Мета-аналіз результатів кількісного визначення NAD(P)(H) демонструє варіабельність у різних тканинах ссавців
Jun 01, 2023
Нікотинамідаденіндинуклеотид (NAD плюс) відіграє важливу роль в енергетичному метаболізмі та сигнальних шляхах, що контролюють важливі клітинні функції. Theпідвищений інтерес до NAD плюс метаболізміТерапія, що посилює НАД плюспідсилив необхідність точного NAD плюс кількісного визначення. Щоб перевірити опубліковані показники NAD(P)(H) у тканинах ссавців, ми виконали aмета-аналіз існуючих даних. Пошук у базі даних Ovid MEDLINE виявив статті з результатами кількісного визначення NAD(P)(H), отримані з тканин ссавців, опубліковані між 1961 і 2021 роками. Ми перевірили 4890 записів і вилучили кількісні дані, а такожметоди кількісної оцінки, переданалітичні умови та характеристики суб’єкта. Екстраговані фізіологічні концентрації NAD(P)(H) врізні тканинивід мишей, щурів і людей виявили важливу між- і внутрішньометодну мінливість, яка поширилася на останні публікації. Це підкреслює відносно низький потенціал для крос-експериментального аналізу кількісних даних NAD(P)(H) і важливість стандартизації методів кількісного визначення NAD(P)(H) іпереданалітичні процедуридля майбутніх доклінічних іклінічні дослідження.
Натисніть тут, щоб отримати властивості Cistanche проти окислення та продукти проти старіння
Нікотинамідаденіндинуклеотид відіграє подвійну роль як aвідновлення–окислення (редокс)коферменту, в його окисленому (НАД(П) плюс ) івідновлені (NAD(P)H) форми, і як aко-субстрат (NAD(P) плюс ) для ферментів, які беруть участь у деацилюванні1, моно- та полі-АДФ-рибозилювання2,3 та створення вторинних месенджерів на основі аденіну4–7. Співвідношення NAD(P) плюс /NAD(P)H є важливим показником внутрішньоклітинного окисно-відновного стану та відіграє вирішальну роль у регуляції ключових метаболічних шляхів8,9. Наприклад, NAD plus необхідний для гліколізу разом із циклом трикарбонових кислот (TCA), щоб забезпечити відновні еквіваленти під час генерації аденозинтрифосфату (АТФ), основного джерела енергії для клітини8,9. Коли NAD plus обмежений, він також може бути регенерований з NADH шляхом ферментації пірувату для отримання лактату в клітинах ссавців, таким чином підтримуючи клітинний окисно-відновний баланс25. НАД плюс і НАДН також можуть бути фосфорильовані до НАДФ і НАДФН, відповідно, НАД плюс кіназами (НАДК)10,11. НАДФН необхідний для відновного біосинтезу, передачі сигналу, клітинних антиоксидантних реакцій і, зокрема, відновлення глутатіону12–14. У цитозолі НАДФ плюс відновлюється до НАДФН глюкозо-6-фосфатдегідрогеназою та 6-фосфоглюконатдегідрогеназою пентозофосфатного шляху (PPP), серед інших реакцій13. У той час як у мітохондріях виробництво NADPH підтримується різними реакціями, у тому числі залежними від активності ферментів нікотинаміднуклеотидтрансгідрогенази (NNT) та ізоцитратдегідрогенази (IDH2)15. Як наслідок, було показано, що статус NAD(P)(H) впливає на сигналізацію та метаболізм клітин, енергетичний гомеостаз, мітохондріальний біогенез, реакції на окислювальний стрес, а також підтримку та відновлення ДНК16–18. Крім того, оскільки прогресування захворювань, пов’язаних з віком, таких як ожиріння19, неалкогольна жирова хвороба печінки20,21, нейродегенерація22, мітохондріальні23 та серцево-судинні24 захворювання, атрофія чи дистрофія25 м’язів, було пов’язане зі змінами метаболітів, пов’язаних з НАД плюс, підходи спрямовані на підтримку NAD плюс гомеостазу в даний час досліджуються.
