним ризиком захворюваності та смертності у людей похилого віку9. Хронічне лікування d-галактозою у щурів викликало активацію нейрональних апоптичних сигнальних шляхів і нейрозапалення в корі головного мозку та гіпокампі1.

Старіння призводить до зниження нейротрофічного фактора, отриманого з мозку (BDNF), який є ключовим білком, який бере участь у пластичних змінах, пов’язаних із навчанням і пам’яттю, а також життєво важливим посередником для проліферації та цілісності нейронів10.

Відкриття нових сполук, які уповільнюють старіння та підтримують когнітивні функції, стало одним із найбільших викликів. Метформін швидко проникає через гематоенцефалічний бар’єр і накопичується в кількох областях мозку, включаючи гіпофіз і гіпокамп11. Було продемонстровано, що тривале застосування метформіну зменшує виникнення вікових патологічних ускладнень і подовжує тривалість життя людей12. Крім того, було показано, що метформін покращує когнітивні порушення та поведінкові розлади, такі як тривога, як у діабетиків, так і в осіб без діабету13,14 та пацієнтів із нейродегенеративними захворюваннями15. Однак основні механізми впливу метформіну на покращення нейрокогнітивних порушень, пов’язаних із віком, складні та все ще не зовсім зрозумілі.

Нейропротекторні ефекти метформіну можуть бути насамперед пов’язані з активацією сигнального шляху АМФ-активованої протеїнкінази (AMPK)11. Активація AMPK посилює експресію BDNF, яка відіграє вирішальну роль у синаптичній передачі та консолідації пам’яті10. На додаток до цієї добре встановленої властивості активації AMPK, попередні результати продемонстрували, що метформін може покращувати пам’ять шляхом відновлення окисного стресу, зменшення нейрозапалення та інгібування апоптозу, що може розширити його клінічні показання в області нейродегенеративних розладів14. Метформін є потужним активатором шляху фосфатидилінозитол3-кінази/протеїнкінази B (PI3K/Akt), який є важливим критичним сигнальним шляхом у пригніченні апоптозу та сприянні виживанню клітин16.

Беручи до уваги переваги метформіну, які включають його безпеку, доступність і зручність використання; ми вивчали нейропротекторні ефекти введення метформіну проти нейрокогнітивних порушень, спричинених індукованим d-галактозою старінням у щурів. Крім того, були досліджені основні молекулярні механізми цих захисних ефектів.

Матеріали та методи

Тварини.Щури-самці білої породи Tirty Wister вагою 200–250 грамів були використані в експерименті після отримання необхідних схвалень від Комітету з етики досліджень на медичному факультеті Університету Менуфа, Єгипет (реєстраційний № 10/2022 PHYS 9). Експериментальні процедури відповідали рекомендаціям ARRIVE. Щурів містили в клітки з дротяної сітки (80×40×30 см). Усі тварини мали повний доступ до їжі та води протягом періоду дослідження після кондиціонування протягом 2 тижнів у постійних умовах навколишнього середовища та 12:12--годинного циклу світло/темрява.

Експериментальний дизайн.Тварин випадковим чином розділили на три групи (10/група):

1. Контрольна група: отримували фізіологічний розчин через ротовий зонд.

2. Група d-галактози (D-gal): отримували d-галактозу (Sigma-Aldrich St. Louis, США), розчинену у фізіологічному розчині в дозі 100 мг/кг маси тіла шляхом промивання шлунка протягом восьми послідовних тижнів17.

3. Група, яка отримувала d-галактозу плюс метформін (D-gal плюс Met): отримувала d-галактозу (у тій же дозі в групі D-gal) плюс метформін (Sigma-Aldrich St. Louis, США), розчинений у сольовому розчині. у дозі 200 мг/кг/добу шляхом промивання шлунка протягом восьми тижнів поспіль16

Після закінчення восьми тижнів було проведено нейроповедінкову оцінку всіх щурів. Після цього щурів анестезували та забивали шляхом подовження шийки матки та дислокації. Мозок екстрагували і промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (pH 7,4). Ліву півкулю зважили і розділили на дві половини; одну з них використовували для біохімічного аналізу, іншу половину використовували для RT-PCR досліджень. Праву півкулю фіксували в 10-відсотковому фізіологічному розчині формаліну для гістопатологічної та імуногістохімічної оцінки тканин гіпокампа.

