Втрата JAK1 призводить до вродженого імунодефіциту

Сигнальний шлях Янус-кінази — перетворювачів сигналу та активаторів транскрипції (JAK-STAT) має вирішальне значення для налаштування імунних відповідей, а його дисрегуляція тісно пов’язана з раком та імунними розладами. Порушення сигнального шляху інтерлейкіну (IL)-15/STAT5 через втрату ланцюгів рецепторів IL-15, JAK3 або STAT5 призводить до імунодефіциту з аномаліями природних клітин-кілерів (NK). JAK1 разом із JAK3 передає сигнали нижче за IL-15, але точний внесок JAK1 у біологію NK-клітин ще належить з’ясувати. Щоб вивчити наслідки дефіциту JAK1 у клітинах NK, ми створили мишей з умовною делецією JAK1 у клітинах NKp46+ (Jak1fl/flNcr1Cre). Ми показуємо тут, що видалення властивого NK-клітинам JAK1 значно зменшило кількість NK-клітин у кістковому мозку та порушило їх розвиток. Відповідно, ми спостерігали майже повну втрату NK-клітин у селезінці, крові та печінці, доводячи вирішальну роль JAK1 у периферичних NK-клітинах. Відповідно, у мишей Jak1fl/+Ncr1Cre спостерігалося значне погіршення опосередкованого NK-клітинами спостереження за пухлиною. Наші дані свідчать про те, що JAK2 не здатний компенсувати втрату JAK1 у NK-клітинах. Важливо, що умовна делеція JAK2 у клітинах NKp46+ не мала впливу на периферичні NK-клітини, показуючи, що JAK2, властивий NK-клітинам, необхідний для виживання NK-клітин. Таким чином, ми визначили, що втрата JAK1 у NK-клітинах викликає вроджений імунний дефіцит, тоді як дефіцит JAK2 залишає кількість і дозрівання NK-клітин незмінними. Таким чином, ми припускаємо, що на відміну від інгібіторів JAK1/JAK2, які зараз використовуються, використання JAK2-специфічних інгібіторів було б вигідним для пацієнтів, залишаючи NK-клітини недоторканими.

Ключові слова: JAK-STAT, природні клітини-кілери, JAK1, JAK2, спостереження за пухлинами

Переваги cistanche tubulosa - Протипухлинний

ВСТУП

Природні клітини-кілери (NK) — це вроджені лімфоцити, які розпізнають і вбивають інфіковані вірусом або трансформовані клітини (1). Дефіцит NK-клітин є рідкісним, але все більш цінним підтипом первинного імунодефіциту (ПІД). Класичний дефіцит NK-клітин характеризується відсутністю NK-клітин у периферичній крові та призводить до підвищеної сприйнятливості до вірусних інфекцій (2). Янус-кіназа (JAK) — перетворювач сигналу та сигнальний шлях активатора транскрипції (STAT) діє після багатьох цитокінів, факторів росту та гормонів, таким чином критично регулюючи імунні відповіді (3, 4). Після зв'язування специфічного ліганду з його спорідненим рецептором конформаційні зміни призводять до олігомеризації рецептора та активації пов'язаних з рецептором JAK. JAK ауто- та трансфосфорилюють один одного та фосфорилюють рецепторні ланцюги, забезпечуючи місця стикування для молекул STAT. Потім STAT піддаються JAK-опосередкованому фосфорилюванню, димеризуються та транслокуються до ядра, де вони регулюють транскрипцію цільових генів (5). JAK3 і STAT5 є ключовими гравцями в передачі сигналу нижче за течією цитокінів, які використовують рецептор c (6). Мутації «втрати функції» (LOF) у генах, що кодують JAK3 (7) або STAT5B (8), призводять до ВЗОМТ із аномаліями NK-клітин, що підкреслює важливість шляху для вроджених лімфоцитів. Імунодефіцит цих пацієнтів пояснюється порушенням відповідей IL-7 та IL-15 (6). Важливо, що JAK1 відіграє домінуючу роль над JAK3 в активації STAT5 нижче за с-вмісними цитокіновими рецепторами (9). Привабливо припустити, що мутації LOF JAK1 також можуть призвести до PID. На сьогоднішній день лише один пацієнт із мутаціями зародкової лінії JAK1, де JAK1 був знижений, але не був відсутній, був ідентифікований і справді мав пригнічення імунітету (10). У мишей повна втрата JAK1 призводить до перинатальної летальності, а у новонароджених мишей спостерігається сильне зниження кількості тимоцитів і В-клітин (11). Ці спостереження були підтверджені на дорослих мишах: індукована делеція JAK1 призводить до порушення гомеостазу гемопоетичних стовбурових клітин (HSC) і помітно знижує частоту B-клітин і B220+CD11c+NK1.1+ підмножини NK-клітини (12). Однак на сьогодні жодне дослідження не аналізувало безпосередньо вплив втрати JAK1 на звичайні NK-клітини.

