Ламівудин покращує зниження когнітивних функцій у мишей SAMP8: інтеграція фармакологічної оцінки in vivo та мережевої фармакології

Таксол Альтернатива китайським травам Цистанхея

Ключові слова:Aspergillus favus · Жожоба · Ендофітні гриби · Наночастинки золота · Таксол · -Опромінення · Оптимізація харчування

вступ

Таксол є одним з найбільш комерціалізованих препаратів широкого спектру діїпротипухлинні препарати[1]. Активність таксолу пояснюється його унікальною специфічністю зв’язування з гетеродимером субодиниць клітинного тубуліну, що сприяє полімеризації тубуліну, таким чином порушуючи мітотичний поділ пухлинних клітин [2]. Таксол продемонстрував сильну активність проти раку молочної залози, легенів, голови та шиї, раку матки та прогресуючих форм саркоми Капоші [3]. Таксол вперше був отриманий з кори тиса Taxus brevifolia «родини Taxaceae» [4, 5]; однак нижчий вихід таксолу<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as астма,запалення, ірак[32]. Таким чином, основною метою цієї роботи було дослідити новий ізолят грибів із рослини жожоба з унікальною метаболічною стабільністю для виробництва таксолу, оцінити різні підходи для максимізації їхнього виходу таксолу, а також підвищити антипроліферативну активність екстрагованих сполук таксолу. через кон'югацію з наночастинками золота за допомогою гамма-опромінення.

Матеріал і методи

Виділення та культивування ендофітних грибів

Різні частини жожоба (Simmondsia chinensis) у вигляді листя, кори, гілок і бруньок були зібрані на факультеті сільського господарства Каїрського університету та використані як джерело ендофітних грибів. Частини рослин збирали та промивали під проточною водою, поверхню стерилізували 70% етанолом протягом 1 хв, а потім промивали стерильною водою [28]. Поверхнево простерилізовані частини рослин нарізали на дрібні шматочки в стерильних умовах і поміщали на чашки з середовищем картопляного декстрозного агару (PDA), Чапека-Докса та агаризованого середовища з екстрактом солоду [33–36], і пластини інкубували при 30 градусах протягом 10 днів. Ефективність поверхневої стерилізації частин рослини оцінювали центрифугуванням промивної води, потім до осаду додавали 500 мкл стерильної води та висівали в середовище PDA [37]. Очищені ізоляти ендофітних грибів інокулювали на скошені пластини КПК протягом 7 днів і зберігали при 4°С.

Скринінг, екстракція та кількісне визначення таксолу з ендофітних грибів

Відновлені ендофітні гриби, що населяють жожоба, перевіряли на продукцію таксолу шляхом вирощування на картопляному декстрозному бульйоні (PDB) [38]. Одну пробку кожного з 7-денних ізолятів грибів інокулювали в 100 мл PDB/250 мл ерленмейєрівських розчинів, інкубували протягом 15 днів при 30±1° в умовах струшування (120 об/хв). Після інкубації культури фільтрували, і фільтрат доповнювали 0,2% бікарбонатом натрію для осадження жирних кислот. Таксол екстрагували дихлорметаном, органічну фазу збирали і випарювали насухо, а залишки повторно розчиняли в метанолі [17, 39]. Таксол відокремлювали та ідентифікували за допомогою ТШХ, використовуючи пластини Merck із попередньо покритим силікагелем розміром 1 мм (20 × 20 см) (ТСХ Силікагель 60 F254, Дармштадт, Німеччина), детектували УФ-опроміненням при 254 нм [39]. Передбачувані плями таксолу зіскрібали з пластин силікагелю ТШХ і розчиняли в метанолі, енергійно перемішували протягом 10 хвилин і центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 хвилин. Обложені частинки кремнезему видаляли, а супернатант відбирали для кількісного визначення таксолу та перевірки чистоти за допомогою ВЕРХ (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Корея) колонки з оберненою фазою C18 (Eclipse Plus C18 4).6 ×150 мм, 3,5 мкм, кат. № 959,963–902). Рухомою фазою використовували метанол/ацетонітрил/вода (25:35:40, об./об./об.) зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв протягом 20 хв [40], а фракції таксолу вимірювали при 227 нм, а їх хімічна ідентичність і концентрації були підтверджені за часом утримування і площею піку поглинання в порівнянні з автентичним зразком.

