Механічне розуміння індукованої діосміном нейропротекції та покращення пам’яті на моделі щура з інтрацеребровентрикулярною хіноліновою кислотою: відродження мітохондріальних функцій і антиоксидантів, частина 3

2. Матеріал і методи

2.1. Піддослідні тварини. .чи дослідження було дозволено IAEC відповідно до протоколу №. ASCB/IAEC/14/20/145. Щурів AlbinoWistar (будь-якої статі, вагою від 200 г до 250 г, віком від 8 до 9 місяців) утримували в поліпропіленових кубоподібних корпусах типового розміру при штучних налаштуваннях температури (23 ± 2 градуси), послідовності 12:12 годин темрява/світло та вологість (40 ± 10%) у приміщенні для тварин. Гризунів годували стандартним поживним кормом (Ashirwad Manufacturers, Пенджаб) і очищеною водою за бажанням.

Стосунки між чоловіками та жінками та пам'ять завжди привертали велику увагу. Загальновідомо, що чоловічі гормони відіграють важливу роль у фізичному розвитку, підтримці здоров’я та сприянні статевому розвитку та статевій функції. Крім того, останні дослідження показали, що чоловічі гормони тісно пов'язані з пам'яттю.

Дослідження показали, що чоловіки краще за жінок справляються з певними завданнями пам’яті. Наприклад, у чоловіків зазвичай краще, ніж у жінок, просторова пам’ять, і причина – вплив чоловічих гормонів на гіпокамп. Гіпокамп - це область мозку, яка обробляє просторову пам'ять. Чоловічі гормони можуть сприяти функціонуванню гіпокампу, тим самим покращуючи здатність до просторової пам’яті чоловіків.

Однак жіночі гормони також позитивно впливають на пам'ять. Дослідження виявили, що жіночі гормони можуть сприяти експресії пов’язаних з пам’яттю генів у мозку та збільшувати кількість і функцію нейронів у гіпокампі, тим самим покращуючи жіночу пам’ять. Крім того, жіночі гормони можуть знімати стрес, гальмувати загибель нейронних клітин, захищати нейрони мозку та додатково покращувати жіночу пам’ять.

Це свідчить про те, що як чоловічі, так і жіночі гормони позитивно впливають на поліпшення пам'яті. Чоловіки та жінки мають різні показники пам’яті, кожна зі своїми перевагами та недоліками, але це не означає, що чоловіки мають кращу пам’ять, ніж жінки, або що жінки мають кращу пам’ять, ніж чоловіки. Тому ми не повинні використовувати стать як міру пам’яті. Кожна людина повинна повноцінно працювати на свою користь і постійно вдосконалювати свою пам’ять.

Нарешті, незалежно від того, чоловіки чи жінки, ми повинні звернути увагу на своє фізичне здоров'я та психічний стан і вибрати правильний спосіб покращити пам'ять. Наприклад, постійне навчання новому, формування звичних життєвих звичок і підтримання емоційної стабільності можуть мати позитивний вплив на покращення пам’яті. Давайте працювати разом, щоб постійно досліджувати та практикувати методи покращення пам’яті та створення кращого майбутнього для себе. Видно, що нам потрібно покращувати пам'ять. Цистанхе може значно покращити пам'ять, оскільки цистанхе є традиційною китайською медициною з багатьма унікальними ефектами, одним із яких є покращення пам'яті. Ефективність цистанчі пов’язана з різними активними інгредієнтами, які він містить, включаючи дубильну кислоту, полісахариди, флавоноїдні глікозиди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними способами.

Клацніть дізнатися про 10 способів покращити пам’ять

Усі процедури з тваринами виконуються виключно відповідно до вказівок CPCSEA, GOI, Нью-Делі. Опікуни та доглядачі тварин не знали щодо різних терапевтичних схем, що застосовуються для когорт тварин. Дослідження на тваринах проводили після принаймні одного двотижневого ознайомлення.