Cistanche deserticola ma- Підтримання печінки

Перше уявлення про внесок JAK1 в біологію клітин NK випливає з досліджень із застосуванням інгібіторів JAK — схвалених препаратів для лікування раку та аутоімунних захворювань (13). І миші, і пацієнти, які отримували інгібітор JAK1/JAK2 руксолітиніб, показали зниження кількості NK-клітин, порушення дозрівання та функції (14, 15). Оскільки JAK2 також бере участь у диференціації NK-клітин (14, 16), залишається з’ясувати, яка з двох кіназ відповідає за спостережувані ефекти лікування руксолітинібом. Використовуючи мишей з нокаутом Jak1 або Jak2 у клітинах NKp46+, ми показуємо, що JAK2 необхідний для виживання NK-клітин. Навпаки, делеція JAK1 у зрілих NK-клітинах призводить до дефіциту NK-клітин, і втрати одного алеля Jak1 достатньо, щоб порушити контроль росту пухлини. Таким чином, ми визначили JAK1 як ключовий фактор для зрілих NK-клітин і створили мишачу модель класичного дефіциту NK-клітин.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Миші та клітинні лінії

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; були люб’язно надані д-ром Олександром Доналом (CCRI, Відень, Австрія). Алель Jak1tm1c мутанта було отримано від мишей з нокаутним першим алелем Jak1tm1a (описано Міжнародним консорціумом фенотипування миші https://www.mousephenotype.org) шляхом видалення касети lacZ-neo за допомогою Flp-рекомбінації.

Умовний потенціал мишей Jak1fl/fl був активований Cre-рекомбінацією та вирізанням loxP-фланкованого екзона 3 Jak1. Тканиноспецифічну рекомбінацію індукували схрещуванням Jak1fl/fl або Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] з B6NTg(Ncr1Cre); (18) миші. Миші Stat5fl/fl (19) і Stat5fl/flNcr1Cre (18) були описані раніше. Миші Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre були на фоні C57B6/N, а Jak2fl/fl – на змішаному фоні. Експериментальні тварини відповідали за віком (8–12 тижнів) і утримувались у специфічних умовах, вільних від патогенів, в Університеті ветеринарної медицини, Відень відповідно до рекомендацій Федерації асоціацій лабораторних тварин (FELASA) (2014). Експерименти на тваринах були схвалені Комітетом з етики та добробуту тварин Віденського університету ветеринарної медицини та національним органом влади (Федеральне міністерство науки та досліджень Австрії) відповідно до §§ 26ff. Закону про експерименти на тваринах, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, за ліцензіями BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 та BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 та проводилися відповідно до вказівок FELASA та ARRIVE. У цьому документі Jak1WT посилається на об’єднані дані мишей Jak1fl/+ і Jak1fl/fl. Лінії клітин мишачої лімфоми RMA-Rae1 [люб’язно надані проф. A. Cerwenka; (20)] і YAC-1 культивували в повному середовищі RPMI1640 (Sigma), що містило 10% FCS (Bio & Sell), 100 ОД/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину (Sigma) і 50 мкМ {{58 }}меркаптоетанол (Sigma).

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Модель пухлини in vivo

Мишам Jak1fl/+ і Jak1fl/+Ncr1Cre підшкірно вводили 106 клітин RMA-Rae1 в обидва боки, і ріст пухлини спостерігали через день. Через десять днів після ін'єкції мишей умертвляли і визначали вагу пухлини. Для проточної цитометрії NK-клітин, що інфільтрують пухлину, пухлини розрізали на частини розміром ~5 мм2, і суспензію окремих клітин отримували за допомогою gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) з буфером для травлення, що містить колагеназу D (1 мг/мл; Sigma Aldrich) та ДНКаза I (20 мг/мл; Roche).

Виділення, розширення та стимуляція NK-клітин

NK-клітини виділяли з одноклітинних суспензій селезінки за допомогою мічених DX5-MACS гранул відповідно до інструкцій виробника (Miltenyi Biotec). NK-клітини розмножували в повному середовищі RPMI1640 з додаванням 5,000 Од/мл rhIL-2 (Proleukin, Novartis) протягом 7 днів. Кількість клітин CD3−NK1.1+ оцінювали за допомогою проточної цитометрії в дні 0, 3, 5 і 7. На день 7 клітини лізували для аналізу Вестерн-блот. Для аналізу pSTAT5 106 спленоцитів стимулювали 50 нг/мл rmIL-15 (PeproTech) протягом 15 хвилин і клітини фіксували в 2% PFA з подальшою пермеабілізацією метанолом і регідратацією.