Крім звичайних окислювально-відновних переходів, NADP plus може споживатися шляхом обміну його нікотинамідної групи на нікотинову кислоту в реакції, що каталізується синтазами cADPR, такими як CD38, з утворенням другого месенджера NAADP, який бере участь у мобілізації кальцію, секреції гормонів та імунних клітинах. проліферація6,7,26. NAD plus також може споживатися, коли діє як косубстрат для утворення нікотинаміду (NAM), який можна використовувати як субстрат для регенерації NAD plus за допомогою шляху відновлення NAM. NAM також можна метилювати з утворенням 1-метил NAM (meNAM), який можна далі окислювати до продуктів розпаду N1-метил-2-піридон-5-карбоксаміду (2py) та N1-метил-4-піридон-3-карбоксамід (4py). Зрештою, метильовані катаболіти можуть виводитися з організму через сечу27,28. Пул NAD plus можна також зменшити за рахунок споживання NADP plus через реакцію обміну основ для утворення другого месенджера NAADP14. Таким чином, для підтримки пулу NAD plus потрібен біосинтез за допомогою шляху Прейса-Хандлера (починаючи зі звичайної молекули вітаміну B3 ніацину (NA; нікотинова кислота)), шляху біосинтезу de novo (починаючи з амінокислоти триптофану (Trp)) або регенерація від перетворення NAM через шлях відновлення до NMN, а потім до NAD plus. Нарешті, шлях відновлення також важливий для біосинтезу NAD plus з нікотинамід рибозиду (NR), альтернативної форми вітаміну B3, що міститься в харчових продуктах, після його фосфорилювання нікотинамід рибозид кіназою до NMN і потім перетворення на NAD plus через шлях відновлення. .
Тому розуміння динаміки NAD плюс метаболом стало важливим і, зрештою, вимагає ретельної кількісної оцінки метаболітів, щоб краще зрозуміти взаємодію NAD плюс метаболіти під час нормальної фізіології або з прогресуванням захворювання чи здоровим старінням. Чітке уявлення про ці зміни має важливе значення для зв’язку змін у NAD плюс метаболомі з ферментативними або окислювально-відновними реакціями, які є ключовими для змін у фенотипах тканин. Враховуючи значну кількість раніше повідомлених кількісних даних про NAD плюс метаболіти у ссавців, включаючи зростаючу кількість повідомлень про людей, важливо та своєчасно узагальнити ці зміни під час здоров’я та хвороби. Численні дослідження вивчали компоненти NAD плюс метаболом у гризунів і людей за різних метаболічних станів, віку та захворювань, але покладалися на різні методи підготовки зразків або кількісного визначення. Підготовка зразків важлива для метаболітів, які беруть участь в окисно-відновних реакціях через потенційну деградацію та взаємоперетворення за певних умов29,30. Вважається, що для кількісного визначення рідинна хроматографія в поєднанні з мас-спектрометрією (РХ-МС) і магнітно-резонансною спектрометрією (МРС) є чутливими та специфічними методами31–33, тоді як аналізи циклу ферментів є більш поширеними. Кількісні методи РХ-МС вимагають повного включення контролю якості для окремих метаболітів, що вимірюються, і для загального ефекту матриці зразків, ефекту, який пояснює різні мас-спектрометричні відповіді для даного аналіту при вимірюванні в різних розчинах. Без цих контролів РХ-МС у кращому випадку є напівкількісним. У цьому дослідженні ми виявили значну варіабельність показників NAD(P)(H) у дослідженнях на гризунах і людях, наголошуючи на необхідності належних методів звітності та стандартизованої обробки зразків і аналітичних протоколів. Загалом, порівняльні набори даних NAD(P)(H) у різних дослідженнях необхідні для змістовної інтерпретації наявних і майбутніх даних у сфері NAD плюс біології.
Результати
Мета-аналіз загальних методів кількісного визначення разом із досліджуваними видами, статтю та тканинами.