Усі дослідження з використанням тварин проводилися між 0900- і 1600- годинами годин на день. 2.2. Наркотики та хімікати. Діосмін (DSM: 520-27-4), хінолінова кислота (QA: 89-00-9) і стандартні аналіти були придбані у Merck (Індія).

Дигідрофосфат натрію (NaH2PO4), гідроксид натрію (NaOH), двоосновний фосфат калію (K2HPO4), нітроблюететразолій (NBT), феназинметосульфат (5-метилфеназинію метилсульфат), етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA), альбумін бичачої сируми (BSA), {{ 5}}[4-(2-гідроксіетил)піперазин-1-іл]етансульфонова кислота (HEPES), 1,2-біс[2-[біс(карбоксиметил) аміно]етокси]етан (EGTA), рибофлавін, ціанід натрію (NaCN), натріумазид (NaN3), пірофосфат тетранатрію, перекис водню (H2O2), динатрій NADH (DPNH), тетранатрій NADPH (тетранатрієва сіль, відновлена ​​коензимом II), фосфорна кислота, фенол Фоліна та Чокальтеу (FCR) і реагент сульфосаліцилової кислоти (5-SSA) (HiMedia Laboratories, Махараштра, Індія); дигліцин, крижана оцтова кислота (CH3COOH), реактив Еллмана (3-карбокси-4-нітрофенілдисульфід, DTNB), азабензол (C5H5N) і лаурилсульфат натрію (SLS) (LobaChemie, Мумбаї, Індія); 4,6-дигідрокси-2-меркаптопіримідин (2-TBA), динатрій карбонат (Na2CO3) і (2-меркаптоетил)триметиламоній йодид ацетат (TCI chemicals, Індія); сульфат цинку (ZnSO4), сіль Рошеля (L(+)-тартрат натрію калію), дигідрохлорид 2-(1-нафтиламіно)етиламіну, азотиста кислота натрію (NaNO2) і п-амінобензолсульфонамід (SiscoResearch Laboratories, Індія) ); бутиловий спирт (Fisher Scientific, Індія). 2.3. Інтрацеребровентрикулярна ін'єкція хінолінової кислоти.

Тварин піддавали анестезії внутрішньоочеревинним введенням (ip) коктейлю кетаміну (90 мг/кг) і ксилазину (10 мг/кг), використовуючи стерильну воду для ін’єкцій. Тіло лежало на теплій нагрівальній подушці, а в кріпленні стереотаксичного хірургічного інструменту розташовувалася голова. Скальп був розрізаний у серединно-сагітальній точці, і череп був відкритий шляхом розтягування шкіри.

Будь-який із двох бічних шлуночків було обрано довільно, і в черепі було просвердлено тім’яну кістку (стереотаксичні координати -0.8 мм передньо-задньо від брегми, ±1,5 мм медіолатерально від середньосагітального шва та ±3,6 мм дорсовентрально від поверхні тім’яної кістки ), щоб зробити отвір [21].

У перший день розчин хінолінової кислоти (QA) був свіжоприготований (240 нмоль) у PBS (Na+-K+ [PO4]2- забуферений фізіологічний розчин, pH 7,4) і поступово вводився за допомогою мікрошприца Гамільтона зі швидкістю потоку 1 мкл/хв у лівий або правий шлуночок головного мозку щурів протягом 5-6 хвилин з об’ємом ін’єкції 5 мкл ICV-носія [22].

Після інокуляції цілого препарату мікроголку не зміщували протягом 4-5 хвилин, щоб забезпечити дифузію препарату в спинномозковій рідині та перешкодити його регургітації. Еквівалентний об’єм (10 мкл) PBS-носія вводили ICV шамратам, яким проводили ідентичні операції, однак QA не вводили.