Аналіз цитотоксичності NK-клітин

Для аналізів цитотоксичності in vitro DX5-MACS-сортовані NK-клітини розмножували протягом 7 днів в IL-2, як описано вище, і змішували у вказаному співвідношенні ефектор:мішень із карбоксифлуоресцеїндіацетатсукцинімідиловим ефіром (CFSE, Molecular Probes). , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit), мічені клітини-мішені. Після 4 годин інкубації при 37 °C клітини фарбували Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer), а специфічний лізис клітин-мішеней оцінювали за допомогою проточної цитометрії.

Проточна цитометрія

Одноклітинні суспензії готували з селезінки, кісткового мозку або печінки. Печінку перфузували через ворітну вену 5–10 мл стерильного PBS. Поділ лімфоцитів проводили з використанням 37,5% персональних (GE Healthcare). Для аналізу крові еритроцити лізували за допомогою BD FACS Lysing Solution згідно з протоколом виробника (BD Bioscience). Антитіла (клони), націлені на такі білки, були придбані в eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) і Ter119 (TER-119). Антитіла CD49a (Ha31/8) і pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] були придбані в BD Pharminogen, а pan-Rae1 (186107) – у R&D Systems. Загальну кількість клітин оцінювали за допомогою проточної цитометрії з використанням лічильних кульок Count Bright Beads (Invitrogen). Експерименти з проточною цитометрією проводили на BD FACSCanto II (BD Bioscience) або Cytoflex (Beckman Coulter) і аналізували за допомогою програмного забезпечення BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) або FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

МАЛЮНОК 1|Втрата JAK1 у клітинах NKp46+ призводить до майже повної відсутності периферичних NK-клітин. (A) Частота (ліва панель) і загальна кількість (права панель) Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK-клітин у кістковому мозку були оцінені потоком цитометрія. (B) Клітини Lin−CD122+ кісткового мозку далі розділили на попередники NK (NKP: NKp46−NK1.1−), незрілі NK-клітини (iNK: NKp46−NK11+) і зрілі NK-клітини (mNK: NKp46+NK1.1+). (C) Частоту CD3−NKp46+ NK-клітин у селезінці оцінювали за допомогою проточної цитометрії та показують репрезентативні графіки. (D, E) Частота (ліва панель) і загальна кількість (права панель) CD3-NKp46+ NK-клітин у (D) селезінці та (E) крові були оцінені за допомогою проточної цитометрії. (F) Частота звичайних NK-клітин (CD3−NK1.1+NKp46+CD49b+, ліва панель) і клітин ILC1 (CD3−NK1.1+NKp46+CD49a+ , права панель) аналізували в печінці мишей Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre та Jak1fl/flNcr1Cre за допомогою проточної цитометрії. (A, B, D–F) Гістограми представляють середнє значення ± SEM 1–2 незалежних експериментів; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

МАЛЮНОК 2|Решта NK-клітин Jak1fl/flNcr1Cre демонструють незрілий фенотип. (A, B) CD3−NKp46+ NK-клітини селезінки аналізували на експресію CD27 та CD11b за допомогою проточної цитометрії. (A) Показано частоту клітин на кожній стадії дозрівання: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). Загальна кількість клітин на кожній стадії дозрівання показана на малюнку S1C. (B) Показані репрезентативні ділянки. (C) Клітини pSTAT5(Y694)+ аналізували в популяції CD3−NKp46+NK1.{1+ ex vivo після 15-хвилинної стимуляції IL-15 за допомогою проточної цитометрії. (D) CD3−NKp{{30}} NK-клітини селезінки аналізували на експресію зазначених активуючих та інгібуючих рецепторів за допомогою проточної цитометрії. Показано відсоток NK-клітин, позитивних для кожного рецептора. Дані медіанної інтенсивності флуоресценції представлені на малюнку S1D. (A–D) Гістограми та числа на графіках представляють середнє значення ± SEM 2 незалежних експериментів; n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Вестерн-блот

Клітинний лізис, SDS-PAGE та вестерн-блоти проводили, як описано раніше (21). Виявлення хемілюмінесценції проводили за допомогою субстрату Clarity Western ECL (BioRad) і ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) і аналізували за допомогою програмного забезпечення Image Lab (BioRad). Були використані наступні антитіла: анти– -актин (C4, sc-47778) із Санта-Крус як контроль навантаження, анти-JAK2 (D2E12; #3230), анти-Perforin (#3693) і анти-JAK1 (#3332) ) від Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Статистичний аналіз

Непарні t-тести або односторонній дисперсійний аналіз із пост-тестами Тьюкі проводили за допомогою GraphPad Prism версії 5.00 (програмне забезпечення GraphPad). Для кожного експерименту вказано рівень значущості (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0.001).