Історично ранні методи, використовувані для кількісного визначення NAD(P)(H), спиралися на спектрофотометричні або флуорометричні властивості цих метаболітів34,35. Останнім часом методи циклу ферментів у поєднанні зі спектрофотометричним або флуорометричним виявленням частіше використовуються для розрізнення рівнів коферменту NAD(P)(H)36–38. Зростаюча потреба у високій чутливості та роздільній здатності кількісного визначення цих коферментів, а також необхідність вимірювання інших метаболітів, пов’язаних з НАД плюс, призвели до використання методів високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і РХ-МС. З цих підходів РХ-МС став кращим методом, оскільки мас-спектрометрія в поєднанні з рідинною хроматографією дозволяє специфічно ідентифікувати елюйовані сполуки разом із додатковою перевагою для включення метаболітів ізотопів NAD(P)(H) як внутрішнього підвищення якості. елементи керування. Незважаючи на їхні переваги перед класичними спектрофотометричними або флуорометричними аналізами, ВЕРХ та РХ-МС залишаються дорогими та трудомісткими, що пояснює, чому аналізи циклу ферментів продовжують використовуватися в останніх дослідженнях.
Використовуючи систематичний підхід, із 241 прийнятного дослідження (додатковий матеріал 2) для подальшого аналізу було відібрано 205 досліджень, які включали кількісний мета-аналіз концентрацій NAD(P)(H) у тканинах миші, щура та людини. З цих досліджень 46,7 відсотка використовували аналізи циклу ферментів, з яких включали колориметричне (40,9 відсотка) або флуорометричне (5,8 відсотка) виявлення, тоді як 17,8 відсотка використовували методи ВЕРХ (у поєднанні з УФ- чи флуоресцентними детекторами), а 13,2 відсотка використовували аналізи РХ-МС ( рис. 1а). Більшість досліджень не містили детального опису процедур екстракції метаболітів. Однак зазвичай використовувані процедури екстракції складалися з екстракційних буферів з поверхнево-активними речовинами або без них (Triton®, Tris, додецил триметиламоній бромід), або полярних органічних розчинників, таких як ацетонітрил, метанол, етанол або хлороформ. Попередні дослідження показали, що інактивація ферменту та оптимальні умови pH і температури були ефективними для збереження стабільності різних форм NAD(P)(H)30,39,40. Коли було розкрито, зразки були оброблені в умовах низької температури, і жодних окислювально-відновних добавок не згадувалося у включених дослідженнях. Окислювально-відновні реакції були обмежені інактивацією ферментів у зразках перед вимірюванням метаболітів NAD(P)(H), як правило, шляхом осадження такими розчинниками, як етанол, метанол, ацетонітрил або хлорна кислота (PCA). Однак використання PCA було рідкісним через кислотолабільну природу відновлених форм (тобто NADH і NADPH), а також через необхідність додаткової стадії нейтралізації. Крім того, серед досліджень, які повідомляють про використання PCA під час екстракції метаболіту (5,4 відсотка), 3,7 відсотка повідомили лише про результати NAD(P) плюс або використовували другий метод екстракції без кислоти для належного кількісного визначення NAD(P)H. Лише 1,7 відсотка досліджень повідомили про результати NADH, загального NAD(H) та/або NAD плюс /NADH з використанням лише екстракції PCA. Потенційне упередження в цих дослідженнях неможливо було проаналізувати через обмеженість даних.
Порівняння середніх фізіологічних рівнів NAD(P)(H) у тканинах гризунів і людей.
Щоб допомогти визначити очікувані середні фізіологічні рівні NAD(P)(H) для найбільш часто досліджуваних тканин миші, щура та людини, ми зібрали дані з усіх когорт контрольного та дикого типу з кожного з включених досліджень (Додатковий матеріал 2). ). Зокрема, ми реєстрували середні рівні NAD(P)(H), нормалізовані до ваги тканини або, у випадку крові, до об’єму. Дані досліджень, які нормалізували рівні метаболітів до вмісту білка, були включені в наш зібраний набір даних (Додатковий матеріал 2), але не використовувалися для подальшого аналізу через низьку кількість повідомлених результатів. Крім того, коли це було можливо, ми розрахували співвідношення NAD(P) плюс /NAD(P)H, як відображення окисно-відновного стану, а також загальні рівні NAD(P)(H) (NAD(P) плюс плюс NAD (P)(H)), які є загальними виходами звітів для виправлень NAD(P)(H). Витягнуті дані також включали вид, штами, вік, стать, метод кількісного визначення, раціон і графік годування, тип зразка, метод збору зразка та час збору врожаю (до або після забою).