Нейробіхевіоральні тести.Розпізнавання нових об'єктів. Тест на розпізнавання нових об’єктів використовувався для оцінки здатності щурів розпізнавати новий об’єкт у знайомій обстановці. Кожен щур мав три дні тестування, яке включало три фази: звикання, навчання та тестування. Щурів помістили в апарат відкритого поля (50 см × 50 см × 40 см) під час фази звикання, і їм дали десять хвилин для адаптації без будь-яких предметів. Кожного щура тримали в камері з двома однаковими об'єктами протягом п'яти хвилин під час фази навчання. Через двадцять чотири години кожного щура поміщали в камеру на п'ять хвилин під час фази тестування, яка передбачала заміну одного зі старих об'єктів новим. За допомогою секундоміра вимірювали тривалість дослідження об'єкта. Індекс дискримінації [=(час дослідження нового об’єкта–час дослідження сімейного об’єкта)/загальний час дослідження × 100 відсотків] використовується для оцінки когнітивних показників щурів. Для очищення відкритого поля та предметів між щурами використовували спирт18.

Водний лабіринт Морріса. Водний лабіринт Морріса використовувався для вивчення впливу метформіну на просторове навчання та пам'ять. Басейн був виготовлений з нержавіючої сталі, мав діаметр 210 см і висоту 50 см, включаючи занурену евакуаційну платформу на 1 см нижче поверхні води. Воду підтримували на рівні 24±1 градус. Завдання збору перевірялося протягом п'яти днів тестування з чотирма пробами кожен день. Час, необхідний для того, щоб дістатися до секретної платформи під час кожного випробування, реєструвався як затримка втечі. Щурам було дано максимум 60 секунд, щоб знайти приховану платформу. Було встановлено максимальний ліміт часу 60 с, і щура вручну направляли на приховану платформу. Випробування з одним зондом проводили через 24 години після останнього випробування на п'ятий день. Платформу видаляли, і щура поміщали в басейн з квадранта, протилежного квадранту для навчання. Потім щура дозволяли вільно плавати протягом 60 с. Час, проведений у цільовому квадранті, реєстрували19.

Тест піднесеного плюс-лабіринту (EPM). EPM є усталеною технікою для оцінки тривожної поведінки у щурів. Він був дерев’яний і складався з відкритих і закритих рукавів (50 см в довжину × 10 см в ширину). Два зімкнутих рукава були оточені стінами заввишки 40 см. Руки кріпилися центральною квадратною платформою (10×10 см). Апарат знаходився на висоті 50 см над підлогою. Кожного щура поміщали в центр апарату обличчям до закритої руки і дозволяли вільно рухатися протягом п'яти хвилин. Час перебування у відкритих і закритих рукавах реєструвався. Крім того, записи з відкритими руками були зареєстровані в 20. Ми також вимірюємо затримку передачі (TL), яка використовується для оцінки пам’яті та навчання. У перший день (сеанс отримання) кожен щур піддавався впливу EPM протягом 90 секунд. Час, потрібний щурам для досягнення закритої руки, записували як TL. Щури, яким не вдалося увійти в закриті обійми протягом 90 с, були виключені з дослідження. На другий день (сеанс утримання) кожного щура поміщали у відкриту руку, і TL записували протягом максимум 90 с21.

Біохімічний аналіз.Тканину мозку перфузували розчином PBS, потім гомогенізували в 5 мл холодного буфера на грам тканини. Центрифугування тканини головного мозку проводили при 4000 об/хв протягом 15 хвилин, потім супернатант видаляли і зберігали при -80 градусах до вимірювання малонового діальдегіду (MDA) і супероксиддисмутази (SOD) за допомогою звичайного колориметра (QuantiChrom™, BioAssay Systems, США), сироватковий фактор некрозу пухлин (TNF-), інтерлейкін 10 (IL-10) і нейротропний фактор мозку (BDNF) за допомогою набору ELISA (Quantikine, компанія Abcam, Кембридж, Великобританія) відповідно до виробника інструкції.