РЕЗУЛЬТАТИ

Видалення JAK1 зменшує кількість NK-клітин і ILC1 залежно від дози

Показано, що інгібітор JAK1/JAK2 Руксолітиніб зменшує кількість, дозрівання та функцію NK-клітин (14, 15). Щоб порівняти та розглянути внесок JAK1 та JAK2 у біологію клітин NK, ми створили мишей з умовною делецією JAK1 або JAK2 у клітинах NKp46+. Таким чином, ми схрестили мишей Ncr1Cre (18) з мишами Jak1fl/fl або Jak2fl/fl [див. розділ Матеріали та методи та (17)] відповідно. NK-клітини розвиваються в кістковому мозку з попередників NK-клітин (NKP), які визначаються як Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. Вони розвиваються в незрілі NK-клітини (iNK), які стають NK1.1+, тоді як лише зрілі NK-клітини (mNK) є NK1.1+NKp46+ (22). Оскільки експресія рекомбінази Cre у мишей Ncr1Cre керується промотором NKp46, опосередкована Cre делеція обмежена NK-клітинами. Ми спостерігали значне зниження відсотка та загальної кількості NK-клітин кісткового мозку у мишей Jak1fl/flNcr1Cre (рис. 1A). NK-клітини Lin−CD122+ у мишей Jak1fl/flNcr1Cre продемонстрували підвищений відсоток попередників NK-клітин (NKP) і незрілих NK-клітин, тоді як mNK було значно зменшено в кістковому мозку відповідно до блоку розвитку клітин iNK стадія запобігання прогресуванню до стадії mNK-клітин (рис. 1B). Делеція одного алеля Jak1 призвела до проміжної кількості NK-клітин кісткового мозку (рис. 1A). Відповідно, розвиток NK-клітин показав проміжний фенотип, що свідчить про вплив дозування гена Jak1 на розвиток NK-клітин (рис. 1B). Блокування розвитку NK-клітин кісткового мозку призвело до різкого зниження кількості NK-клітин на периферії. Втрата JAK1 призвела до майже повного дефіциту NK-клітин селезінки та крові (рис. 1C–E). Відповідно до ефекту дозування гена Jak1, у мишей Jak1fl/+Ncr1Cre відсоток і загальна кількість NK-клітин зменшилися до 50% порівняно з однопомітними тваринами дикого типу в селезінці та крові (рис. 1C–E). Видалення нижнього ефектора JAK1 і фактора транскрипції STAT5 у клітинах NKp46+ також призводить до зменшення кількості зрілих NK-клітин (18). Пряме порівняння мишей Jak1fl/flNcr1Cre та Stat5fl/flNcr1Cre показало, що делеція JAK1 спровокувала ще більш виражений дефіцит NK-клітин у селезінці та крові, ніж делеція STAT5 (рисунки S1A, B). Вроджені лімфоцити печінки NKp46+ складаються з двох груп різних ліній (23). Звичайні NK-клітини (cNK) характеризуються експресією CD49b і вільно циркулюють, тоді як вроджені лімфоцити 1 типу (ILC1) характеризуються експресією CD49a та обмежені печінкою (24). Подібно до селезінки та крові, cNK печінки та тканинно-резидентні ILC1 були майже повністю видалені після втрати JAK1 (рис. 1F). Знову делеція одного алеля Jak1 призвела до проміжної кількості вроджених лімфоцитів печінки (рис. 1F). Підсумовуючи, ці результати привели нас до висновку, що експресія JAK1 у клітинах NKp46+ необхідна для розвитку та підтримки NK-клітин у периферичних органах залежно від дози.

JAK1 має вирішальне значення для дозрівання NK-клітин

На периферії NK-клітини проходять етапи дозрівання, які характеризуються послідовною експресією поверхневих маркерів CD27 і CD11b (22). Одного алеля Jak1 було достатньо для стимулювання дозрівання клітин NK, оскільки ми не виявили жодних відмінностей у відсотках клітин на кожній стадії дозрівання між клітинами Jak1WT і Jak1fl/+Ncr1Cre (рис. 2A, B). Решта NK-клітин Jak1fl/flNcr1Cre показала збільшення незрілої популяції (CD27+CD11b−) і зменшення зрілої популяції CD27−CD11b+ (рис. 2A, B і рис. S1C). Цей результат свідчить про те, що клітини, які залишилися, могли просто втратити JAK1 і не отримали достатньо сигналу IL-15 для повного дозрівання. Дійсно, решта Jak1fl/flNcr1Cre NK-клітин продемонструвала знижене фосфорилювання STAT5 ex vivo після короткочасної стимуляції IL-15 (рис. 2C). Активність NK-клітин контролюється балансом між активуючими та інгібуючими рецепторами. Видалення ні одного, ні обох алелів Jak1 не вплинуло на відсоток NK-клітин, що експресують такі активуючі та інгібуючі рецептори: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E та Ly49A (рис. 2D). Найпомітнішою відмінністю було незначне зниження NK-клітин Ly49G2+ і збільшення NK-клітин DNAM-1+ у мишей Jak1fl/flNcr1Cre (рис. 2D). Подібним чином не було виявлено серйозних відмінностей у рівні експресії (MFI) кожного рецептора, крім збільшення MFI DNAM1 і Ly49G2 (рис. S1D). Окрім ролі рецептора активації, експресія DNAM- 1 знаменує крок у розвитку; Клітини DNAM-1+ утворюють клітини DNAM-1− (25). Ми припустили, що зміни в ДНК-1+ відображають блок дозрівання NK-клітин Jak1fl/flNcr1Cre.

