Опосередкований антивіковий ефект екстракту цистанхея

культура ЄС

Ендотеліальні клітини пупкової вени людини були отримані з Американської колекції типових культур (Manassas VA, США). Клітини культивували при 37 °C з 5-відсотковим вмістом CO2 ендотеліального середовища для росту-2 (EGM-2; Лонза, Уокервіль, штат Меріленд, США), доповненого 10-відсотковою фетальною бичачою сироваткою (FBS). ЕК культивували протягом 48 годин при 37°C з 5% CO, у середовищі EGM-2 (контроль) або HG 30 мМ, з додаванням або без додавання різних концентрацій Cistanche (1040 мкг/мл).

Дослідження життєздатності клітин

Клітини культивували при 37 °C протягом 72 годин у середовищі EGM-2, доповненому 2 відсотками FBS і різними концентраціями Cistanche, і обробляли розчином MTT протягом 4 годин. Отримані відкладення формазану розчиняли диметилсульфоксидом, де абсорбцію вимірювали при 570 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів VersaMax ELISA (MolecularDevices, Саннівейл, Каліфорнія, США).

Аналіз міграції подряпини

Клітини пошкоджували, а потім культуральні середовища замінювали свіжими середовищами, що містять різні концентрації Cistanche. Клітини зберігали протягом 24-48 годин. Під час повної міграції клітини знімали за допомогою мікроскопа (Olympus Optical Co, Ltd., Токіо, Японія). Мігровані клітини підраховували за допомогою оптичного мікроскопа при 200-кратному збільшенні та кількісно визначали вручну

Фарбування SA-P-gal

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 клітин підраховано за допомогою трьох незалежних полів.

Вестерн-блот аналіз

Клітини збирали та лізували в розчині для екстракції білка (Intron Biotechnology, Inc, Кьонгі, Корея), що містить інгібітори протеази та фосфатази (10 хв при 4°C). Загальні концентрації білка в супернатантах вимірювали за допомогою аналізів Бредфорда. Після нагрівання при 95 градусах протягом 5 хвилин зразки білка (30 мкг) розділяли електрофорезом у 8-12% додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі. Потім білки переносили на полівініліденфторидні мембрани (MilliporeBedford, MA, США) при 100 В протягом 60 хв. Мембрани інкубували в 5% бичачого сироваткового альбуміну (BSA) у трис-буферному фізіологічному розчині (TBS) з додаванням 0,05% TBS з Tween-20 (TBST) (30 хв при кімнатній температурі), потім інкубували в 5% BSA у TBST з додаванням первинних антитіл (1:200 до l, 000) (на ніч при 4°C). Далі мембрани інокулювали кон’югованими з HRP козячими антикролячими або антимишачими антитілами (1:5, 000) протягом години, і білкові смуги виявляли за допомогою покращеного набору хемілюмінесцентного виявлення (Intron Biotechnology, Inc. ) і LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Токіо, Японія). Напівкількісний аналіз результатів денситометрії проводили за допомогою Image J (Національний інститут здоров'я, Бетесда, MD США).

Вимірювання утворення NO Концентрації NO визначали шляхом визначення концентрації нітриту за допомогою наборів для аналізу NO відповідно до інструкцій виробника. Оптичну густину визначали при 560 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів, а концентрації розраховували за допомогою калібрувальної кривої

Статистичний аналіз

Результати виражені як середнє значення плюс стандартне відхилення (SD). Статистичну значущість визначали за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA). Post hoc порівняння між групами проводили за допомогою множинних порівняльних тестів Бонферроні. Усі розрахунки виконано за допомогою SPSS у Windows (версія 23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) і P-значення<0.05 were considered statistically significant.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Цитотоксичність Cistanche

Щоб визначити цитотоксичність Cistanche на EC, клітини інкубували з різними концентраціями Cistanche (0 до 100 мкг/мл) протягом 72 годин. Cistanche продемонстрував значну цитотоксичність (P<0.05) at concentrations >50 мкг/мл у всі моменти лікування (рис. 1). Таким чином, концентрації Cistanche<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Шлях мітоген-активованої протеїнкінази (MAPK) регулює ключові процеси, пов’язані з розвитком судинної ЕК, такі як клітинна проліферація, інвазія, метастазування та виживання, а також ангіогенез (Pišlar et al., 2015). MAPK включає ERK, N-кінцеву кіназу c-Jun і p38 (Kim and Choi, 2010). ERK і p38 є важливими сигнальними білками, що беруть участь у загоєнні ран, тоді як ERK відіграє важливу роль у контролі клітинної міграції, проліферації, диференціювання та виживання (Roskoski, 2012). У недавньому дослідженні було припущено, що сигнальний шлях p38 MAPK бере участь у загоєнні ран (Loughlin and Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). У цьому дослідженні ми досліджували експресію білка ERK і p38, щоб ідентифікувати сигнальні шляхи, залучені в міграцію EC, регульовану Cistanche. Лікування Cistanche (40 мкг/мл) збільшило міграцію EC в 1.5-рази порівняно з контролем (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-складка вище за контроль (Стор<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Рис. 1.НаслідкиЦистанхе(Cistanche) на життєздатність клітин. Клітини обробляли Cistanche (0 до 100г/мл) протягом 72 год. Життєздатність клітинрозраховували як відсоток життєздатних клітин, культивованих увідсутність Cistanche. Результати показують середнє ±SD. *P<0.05.