Після ін'єкцій препарату отвори були відновлені за допомогою фіксуючого засобу (фосфат цинку, PYRAX®) і виконано зшивання шкіри. Щоб запобігти контамінації (розмноженню бактерій), Neosporin® застосовували pro nata.

Для подолання післяопераційного сепсису вводили оризолін (Zydus Cadila) у дозі 30 мг/кг (в/б). Кожного щура забезпечили теплим середовищем (37 ± 0,5 градуса), щоб запобігти післяопераційній гіпотермії. Кожному щуру дозволяли напівтверду їжу (всередині клітини) і воду безкоштовно після операції протягом семи днів і містили окремо в окремій клітці (30 × 23 × 14 см3).

2.4. Протокол експерименту. DSM вводили щурам у дозах 50 і 100 мг/кг на масу тіла (в.т.) внутрішньоочеревинно (ip) шляхом використання 0,5% розчину диметилсульфоксиду в нормальному фізіологічному розчині (доза-об’єм 5 мл/кг) [17].

Тварини були випадковим чином розподілені на 5 кластерів в одинарному сліпому режимі (n � 5): (i) фіктивний (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 та (v) QA + ДНП. Щурам на 1-й день проводили внутрішньомозкове введення QA (QA-ICV) або фіктивну операцію.

DSM вводили протягом 21 дня поспіль щодня через 120 хвилин після QA-ICV, починаючи з першого дня і далі. Донепезил (DNP) використовувався як стандартний препарат у цьому дослідженні та вводився (доза 3 мг/кг, внутрішньовенно) щурам, яким вводили QAICV, протягом 21 дня поспіль.

Тваринам у контрольній групі та контрольній групі QA вводили носій (стерильний 0.5% диметилсульфоксид у нормальному фізіологічному розчині в об’ємі дози 5 мл/кг) з 1 по 21 день. Усе дослідження було проведено згідно зі схемою, зображеною на Рисунок 1.2.5. Локомоторна діяльність.

У всіх кластерах щурів середню рухову активність фіксували за допомогою актофотометра протягом 5 хвилин. Окрему тварину поміщали в актофотометр на 3 хвилини акліматизації. Потім щурам давали 5 хвилин, і результати викладали як підрахунки за 5 хвилин [11]. 2.6. Ротарод Тест.

In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 секунд на стержні, що обертається з дев’ятьма обертами за хвилину (об/хв).

Після випробувань одержання на циліндричний вал поміщали окремого щура, і швидкість обертання підвищували з постійною перервою в 10 секунд від 6 об/хв (попередня швидкість) до 30 об/хв (кінцева швидкість), що охоплювало понад 50 секунд. У результатах було зазначено середню затримку спаду (у секундах) від циліндричного вала, що обертається. 2.7.

Аналіз сліду. Принцип проведення аналізу слідів у щурів полягає в оцінці аномалій ходи.

Для відбитків лапи щурів занурювали в чотири різнокольорові нетоксичні харчові барвники і їм дозволяли бігати по похилій доріжці (70 см × 10 см × 8 см). Основа злітно-посадкової смуги була закрита целюлозним листом білого кольору. Щурів спонукали до тьмяної ділянки підйому в кінці злітно-посадкової смуги, щоб отримати чіткі сліди. Після випробувань барвник обережно видаляли з кожної тварини теплою водою. Сліди ніг сканували, а «довжину кроку» вимірювали за допомогою стандартної лінійки. Довжина кроку була кількісно визначена шляхом розрахунку відстані між послідовними розміщеннями однакової лапи щура [11].

2.8. Нове завдання розпізнавання об’єктів (NORT). Дотримувалися стандартного протоколу, наданого Кумаром і Бансалом [23].

ORT є збитковим і неворожим екстероцептивним архетипом, який використовується для оцінки робочої спогадової пам’яті, яка використовується за допомогою імпульсивного зондування гризунів. Дослідження проводять у фанерній кубовидній посудині на даху (80 см × 42 см × 62 см), розташованій у тихій зоні, освітленій світлодіодом потужністю 60 Вт для забезпечення постійної яскравості в посудині.