МАЛЮНОК 3|JAK2 необхідний для виживання та дозрівання NK-клітин. (A) Частота (ліва панель) і загальна кількість (права панель) CD3-NKp46+ NK-клітин у селезінках мишей Jak2WT і Jak2fl/flNcr1Cre оцінювали за допомогою проточної цитометрії. (B) CD3−NKp46+ NK-клітини селезінки аналізували на експресію CD27 та CD11b за допомогою проточної цитометрії. Показано частоту клітин на кожній стадії дозрівання: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) Експресію JAK2 і -актину аналізували за допомогою вестерн-блоттингу в клітинах NK після 6 днів експансії в IL-2. Сканування повних плям доступні в Додатковому матеріалі. (A,B) Гістограми представляють середнє значення ± SEM 2–3 незалежних експериментів; n=5–12.

МАЛЮНОК 4|Втрата одного алеля Jak1 порушує активність NK-клітин. (A) NK-клітини очищали за допомогою MACS із селезінок і культивували в IL-2 протягом 7 днів. Кількість живих клітин CD3−NK1.1+NKp46+ оцінювали кожні 2–3 дні. Символи та смуги похибок представляють середнє значення ± SEM для 2–4 біологічних повторів. (B) Експресію JAK1, перфорину та -актину аналізували в розширених NK-клітинах у двох незалежних експериментах за допомогою вестерн-блоттингу. Сканування повних плям доступні в Додатковому матеріалі. (C) Розширені NK-клітини мишей Jak1WT і Jak1fl/+Ncr1Cr змішували з пофарбованими CFSE клітинами-мішенями YAC{{20}} (ліва панель) або RMA-Rae1 (права панель) у вказаних ефекторних цільових співвідношеннях . Специфічний лізис оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Для YAC-1 показано типовий графік одного з двох незалежних експериментів. Символи та смуги помилок представляють середнє значення ± SEM 2 технічних повторів. Для RMA-Rae1 показано середнє значення з двох незалежних експериментів. Символи та смуги похибок представляють середнє значення ± SEM для 2–3 біологічних повторів. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 необхідний для виживання та дозрівання NK-клітин

На даний момент ми показали, що притаманна NK-клітинам делеція JAK1 призводить до дефіциту NK-клітин. Щоб з’ясувати, чи впливає JAK2 на виживання та дозрівання NK-клітин, ми проаналізували NK-клітини селезінки у мишей Jak2fl/flNcr1Cre та їхніх однопослідників дикого типу. Нам не вдалося виявити жодного впливу делеції JAK2 на частоту або загальну кількість клітин CD3−NKp46+ у селезінці (рис. 3A). Крім того, миші Jak2fl/flNcr1Cre продемонстрували нормальне дозрівання NK-клітин, оскільки в обох генотипах були виявлені однакові відсотки клітин CD27−CD11b+ (рис. 3B). Оскільки видалення білка JAK2 у NK-клітинах було дуже ефективним (рис. 3C), ці дані однозначно визначають, що на відміну від JAK1, властивий NK-клітинам JAK2 необхідний для виживання та дозрівання NK-клітин.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Втрата одного алеля Jak1 погіршує функціональність NK-клітин

Щоб отримати подальше розуміння того, як JAK1 регулює функціональність NK-клітин, ми проаналізували ріст очищених MACS NK-клітин селезінки з Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre та Jak1fl/flNcr1Cre. JAK1-дефіцитні NK-клітини не розширювалися, що показує, що навіть за дуже високої дози IL-2 інші JAK не можуть компенсувати втрату JAK1 (Малюнок 4A). Втрата одного алеля Jak1 призвела до незначного дефіциту росту (рис. 4A). Вестерн-блот-аналіз підтвердив знижену експресію білка JAK1 у розширених NK-клітинах Jak1fl/+Ncr1Cre, що супроводжувалося зниженням рівня перфорину (рис. 4B). Відповідно, NK-клітини Jak1fl/+Ncr1Cre демонстрували знижену цитотоксичну активність проти цільових клітинних ліній YAC-1 і RMA-Rae1 (рис. 4C). Ці результати доводять, що JAK1 не тільки незамінний для підтримки NK-клітин на периферії, але також сприяє їх цитотоксичній активності.