Мета-аналіз даних NAD(H) визначив середні фізіологічні концентрації NAD плюс і NADH у тканинах миші (рис. 2a,b, додатковий рис. 1a,b) і щура (додатковий рис. 2a,b) тварин. молодше 14 місяців для мишей і 18 місяців для щурів. Витягнутий діапазон фізіологічних значень співвідношення NAD плюс /NADH і загальних рівнів NAD(H) (NAD плюс плюс NADH) були побудовані для мишей (рис. 2c, d) і щурів (додаткова рис. 2c, d). На відміну від досліджень на мишах, більшість повідомлених даних про щурів не включали вік тварин; однак ми вирішили включити ці дані за умови, що дослідження не класифікувало їхні когорти як вікові. Серед найбільш вивчених тканин цей мета-аналіз показує, що середній рівень NAD плюс для печінки (596 нмоль/г, n=26) вищий, ніж для всіх інших тканин у мишей, тоді як несподівано для скелетних м’язів (162,8 нмоль /g, n=9) демонструє одне з найнижчих середніх значень на грам тканини (рис. 2а). Ці результати можуть означати знижену ефективність екстракції NAD плюс метаболіти через високоволокнисту природу м’язів або те, що існують значні відмінності в м’язах NAD плюс метаболізм порівняно з іншими тканинами з високим метаболізмом, такими як печінка та нирки.
Незважаючи на кілька кількісних досліджень старіння, рівні NAD плюс у літніх мишей були в середньому знижені в печінці, м’язах і пігментованому епітелії сітківки (RPE) у порівнянні з їхніми молодими когортами та середнім значенням усіх досліджень, проведених на мишах молодшого віку. старше 14 місяців (додаткова рис. 3). Мета-аналіз NADH і співвідношення NAD плюс /NADH у літніх тварин був неможливий, оскільки лише одне з цих кількісних досліджень виконувало ці вимірювання.
Ці дані демонструють відсутність кількісних даних NAD(H) у старіючих тварин.
Для даних, отриманих у ході досліджень із залученням здорових людей, вікові діапазони значно відрізнялися в різних дослідженнях (від 15 до 92,3 років), і в більшості випадків дані не були стратифіковані за цим віком. Тканини людини, які найчастіше вимірювали, включали скелетні м’язи та компоненти крові через їх менш інвазивний характер збору (рис. 3a–d). Результати з інших тканин людини (n= 1–2) відображені на Додатковому малюнку 4. Цей аналіз показав середню концентрацію NAD плюс 44,62 нмоль/мл (n=23) у цільній крові, з подібним Концентрації NAD плюс для еритроцитів становлять 46,96 нмоль/мл (n=7) (рис. 3a; додаткова таблиця 1). Однак рівні NAD плюс у плазмі крові були значно нижчими з медіаною 0.37 нмоль/мл (n=8) (рис. 3a). Середній рівень НАД плюс, виявлений у скелетних м’язах людини, становив 191,9 (n=4) нмоль/г у вологих м’язових препаратах порівняно з 1713 (n=3) нмоль/г у ліофілізованих препаратах, низька температура процес дегідратації, який, ймовірно, концентрує метаболіти (рис. 3а). У тканинах, які частіше досліджуються для вимірювання НАДН, середні рівні в еритроцитах людини, плазмі та ліофілізованих скелетних м’язах становили 1,75 нмоль/мл (n =7), 0,39 нмоль/мл (n=8) та 136,8 нмоль/г (n=6) відповідно (рис. 3б). Відповідні медіанні співвідношення NAD плюс /NADH становили 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) і 12,7 (n=3) (рис. 3c). Цікаво, що середнє співвідношення NAD плюс/NADH для еритроцитів (23,65) і ліофілізованих скелетних м’язів (12,7) (рис. 3c) було в кілька разів вище, ніж у більшості тканин мишей і щурів (рис. 2c і додаткова рис. 2c). , що вказує на високоокислювальний окисно-відновний стан із великою кількістю доступного NAD плюс у цих тканинах людини. У випадку з м’язовою тканиною це може мати наслідки при розгляді трансляційного потенціалу досліджень на гризунах, які визначили переваги підвищення рівня НАД плюс у м’язах. Однак підвищене співвідношення NAD плюс/NADH у м’язах також може бути результатом затримки процедур заморожування зразка в клінічному середовищі, що може призвести до нефізіологічних змін окисно-відновного статусу зразка.