Дерев’яні предмети у формі циліндра (білий), піраміди (червоний) і куба (чорний) (12 см заввишки) (в однакових трійках) були твердими та мали достатню вагу, щоб гризуни не рухали їх. НОРТ проводили на 16-й день у 3 етапи (S): акліматизація (S1), придбання (S2) та етап обстеження (утримання) розпізнавання нового об’єкта (S3).

Під час S1 три послідовні дні перед випробуваннями проводилися для виявлення щурами вільної основи підлоги посудини (5 хвилин). Після завершення S1 окрема тварина звикла до будь-якого набору твердих предметів на стадії навчання (S2).

Подвійні предмети розташовувалися в 2 довільно вибраних протилежних кутах посудини (відстань від бічних валів 9 см до 11 см). Окремо гризуна розташували в центрі посудини навпроти двох твердих предметів і йому дозволили відкрити два подібних предмета протягом 5 хвилин. Слідчою діяльністю передбачалося наведення морди біля предмета на відстань менше або дорівнює 2–3 см або фізичний контакт із предметом дулом.

Після S2 гризуна поміщали в домашню клітку з міжпробним інтервалом (ITR) на 60 хвилин.

Будь-який єдиний суцільний предмет, запропонований у S2, було замінено іншим солідним предметом, і гризунів знову представили предметам-близнюкам, тобто копії знайомого предмета та іншого предмету. Усі об’єднання та положення предметів були зміщені до зменшити ймовірне упередження, викликане схильністю до певних установок або предметів. Посудину та тверді предмети ретельно протирали (15% етиловим спиртом і сухою тканиною) після кожного дослідження, щоб усунути сліди запаху. Період, витрачений на виявлення кожного елемента в S2 і S3, був задокументований за допомогою секундоміра. .e тривалість, витрачена на дослідження двох відповідних елементів у S2 (I1 � Ii1 + Ii2) і тривалість, витрачена на дослідження двох несхожих елементів, тобто знайомих і різних, в S3 (I2 � Ii3 + Ib) було записано. Розбіжність у тривалості дослідження іншого предмета та тривалості дослідження знайомого предмета (Ib–Ii3 � DI) розкриває збереження спогадової пам’яті.

DI (індекс дискримінації)/S3 тривалість(и) дослідження як знайомого, так і нового елемента (змінений DI) покращує упередженість за рахунок відхилень у повному дослідженні та вказує на схильність до різних предметів на відміну від знайомих {DI � (Ib–Ii3) )/(Ii3 + Ib)}. Спогадну пам’ять оцінювали шляхом кількісної оцінки навичок гризунів виділяти знайомі/нові елементи в S3 і вказували як DI (з поправками для загального періоду дослідження в S3) [24].

2.9. Водний лабіринт Морріса (MWM). Було дотримано стандартного протоколу, наведеного Кумаром і Бансалом [25]. MWM оцінює просторову пам'ять за пробами плавання, під час яких гризун знаходить шлях втечі до прихованого подіуму.

Круглий резервуар чорного кольору (діаметр 2 м, висота 0.6 м) містив воду (25 ± 1 градус), заповнену на глибину 0.3 м. Водний резервуар був розділений за годинниковою стрілкою на 4 подібні області (R1, R2, R3 і R4) за допомогою двох нейлонових волокон, закріплених перпендикулярно на верхньому периметрі резервуара.

Помост (10,5 см × 10,5 см) був розташований під водою (1 см під водою) у зоні резервуара R4. Пляма помосту залишалася недоторканою протягом усього періоду придбання.

Кожен окремий щур отримував чотири серійні раунди збору (5 хвилин ITR) щодня. Гризуна обережно випустили у водну водойму обличчям до стінки акваріуму, причому місце змінювалося залежно від кожного окремого випробування від R1-R4, R2-R1, R3-R2 і R{{ 7}}R3 у дні з 1 по 4, відповідно, і було дозволено 120 секунд для виявлення підводного подіуму. Гризуни продовжували відпочивати на подіумі протягом 20 секунд.