Вичерпання NK-клітин, спричинене втратою одного алеля Jak1, погіршує спостереження за пухлинами

NK-клітини мають вирішальне значення для раннього розпізнавання та елімінації трансформованих клітин. Щоб дослідити, чи призводить зменшення NK-клітин та їх порушення функціональності у мишей Jak1fl/+Ncr1Cre до підвищеної сприйнятливості до росту пухлини та не компенсується іншими засобами, ми використали клітини лімфоми RMA-Rae1. Ця клітинна лінія є інструментом для надійного та ефективного дослідження залежного від NK-клітин спостереження за пухлиною (20). Ми підшкірно трансплантували клітини лімфоми RMA-Rae1 в обидва боки мишей Jak1fl/+ і Jak1fl/+Ncr1Cre. Відсутність одного алеля Jak1 погіршує здатність NK-клітин контролювати ріст пухлини, як показано збільшенням розміру пухлини (Малюнок 5A) і маси пухлини в Jak1fl/+Ncr1Cre (Малюнок 5B). Відповідно, ці пухлини продемонстрували значно знижену інфільтрацію NK-клітин (рис. 5C, D). Нам не вдалося виявити будь-яку різницю в частоті NKG2D+ інфільтрованих NK-клітин (рис. 5E), які є вирішальними для розпізнавання пухлин RMA-Rae1. Підводячи підсумок, наші результати показують, що зменшена кількість NK-клітин у поєднанні з порушенням функціональності NK-клітин у мишей Jak1fl/+Ncr1Cre є достатніми для значного погіршення контролю росту пухлини in vivo.

МАЛЮНОК 5|Втрата одного алеля Jak1 погіршує спостереження за пухлиною. (A, B) Мишам Jak1fl/+ і Jak1fl/+Ncr1Cre підшкірно вводили 106 клітин RMA-Rae1 і через 10 днів оцінювали вагу пухлини. Показано (A) характерні зображення пухлини та (B) точкові графіки з горизонтальними лініями, що представляють середню вагу пухлини ± SEM з 2 незалежних експериментів; n=6–8 (C, D) NK-клітини, інфільтровані пухлиною, аналізували за допомогою проточної цитометрії. (C) Показано репрезентативні графіки клітин CD3−NKp46+, що інфільтрують пухлину, та їх відсоток серед клітин Rae1−. (D) Загальна кількість клітин CD3−NKp46+, що інфільтрують пухлину, на грам пухлини та (E) відсоток NKG2D+ NK-клітин представлені у вигляді стовпчастих діаграм, що показують середнє значення ± SEM з одного експерименту n=4– 5. ***p <0,001.

ДИСКУСІЯ

Порушення регуляції сигнального шляху JAK-STAT тісно пов’язане з розвитком раку, а також з імунними порушеннями (7). Першим виявленим захворюванням, пов’язаним з JAK, був важкий комбінований імунодефіцит (SCID), який характеризувався аномаліями NK-клітин, викликаними мутаціями LOF JAK3 (26, 27). Тут ми показуємо, що видалення JAK1 у клітинах NKp46+ призводить до вродженого імунодефіциту з втратою клітин NK та ILC1 у периферичних органах, тоді як JAK2 є надлишковим для виживання та дозрівання NK-клітин. Наша попередня робота виявила, що втрата STAT5 у NK-клітинах призводить до серйозного зменшення кількості NK-клітин у периферичних органах (18). Втрата NK-клітин у мишей Stat5fl/flNcr1Cre була врятована примусовою експресією молекули BCL2, що сприяє виживанню (28). Це дослідження визначило STAT5 як вирішальний фактор виживання NK-клітин. У мишей із дефіцитом STAT5B переважно відсутні NK-клітини (29), що відповідає тому факту, що STAT5 передає сигнали нижче за течією цитокінів, які є життєво важливими для біології NK-клітин, таких як IL-2 або IL-15 (30). IL-15 має вирішальне значення для розвитку та виживання NK-клітин, оскільки миші Il15−/− здебільшого позбавлені периферичних NK-клітин (31). IL-15 передає сигнали через рецепторний комплекс рецепторного ланцюга c, IL-2R та IL-15r (32). Миші з нокаутом кожного рецепторного ланцюга доводять абсолютно вирішальну роль для сигналів, що надсилаються нижче за течією IL-15 для розвитку NK-клітин (33, 34). На сьогоднішній день внесок c-асоційованого JAK3 у розвиток NK-клітин добре встановлений. Миші з дефіцитом JAK3 демонструють подібний фенотип SCID, як і у пацієнтів-людей, і розвиток NK-клітин блокується на стадії перед NK-попередниками (35, 36). Тепер ми вважаємо раніше недооцінений JAK1 важливою частиною осі IL-15/STAT5 у клітинах NK. NK-клітини Jak1fl/flNcr1Cre демонструють блокування розвитку на стадії iNK-клітин і майже повну втрату NK-клітин у периферичних органах.