Було складено фізіологічні рівні NADP(H) у тканинах гризунів, причому найбільш поширене вимірювання було в печінці. Печінка миші показала середнє значення 124,2 нмоль/г НАДФ плюс (n=13) і 140,2 нмоль/г НАДФН (n=4) (рис. 4a,b). ), у той час як печінка щурів показала медіану 95,11 нмоль/г НАДФ плюс (n=10) і 240,7 нмоль/г НАДФН (n=9) (додатковий рис. 5a,b). Середнє співвідношення NADP плюс/NADPH, отримане в результаті досліджень, у яких вимірювали обидва метаболіти, було нижчим за 1 у більшості тканин мишей і щурів (рис. 4c, додаткова рис. 5c). Середній загальний рівень НАДФ(Н) (НАДФ плюс плюс НАДФН) у печінці миші та щура становив 244,4 (n=3) (рис. 4d) і 342,1 (n=9) (додатковий рис. 5d) , відповідно. У людей найпоширеніші вимірювання NADP(H) проводилися в еритроцитах, показуючи середнє значення 33,2 нмоль/мл для NADP плюс (n=14) і 22,4 нмоль/мл для NADPH (n{{30} }) з невідповідних досліджень із середнім співвідношенням НАДФ плюс/НАДФН 1,27 і середнім загальним НАДФ(Н) 52,0 нмоль/мл у дослідженнях, у яких вимірювали обидва метаболіти (n=11) (рис. 4e– h). Загалом кількість доступних даних для NADP(H) є незначною для всіх видів, що призводить до зниження впевненості в медіанних значеннях для кожної тканини.
Аналіз зміщення та варіабельності методів кількісного визначення NAD(P)(H).
Враховуючи, що більшість досліджень, включених до цього мета-аналізу, досліджували рівні НАД плюс у зразках печінки гризунів (рис. 1c,e), ми використовували фізіологічні рівні НАД плюс у печінці миші та щура, щоб визначити будь-яке потенційне зміщення в результатах, що відповідає до методу кількісного визначення (рис. 5а,б). Середній вік мишей, включених у цей аналіз, становив 17,9 тижня (діапазон: 2–55 тижнів), при цьому 6 досліджень не розкривали вік тварин. Щодо щурів, більшість досліджень не розкривали вік тварин, за винятком трьох, які коливалися від 2 днів до 8 місяців. Жодне з досліджень не повідомляло про використання старих тварин. У печінці миші великий діапазон зареєстрованих концентрацій для НАД плюс охоплював від 1,8 до 1132 нмоль/г печінки із середнім значенням 596.0 (n=26) (рис. 5a). , тоді як концентрації NADH коливалися від 0.9 до 109 нмоль/г тканини із середнім значенням 66,43 (n=6) (додаткова рис. 6а). Важливо, що коефіцієнт варіації 52,5 відсотка та 76,5 відсотка були розраховані для середніх фізіологічних результатів NAD плюс та NADH у печінці миші, відповідно, як виміряно кількома методами кількісної оцінки, показуючи ступінь варіабельності між дослідженнями. Як було передбачено на основі цих результатів, середнє співвідношення NAD плюс /NADH у печінці миші (3,41 плюс /− 3,16 SD, n=19) продемонструвало однаково великий діапазон варіабельності з CV 92,7 відсотка (додатковий рис. 6c) . Подібна варіабельність показників NAD плюс і NADH також спостерігалася в печінці щурів (CV=42.6% для NAD плюс і CV=44.4% для NADH). Відповідні концентрації для НАД плюс і НАДН у печінці щурів коливалися від 159 до 796 (n=16) і від 65 до 265 (n=12) нмоль/г відповідно (рис. 5b, додаткова рис. 6b). ), у той час як співвідношення NAD плюс /NADH показало CV 50.1 відсотка (середнє значення: 3,219 плюс /- 1,612 SD, n=23) (додаткова рис. 6d). Середні значення та стандартні відхилення для NAD плюс, NADH, загального NAD(H) і дані співвідношення NAD плюс /NADH