Кількісний аналіз експресії генів AMPK і PI3K за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскриптази (RT-PCR).Тканини головного мозку готували для виділення тотальної РНК за допомогою Qiagen RN Easy plus Universal Kit із США. Тоді була забезпечена якість і чистота РНК. До використання РНК зберігалася при -80°. Потім першим кроком був синтез кДНК за допомогою QuantiTect Reverse Transcription Kit, Qiagen зі США, з використанням термоциклера Applied Biosystems 2720 (Сінгапур) лише за один цикл. Праймери GAPDH використовували в реакціях RT-PCR як контроль завантаження РНК. Другим етапом була ампліфікація кДНК: кДНК використовували в кількісній ПЛР у реальному часі на основі SYBR green для відносної кількісної оцінки (RQ) експресії генів AMPK і PI3K за допомогою SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, США, з використанням наступних розроблених праймерів (Мідленд, Техас). ): Перший праймер для AMPK був (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC). І зворотний праймер був (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT). Прямий праймер для PI3K був (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA), а зворотний праймер був (GAAACTTTTTCCCACCACGA). Нарешті, було проведено аналіз даних за допомогою програмного забезпечення Applied Biosystems 7500 версії 2.0.1. RQ експресії генів AMPK і PI3K проводили за допомогою порівняльного методу ∆∆Ct, де кількість мРНК цільових генів (AMPK і PI3K) нормалізується до ендогенного еталонного гена (GAPDH) і відносно контролю.

Гістопатологічна оцінка тканини мозку.Гістологічне дослідження. Тканину головного мозку фіксували в 10% розчині формаліну, заливали в парафін і отримували серійні корональні зрізи товщиною 5 мкм. Зрізи гіпокампу головного мозку потім пофарбували гематоксиліном і еозином (H&E) для дослідження за допомогою світлового мікроскопа.

Імуногістохімічне фарбування гіпокампу. Імуногістохімічне фарбування каспази-3 (номер CAT: ab32351, компанія Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, США) і синаптофізину (номер CAT: ab32127, компанія Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, США) проводили за допомогою кроликів моноклональні антитіла. Для Bcl-2 (CAT номер: ab59348, компанія Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, США) це відбулося за допомогою кролячих поліклональних антитіл. Їх отримували в одному флаконі, що містив 1 мл антитіл. Анти-каспаз-3, анти-синаптофізин і анти-Bcl-2 використовувалися в розведених кількостях 1:50, 1:400 і 1:100 відповідно. Зрізи розрізали на 5 мкм і фарбували за допомогою автоматичного імунофарбувальника LINK 48 (Dako, Agilent Technologies Inc, Санта-Клара, США). Для відновлення тепла використовували цитратний буфер за допомогою імунофарбувальника. Скела автоматично фарбували первинними розведеними антитілами. Позитивний контроль реакції проводили з використанням спеціальних залитих парафіном зрізів нормальної мигдалини людини, підшлункової залози людини та фолікулярної аденоми для каспази -3, синаптофізину та Bcl-2 відповідно. Негативні контролі робили шляхом заміни первинних антитіл неімунною сироваткою.

Оцінка гістопатології та імуногістохімічних маркерів (каспаза-3, синаптофізин і Bcl-2) проводилася в різних областях гіпокампу, включаючи CA1, CA2 і CA3.

Статистичний аналіз.Результати виражені як середнє ± стандартне відхилення (SD). Аналіз дисперсій (ANOVA) використовувався для статистичного аналізу різних груп, використовуючи програмне забезпечення Origin® і ймовірність випадковості (значення p). P значення<0.05 were considered significant.

Етичне схвалення та згода на участь.Ця робота була схвалена Етичним комітетом факультету медицини Університету Менуфа, Єгипет, і була схвалена інструкціями.