Нездатність виявити платформу протягом 120 секунд означала ручне розміщення щурів на платформі, а потім їм було дозволено 20 секунд на платформі. Час очікування втечі (ELT) — це тривалість (с) виявлення прихованого майданчика у водній водоймі.

Просторове навчання було відзначено першим днем ​​проти четвертого дня ELT. У зондовому досліді (5-й день) гризуни досліджували водойму протягом 120 секунд, але були позбавлені подіуму. Була зареєстрована середня тривалість, витрачена у всьому резервуарі (4 регіони). Середня тривалість, витрачена в R4 (TSTQ: час, проведений у цільовому квадранті), зондування прихованого подіуму вважалася індексом еталонної пам’яті. Порівняльна обстановка ємності щодо предметів лабораторії, що виконують роль візуальних знаків, і позиція дослідника залишалася непорушеною [26].

2.10. Оцінка біохімічних показників. Після завершення поведінкового обстеження весь мозок щурів був зібраний і розміщений на подрібнених кубиках льоду з подальшим купанням із замороженим стерилізованим фізіологічним розчином (ізотонічний 308 мОсмоль/л NaCl) для видалення залишків і крові.

Гомогенізація всього мозку була миттєво виконана в буфері для розділення при заморожуванні (pH 7,4) з композицією 215 мМ D-маніту, 20 мМ 2-[4-(2-гідроксіетил )піперазин-1-іл]етансульфонова кислота, 1 мМ 1,2-біс[2-[біс(карбоксиметил)аміно]етокси]етан, 75 мМ сахарози та 0,1% BSA. Гомогенат центрифугували при 4 градусах із застосуванням сили 13000 × g протягом 5 хвилин. Осад відкидали, а супернатант розділяли на дві частини та повторно центрифугували (4 градуси) при силі 13000 × g протягом 5 хвилин. Неочищений мітохондріальний осад відокремили та знову центрифугували в розділювальному буфері з 1,2-біс[2-[біс(карбоксиметил)аміно]етокси]етаном при 12 500 × g протягом 11 хвилин (4 градуси). Отриманий таким чином напівтвердий осад, що містить незабруднені мітохондрії, ресуспендували в буфері для розділення (pH 7,4), що містить 75 мМ сахарози, 20 мМ 2-[4-(2-гідроксіетил)піперазин-1- іл]етансульфонової кислоти та 215 мМ D-маніту [27].

Пізніше мітохондріальну фракцію гомогенату цілого мозку використовували для визначення біохімічних маркерів стандартними методами.2.11. Оцінка мітохондріального комплексу.

2.11.1. NADH: активність убіхіноноксидоредуктази. Швидкість активності комплексу I (НАДН-дегідрогенази) визначали кількісно (нмоль окисленого НАДН/хв/мг білка), дотримуючись техніки Кінга та Говарда [28]. Окислювальне утворення НАД+ з НАДН супроводжується відновленням цитохрому с. Суміш для аналізу складалася з цитохрому с (10,5 мМ), 6 мМ -нікотинамідаденіндинуклеотиду (DPNH), розчиненого з використанням 2 мМ дигліцинового буфера та дигліцинового буфера (0,2 М, pH 8,5).

Розчинну мітохондріальну фракцію було включено в суміш для аналізу, щоб ініціювати реакцію. Протягом 120 секунд спостерігали за зміною оптичної щільності (OD) при λmax �550 нм.

2.11.2. Сукцинат: активність убіхінон-оксидоредуктази. Рівень активності сукцинатдегідрогенази (комплекс II) визначали кількісно (нмоль окисленого сукцинату/хвилина/мг білка) за методикою Кінга [29].