Цікаво, що наслідки видалення JAK1 для NK-клітин перевищують наслідки дефіциту STAT5-. Порушення комбінованої активації STAT3 і STAT5 може лежати в основі більш вираженої втрати NK-клітин, оскільки було показано, що STAT3 індукує експресію важливого гена виживання NK-клітин Mcl1 (37, 38). Крім того, JAK1 і STAT5 можуть мати різні періоди напіврозпаду, що пояснює різну частоту «просто делетерів» — NK-клітин, які щойно втратили ген, але все ще несуть білок, що може пояснити відмінності. Ефект генної дози дефіциту JAK1-відбивається на кількості NK-клітин, у той час як втрата одного алеля JAK1 не потрібна для дозрівання NK-клітин. Це свідчить про те, що активований STAT5 обмежує швидкість виживання NK-клітин, але не дозрівання. Видалення одного алеля Jak1 також достатньо для значного погіршення спостереження за пухлиною на основі зменшення кількості NK-клітин у поєднанні зі зниженою функціональністю решти NK-клітин. Згідно з нашими даними, специфічна для NK-клітин делеція цільового гена STAT5 Mcl1 призводить до серйозного дефіциту NK-клітин, що спричиняє значне збільшення метастатичного тягаря (38).

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

JAK можуть демонструвати надлишкові функції та компенсувати один одного. Нижче за течією рецептора інтерферону JAK1 може частково компенсувати втрату активності кінази JAK2 (39). Також було показано, що JAK2 фосфорилює STAT5 нижче IL-15 під час диференціювання NK-клітин in vitro (16). З іншого боку, конститутивно активний JAK2 може лише помірно компенсувати втрату JAK1 у стовбурових клітинах, що свідчить про ненадлишкову роль JAK1 та 2 у HSC. Таким чином, ми спостерігаємо, що за відсутності JAK1, JAK2 не в змозі компенсувати активацію STAT5, навіть за високої дози IL-2 in vitro, щоб забезпечити виживання NK-клітин. Залишається з'ясувати, чи можна досягти компенсаторних ефектів шляхом експресії конститутивно активної форми JAK2. Що ще важливіше, ми показуємо, що втрата JAK2 у клітинах NKp46+ необхідна для виживання клітин NK. NK-клітини з дефіцитом JAK2- є повністю зрілими, що доводить, що JAK2, властивий NK-клітинам, не сприяє дозріванню NK-клітин. Це також вказує на те, що порушення дозрівання NK-клітин у мишей Jak2fl/flMx1Cre (14), швидше за все, спричинене зовнішніми функціями JAK2 для NK-клітин. Можна припустити, що конститутивна делеція JAK2 змінює цитокінове середовище.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Природні клітини-кілери: розвиток, дозрівання та клінічне використання. Передній імунол. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Помаранчевий Дж.С. Дефіцит природних клітин-кілерів. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK і STAT сигнальні молекули в імунорегуляції та імуноопосередкованих захворюваннях. Імунітет (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Старк Г.Р., Дарнелл Дж.Е. Шлях JAK-STAT у двадцять. Імунітет (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Шуай К., Лю Б. Регулювання сигналізації JAK-STAT в імунній системі. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900-11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK і STAT в імунітеті, імунодефіциті та раку. N Engl J Med. (2013) 368:161-70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Регуляція JAK у передачі сигналів цитокінів та їх розпад під час захворювання. Цитокін (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [Epub перед друком].

8. Лорензіні Т., Дотта Л., Джакомеллі М., Вайро Д., Бадолато Р. Мутації STAT як перемикачі програм: перетворення первинних імунодефіцитів в аутоімунні захворювання. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G та ін. Jak1 відіграє домінуючу роль над Jak3 у передачі сигналу через с-вмісні цитокінові рецептори. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Елетто Д., Бернс С.О., Ангуло І., Планьоль В., Гілмор К.С., Енрікес Ф. та ін. Двіалельні мутації JAK1 у пацієнта з імунодефіцитом і мікобактеріальною інфекцією. Нац комун. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD та ін. Порушення гена Jak1 демонструє обов'язкову та ненадмірну роль Jaks у індукованих цитокінами біологічних реакціях. Cell (1998) 93:373–83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E та ін. Jak1 Інтегрує визначення цитокінів для регулювання функції гемопоетичних стовбурових клітин і стресового кровотворення. Клітинна стовбурова клітина (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Шварц Д.М., Канно Ю., Вілларіно А., Уорд М., Гадіна М., О'Ші Дж.Дж. Інгібування JAK як стратегія лікування імунних та запальних захворювань. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A та ін. Зниження імунного контролю пухлини NK-клітин внаслідок інгібування JAK посилює метастази в моделях раку молочної залози. Нац комун. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Шенберг К., Рудольф Дж., Воннахме М., Парампаллі Яджнанараяна С., Корнез І., Хеджазі М. та ін. Інгібування JAK порушує функцію NK-клітин у мієлопроліферативних новоутвореннях. Cancer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Кім В.С., Кім М.Дж., Кім Д.О., Б’юн Д.Є., Х’ю Х., Сонг Х.Й. та ін. Супресор передачі сигналів цитокінів 2 негативно регулює диференціювання NK-клітин шляхом інгібування активності JAK2. Sci Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Кремплер A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Генерація умовного нокаутного алеля для гена Янус-кінази 2 (Jak2) у мишей. Буття (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T та ін. Нова миша Ncr1 -Cre розкриває важливу роль STAT5 для виживання та розвитку NK-клітин. Кров (2011) 117:1565–74. doi: 10.1182/кров-2010-06-291633