Результати

Нейробіхевіоральні тести.Щодо тесту на новий об’єкт, відсоток індексу дискримінації був значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою (-37.16±3,31 відсотка проти 30,16±2,92 відсотка відповідно, P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

Що стосується тесту лабіринту Морріса, середнє значення тривалості затримки втечі було значно вищим у перший, другий, третій, четвертий та п’ятий дні в групі D-gal порівняно з контрольною групою (58,16±1,94, 4{ {19}}.62±1,33, 32,75±1,10, 24,37±1,58 і 15,29±0,98 с проти 40,16±2,92, 25,16±1,15, 17,04±1,08, 11,75±1,31 і 5,83±0. 86 с, відповідно, П<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

У тесті піднятого плюс-лабіринту середнє значення тривалості, яку щури провели в розкритих руках, було значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою (60±6,54 с проти 90,83±3,48 с відповідно , П<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

Біохімічні дослідження.Середнє значення рівня MDA у мозку було значно вищим, тоді як середнє значення рівня SOD у мозку було значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою (70±3,23 нмоль/мг білка та 13,05±1.{{7 }} Од/мг білка проти 33,76±2,13 нмоль/мг білка та 29,11±4,34 Од/мг білка відповідно, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

Середнє значення рівня TNF- у мозку було значно вищим, тоді як середнє значення рівня IL-10 у мозку було значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою (67,50 ± 10,03 пг/мг білка та 72,91 ±8,45 пг/мг білка проти 16,61 ±1,21 пг/мг білка та 157,23 ±12,46 пг/мг білка відповідно, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

Середнє значення рівня BDNF мозку було значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою (125,72±4,17 пг/мг білка проти 225,20±5,52 пг/мг білка відповідно, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

Кількісна RT‑PCR (qRT‑PCR). Експресія генів AMPK і PI3k (0.52±0.11 і 0.37±0.03 відповідно, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) у порівнянні з контрольною групою (рис. 6).

Гістопатологія.H&E фарбування тканини гіпокампу в контрольній групі виявило незначні патологічні зміни. Група D-gal показала значну дегенерацію нейронів і апоптотичні тіла з масивним набряком і гліозом. Тим не менш, зрізи групи D-gal плюс Met показали незначну кількість нейрональних дегенерацій і невелику кількість апоптичних тілець з легким набряком і легким вогнищевим гліозом (рис. 7).

Імуногістохімія. Імуногістохімічні результати показали, що значення H-балу експресії синаптофізину в тканині гіпокампу було значно нижчим (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

Показник Н експресії каспази-3 в тканині гіпокампу був значно вищим (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

Значення H-балу експресії Bcl-2 у тканині гіпокампу було значно нижчим (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

Обговорення

Збільшення середньої тривалості життя підвищує ризик захворювань у людей похилого віку, особливо в когнітивній сфері, що може бути, принаймні частково, пов’язане з втратою нейронів у мозку. Загальновідомо, що довготривале введення d-галактози сприяє прогресуванню старіння та незначному пошкодженню нейронів і дефектам пам’яті. Оскільки D-галіндуковане старіння супроводжується нейродегенерацією, це може бути ідеальною моделлю для вивчення молекулярних механізмів, пов’язаних із віковою нейродегенерацією, і для тестування нових терапевтичних підходів22.

Наше дослідження показало, що постійне введення D-gal порушувало дослідницьку поведінку, викликану новизною, і робочу пам'ять у щурів. Це було очевидно в результатах тестування нового об’єкта, водного лабіринту Морріса та піднятого плюс лабіринту. Ці результати узгоджувалися з іншими зареєстрованими дослідженнями23. З іншого боку; лікування метформіном покращило оперативну пам’ять і прихильність до новизни порівняно з групою D-gal. Підтверджуючи наші результати, попереднє дослідження показало, що метформін покращує короткочасну пам’ять у мишей із діабетом, індукованим стрептозотоцином24. Добре задокументовано, що старіння пов’язане не лише зі зниженням когнітивних функцій, а й з емоційними змінами, включаючи поведінку, подібну до тривоги, яка призводить до функціональних порушень25. У цьому дослідженні результати тесту EPM показали підвищену тривожну поведінку в групі D-gal порівняно з контрольною групою. Під час лікування метформіном послаблювалася тривожно-подібна поведінка.