у печінці миші та щура, згруповані за методом кількісного визначення, наведені в додатковій таблиці 2. Щодо рівнів NADP(H) та співвідношення NADP плюс / NADPH, подібна варіабельність спостерігалася в тканинах печінки. Рівні НАДФ плюс коливалися від 50,4 до 247,4 нмоль/г тканини для мишей (додатковий рис. 8a) та від 45,7 до 171 нмоль/г тканини для щурів (додатковий рис. 8b), тоді як рівні NADPH коливався від 28 до 236,9 нмоль/г тканини для мишей (додатковий рис. 8c) і від 90 до 409 нмоль/г тканини для щурів (додатковий рис. 8d). Нарешті, співвідношення NADP плюс/NADPH коливалося від 0,12 до 0,55 у печінці миші (додатковий рис. 8e) і від 0,12 до 1,44 у печінці щурів (додатковий рис. 8f).
в найбільшому діапазоні результатів (від 1,8 до 1132,3 нмоль/г). Навіть найновіші розглянуті дослідження РХ-МС показали діапазон цих значень NAD плюс, включаючи значення 1,8 нмоль/г41 і 33,8 нмоль/г42 і набагато вищі значення 946,3 нмоль/г43 і 1132,3 нмоль/г44. Крім того, великий діапазон значень РХ-МС NAD плюс, здається, не корелює з дослідженнями, які виключають мічені ізотопами внутрішні стандарти (рис. 5а), метод, який використовується для покращення ідентифікації метаболіту та точності кількісного значення . Однак два ідентифікованих дослідження РХ-МС, які покладалися виключно на зовнішню стандартну криву для NAD плюс кількісне визначення, а не включали внутрішній контроль, були в середньому нижчими, ніж середнє для всіх заходів (рис. 5a). Крім того, дослідження з використанням нормалізації внутрішнього стандарту використовували різні типи внутрішніх стандартів, наприклад, включення одного міченого еталонного метаболіту45,46 або екстрактів міченого метаболіту з дріжджів43,44 або клітинних культур41. Цікаво, що ці дослідження, в яких використовувалися стандарти, отримані з екстракту дріжджів або культури клітин, забезпечили або найвищі, або найнижчі показники, отримані за допомогою РХ-МС, для рівнів NAD в печінці. Це потенційно підкреслює, як клітинні екстракти багатих ізотопами стандартів можуть сприяти варіабельності вимірювань NAD plus, оскільки матричний ефект доданих стандартних дріжджів або клітинного екстракту може перешкоджати ефективності іонізації та, отже, виміряним концентраціям цільових метаболітів.
Обмеження цього аналізу кількісної помилки та мінливості включають потенційні відмінності в середовищі, генетичному фоні, жертвоприношеннях, статі та віці. Усі дані для цього аналізу були отримані від тварин, які харчувалися дієтою, але можуть відрізнятися за типом. Повідомляється, що після умертвіння тварина наїлася чи не голодувала, а також час доби у жертву. Крім того, хоча більшість досліджень на мишах проводилися на фоні C57BL/6, існував більший діапазон фонів, використаних для щурів у всіх дослідженнях (Вістар: 38 відсотків, Альбінос Вістар: 25 відсотків і 6 відсотків для Hooded Wistar, Sprague–Dawley, щури Holtzman, ACI, Long-Evans і Zucker). У дослідженнях печінки мишей не було статистичних відмінностей між значеннями для чоловіків і жінок для рівнів NAD плюс, NADH або загального NAD(H) або співвідношення NAD плюс /NADH (додаткова рис. 7). Однак ми не можемо зробити висновки через обмежену кількість жіночих когорт.
Запитуйте ще:
Електронна пошта:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: плюс 86 15292862950