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C та ін. Інактивація Stat5 в епітелії молочної залози миші під час вагітності виявляє відмінні функції клітинної проліферації, виживання та диференціювання. Mol Cell Biol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Ектопічна експресія раннього індуцибельного гена ретиноєвої кислоти -1 (RAE-1) дозволяє опосередковане природними клітинами-кілерами відторгнення пухлини, що містить MHC клас I, in vivo. Proc Natl Acad Sci США. (2001) 98:11521-6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A та ін. CDK8-опосередковане STAT1-S727 фосфорилювання стримує цитотоксичність NK-клітин і спостереження за пухлинами. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Гейгер Т.Л., Сан Дж.К. Розвиток і дозрівання природних клітин-кілерів. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, et al. Резидентні природні клітини-кілери (NK) — це лінії клітин, відмінні від NK-клітин тимуса та звичайних селезінкових NK-клітин. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X та ін. Резидентні NK-клітини печінки надають адаптивний імунітет при контактному запаленні шкіри. J Clin Invest. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Мартіне Л., Феррарі Де Андраде Л., Гіллерей К., Лі Дж.С., Лю Дж., Соуза-Фонсека Гімараес Ф. та ін. Вираз DNAM-1 позначає альтернативну програму дозрівання NK-клітин. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F, et al. Мутації гена Jak-3 у пацієнтів з аутосомним важким комбінованим імунодефіцитом (ТКІД). Природа (1995) 377 (6544): 65–8.

27. Рассел С. М., Тайєбі Н., Накадзіма Х., Ріді М. С., Робертс Дж. Л., Аман М. Дж. та ін. Мутація Jak3 у пацієнта з SCID: істотна роль Jak3 у розвитку лімфоїдів. Наука (1995) 270:797–800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P, et al. STAT5 є ключовим регулятором у NK-клітинах і діє як молекулярний перемикач від спостереження за пухлиною до стимулювання пухлини. Рак Discov. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino A V., Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW та ін. Визначені підгрупою та тканинами порогові значення STAT5 контролюють гомеостаз і функцію вроджених лімфоїдних клітин. J Exp Med. (2017) 214:2999-3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Регулювання розвитку та функції NK-клітин миші за допомогою цитокінів. Передній імунол. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, et al. Оборотні дефекти природних кілерів і ліній Т-клітин CD8 у мишей із 15-дефіцитом інтерлейкіну. J Exp Med. (2000) 191:771–80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ікемізу С, Чіріфу М, Девіс С.Дж. Сигнальні комплекси IL-2 та IL-15: різні, але однакові. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, et al. Диференціювання природних клітин-кілерів: розуміння нокаутних і трансгенних моделей мишей і систем in vitro. Immunol Rev. (1998) 165:47–61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S та ін. Рецептор IL-15 підтримує лімфоїдний гомеостаз, підтримуючи хоумінг і проліферацію лімфоцитів. Імунітет (1998) 9:669–76.

35. Парк С.Й., Сайджо К., Такахаші Т., Осава М., Арасе Х., Хіраяма Н. та ін. Дефекти розвитку лімфоїдних клітин у мишей з дефіцитом кінази Jak3. Імунітет (1995) 3:771–82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K та ін. Дефіцит Jak3 блокує вроджений розвиток лімфоїдних клітин. Мукозальний імунол. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD та ін. Сорафеніб сенсибілізує солідні пухлини до антитіл до агоністів рецепторів Apo2L/TRAIL і Apo2L/TRAIL за допомогою осі Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ та ін. Вроджений імунодефіцит після генетичної абляції Mcl1 у природних клітинах-кілерах. Нац комун. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B, et al. Важлива каркасна функція Янус-кінази 2, виявлена ​​новою моделлю миші, що містить мутацію циклу активації Jak2. Кров (2014) 123:520–9. doi: 10.1182/кров-2013-03-492157