Дане дослідження показало, що нейроповедінкові зміни, спричинені пероральним прийомом D-gal, супроводжувалися порушеннями маркерів окисного стресу мозку. Середнє значення рівня МДА в гомогенаті тканини головного мозку було достовірно вищим, тоді як активність антиоксидантного ферменту СОД була значно нижчою в групі D-gal порівняно з контрольною групою. Про подібні результати повідомлялося раніше23,26. D-gal взаємодіє з різними вільними амінами в білковій архітектурі через неферментативне глікування, що призводить до генерації прогресивних продуктів глікації. Це призводить до утворення АФК, що прискорює старіння мозку через окислювальне пошкодження ДНК, ліпідів і білків. Втрата пам’яті та порушення навчання, викликані тривалим прийомом D-gal, можуть бути пов’язані з утворенням вільних радикалів, що призводить до порушення нейрогенезу та, зрештою, до нейродегенерації27. Крім того, нейрони мозку більш сприйнятливі до окислювального стресу через наявність високого вмісту ліпідів і більшого споживання кисню26.

Навпаки, застосування метформіну значно відновлювало окисно-відновний баланс. Докази показали, що метформін може пригнічувати перехідну пору мітохондріальної проникності (mPTP) і зменшувати виробництво АФК і перекисне окислення ліпідів28. Таким чином, це вказує на те, що антивіковий ефект метформіну може бути опосередкований його антиоксидантним захистом.

Крім окислювального стресу, запалення також є важливим механізмом, що індукує старіння при лікуванні D-gal. D-gal сприяє утворенню АФК, які активують запальні шляхи3. Хронічне нейрозапалення та секреція прозапальних цитокінів є характерними ознаками старіння29. Існує згода, що запальні цитокіни беруть участь в окислювальному стресі. TNF-, IL-6 та IL-1 мають важливе значення для розвитку та прогресування окисного стресу. Ці цитокіни асоціюються з АФК і активують ядерний фактор-κB (NF-κB) для переміщення в ядро ​​та регулювання експресії прозапальних генів, таких як iNOS і COX2, які беруть участь у запальних та імунних реакціях, і, як наслідок, призводять до фіброз, апоптоз і відповіді гострої фази, які викликають пошкодження органів30. Вищезазначені дані узгоджувалися з нашими результатами, оскільки рівень TNF-альфа був значно вищим, а IL-10 був значно нижчим у групі D-gal порівняно з контрольною групою.

З іншого боку, лікування метформіном призвело до значного зниження маркерів запалення порівняно з групою D-gal. Протизапальну дію метформіну можна пояснити активацією сигналізації AMPK, яка пригнічує запальні реакції шляхом інгібування NF-κB29. Крім того, він зменшив продукцію прозапальних цитокінів і активацію мікроглії в мозку, що, у свою чергу, зменшує окислювальний стрес30

Щоб глибше зрозуміти молекулярні механізми, що лежать в основі дії метформіну, ми дослідили білкову експресію AMPK і PI3k. Наше дослідження показало, що експресія AMPK значно знижувалася в групі D-gal порівняно з контрольною групою, тоді як її рівень значно підвищувався в групі лікування метформіном порівняно з групою D-gal. Попередні дослідження показали, що активація AMPK і чутливість AMPK зменшуються з віком, що може пояснити зміну метаболічної регуляції, що призводить до зниження аутофагії та збільшення окисного стресу31. Було виявлено, що метформін активує AMPK шляхом збільшення фосфорилювання AMPK у Tr-17232. AMPK є основною мішенню метформіну через його захисну функцію від порушення когнітивних функцій. Ghadernezhad та ін. повідомили, що індукована метформіном активація AMPK призвела до активації шляху BDNF/P70S6K у нейронах гіпокампу для посилення формування пам’яті в задачі пасивного уникнення в моделі глобальної церебральної ішемії/реперфузії щурів. Активація BDNF відіграє життєво важливу роль у регуляції нейрокогнітивних функцій, таких як навчання, пам’ять, синаптична передача та пластичність 33. Кілька досліджень показали, що AMPK може діяти як модулятор довгострокової потенціації (LTP), і це необхідно для формування пам’яті 34 . Таким чином, індуковане метформіном покращення пам’яті в нашому дослідженні могло бути опосередковано через активацію сигналу AMPK.

【Для отримання додаткової інформації: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】