Окислення бурштинової кислоти ініціюється псевдоприймачем електронів, ціанофератом калію (K3Fe(CN)6). Суміш для аналізу складається з янтарної кислоти (0.63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6 (0.036 M) і Na+-K+ [PO4]2- буфер (0,23 М, pH 7,6). Розчинну мітохондріальну фракцію було включено в суміш для аналізу, щоб ініціювати реакцію. Протягом 120 секунд спостерігали за зміною OD при λmax �420 нм. 2.12. Визначення біомаркерів окисного стресу2.12.1. реактивні речовини йобарбітурової кислоти (TBARS).

Щоб оцінити TBARS (нмоль на мг білка) [30], аналізуйте комбінацію (кінцева кількість ~4 мл), що містить 0.10 мл гомогенізованого мозку, 1,51 мл 4,{{ 7}}дигідрокси-2-меркаптопіримідин (0,8%), 200 мкл SLS (8,18%), 1,49 мл крижаної оцтової кислоти (21%, рН 3,51) і 0,71 мл деіонізованої води піддавали нагріванню на водяній бані при 96 градусах для 60 хвилин.

Бутиловий спирт/азабензол у співвідношенні 15:1 (5,1 мл) додавали в суміш для аналізу, яку центрифугували при 4,000 × g (10 хвилин), і супернатант відокремлювали.

За допомогою двопроменевого спектрофотометра UV1700 (Shimadzu, Японія) хромофорний малоновий діальдегід-4, 6-дигідрокси-2-меркаптопіримідин OD оцінювався при довжині хвилі (λmax �532 нм) і ε �1,56 × 105/М/см (коефіцієнт молярної екстинкції) було застосовано для обчислення аддуктів 4,6-дигідрокси-2-меркаптопіримідину.

2.12.2. Знижений рівень глутатіону (Lc-глутаміл-L-цистеїніл-гліцин). Для оцінки вмісту L-глутатіону (GSH) було застосовано процедуру Елмана [31]. Випробувану суміш, що містить гомогенат (1,1 мл) і 1 мл 4% 2-гідрокси-5-сульфобензойної кислоти (5-SSA), центрифугували (4 градуси) протягом 11 хвилин при потужності 2500 × g. .

Пізніше 2,8 мл буфера Na+-K+[PO4]2- (51,2 мМ, pH 7,77) і {{10}}.21 мл 3-карбокси{{13 }}нітрофенілдисульфід (0.12 мМ, рН 7,89) змішували з відокремленою вище супернатантом (0,12 мл).

Трипептид (мкмоль GSH на мг білка) кількісно визначали за допомогою двопроменевого спектрофотометра UV1700 (λmax �412 нм). застосування ε � 1,36 ×104/М/см.2.12.3.

Активність глутатіонпероксидази. Активність глутатіонпероксидази (GPx) (EC 1.11.1.9) оцінювали за допомогою методики Mohandas et al. [32]. .eаналізуйте суміш, що складається з 100 мкл 10% гомогенату, 100 мкл азиду натрію (1,11 мМ), 100 мкл ЕДТА (1,13 мМ), 40 мкл глутатіон-дисульфідредуктази (GSR, 1 МО/мл) (EC1.8.1.7), 10 мкл H2O2 (0,28 мМ), 40 мкл Lc-глутаміл-L-цистеїніл-гліцину (1,2 мМ), 100 мкл відновленої тетранатрієвої солі коензиму II (0,22 мМ) ) і 0,12 М 1,49 мл буфера Na+-K+ [PO4]2- (pH 7,4) у загальній кількості 2000 мкл. Втрата відновленого коферментом II тетранатрію при λmax � 340 нм була задокументована при температурі 25 градусів. Швидкість GPx обчислювалася як нмоль окисленого NADPH/хвилина/мг білка з використанням ε �, що становить 6,22 × 103/М/см.

For more information:1950477648nn@gmail.com