Морфологічна та молекулярна ідентифікація відновлених ендофітних грибів

Ізоляти ендофітних грибів були ідентифіковані до їх видових рівнів на основі їхніх макро- та мікроморфологічних особливостей шляхом вирощування на PDA, Czapek's-Dox та середовищі з екстрактом солоду відповідно до довідкових ключів [33–36]. Ідентичність найпотужніших ізолятів грибів, що продукують таксол, була додатково молекулярно підтверджена на основі послідовності внутрішнього транскрибованого спейсера (ITS) [41, 42]. Грибну геномну ДНК (gDNA) екстрагували шляхом подрібнення міцелію (~0.2 г) у рідкому азоті, потім розподілення в 1 мл буфера для екстракції CTAB (2% CTAB, 2% PVP40, { {21}}.2 відсотка 2-меркаптоетанолу, 20 мМ EDTA, 1,4 М NaCl в 100 мМ трис-HCl, pH 8,0). Набори праймерів для ПЛР були ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ та ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Реакція ПЛР містить 10 мкл основної суміші 2 × ПЛР (i-Taq™, кат. № 25027), 2 мкл гДНК, 1 мкл кожного праймера (10 пмоль/мкл) і доведена до 20 мкл стерильною дистильованою води. ПЛР була запрограмована на початкову денатурацію при 94 градусах протягом 2 хвилин, денатурацію при 94 градусах протягом 30 секунд, відпал при 55 градусах протягом 10 секунд, розширення при 72 градусах протягом 30 секунд протягом 35 циклів і остаточне розширення при 72 градусах протягом 2 циклів. хв. Амплікони ПЛР аналізували за допомогою 1,5-відсоткового агарозного гелю в буфері 1 × TBE (Ambion Cat # AM9864), використовуючи сходи ДНК розміром 1 кб (Cat. # PG010-55DI) і візуалізували за допомогою системи документування гелю. Амплікони очищали та секвенували за допомогою секвенатора Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, версія 6.0 з тими самими наборами праймерів. Отримані послідовності були здійснені без надлишкового пошуку BLAST у базі даних NCBI, імпортовані в програмне забезпечення MEGA 6.0 та узгоджені з м’язовим алгоритмом Clustal W [43], а філогенетичне дерево було побудовано за допомогою методу приєднання сусідів MEGA 6.0 [44].

Хімічна структура екстрагованого таксолу

Передбачувані плями таксолу зіскрібали з пластин силікагелю ТШХ і очищали, а чистоту та концентрацію визначали аналізом УФ-видимого діапазону при λ 227 нм (RIGOL, серія Ultra-3000) порівняно з автентичним таксолом. [39]. Порожні середовища за тих самих умов використовували як негативну базову лінію для спектрофотометричного аналізу. Спектр FT-IR очищених зразків таксолу аналізували за допомогою спектрофотометра JASCO FT-IR 3600. Зразок таксолу подрібнювали з гранулами KBr, пресували у диски під вакуумом і вимірювали поглинання в області 400–4000 см−1 [3] порівняно з автентичним. Хімічна структура екстрагованого таксолу була підтверджена спектроскопією ЯМР (JEOL, ECA-500II, 500 МГц ЯМР) у порівнянні з автентичним таксолом. Зразки розчиняли в CDCl3, хімічні зсуви наведені в ppm (δ-шкала), а константи зв’язку виражені в герцах (Гц).

Вплив різних типів середовищ на виробництво таксолу

Дві пробки агару (9 мм) із 7-денних культур кожного грибкового ізоляту посівали в трьох примірниках у 100 мл середовища/250 мл колбу Ерленмейєра картопляної декстрози (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D та солодового екстракту (ME). ) бульйонне середовище. Неінокульовані контролі з кожного середовища, які не містять грибкових спор, використовували як негативний контроль, інкубували при 30 градусах протягом 15 днів у тих самих умовах. Після інкубації культури грибів фільтрували, а таксол екстрагували та визначали, як зазначено вище.

Біопроцесна оптимізація умов харчування для максимізації виходу таксолу

Оптимізацію складу середовища для максимізації виходу таксолу потужним ізолятом грибів проводили за методологією поверхні відгуку з використанням дизайну Плакета-Бермана з подальшим центральним композитним дизайном [17–20, 45]. З дизайну RSM позитивні та значущі змінні, що впливають на продукцію таксолу потужним грибковим ізолятом, оцінювали за допомогою пакета статистичного програмного забезпечення Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Міннеаполіс, США). Кожен експеримент проводили в трьох біологічних повторах і враховували середні значення. Після інкубації в бажаних умовах біомасу грибів фільтрували, а таксол екстрагували та кількісно визначали за допомогою ТШХ і ВЕРХ, як описано вище.

Дизайн Placket-Burman

План Плакет-Бермана часто використовувався для оптимізації компонента середовища для росту грибів і виробництва біоактивних вторинних метаболітів, оцінюючи важливі змінні, що впливають на виробництво таксолу [18, 20, 46]. Вибір фактора ґрунтувався на середовищах, які використовувалися для якісного та кількісного скринінгу. Було включено одинадцять факторів; солодовий екстракт, пептон, сахароза, сойтон, глутамін, екстракт яловичини, а також значення та фактори температури, pH, часу інкубації та швидкості струшування змінювалися на двох рівнях, а також були обрані діапазони мінімального та максимального рівнів. Статистичний Design-Expert 7.0 використовувався для створення набору з 12 експериментів. Для кожного експерименту виробництво таксолу визначали в трьох біологічних повторах і враховували середній вихід таксолу.

Регресійний аналіз даних проводився за допомогою статистичного програмного забезпечення. Вплив кожної змінної було розраховано (Biometrika, 2020) за допомогою наступного рівняння:

де E — вплив змінної тестування, M плюс і M− — концентрація таксолу в дослідах, коли параметр був на вищому та нижчому рівнях відповідно, а N — кількість проведених експериментів. Вплив кожної змінної на виробництво було визначено шляхом розрахунку відповідних E-значень.

Де Tot high — це загальна кількість відповідей на високому рівні, Tot low — це загальна кількість відповідей на низькому рівні, а No — це кількість проб.

Центральний композитний дизайн і взаємодія між факторами, що впливають на виробництво таксолу

Найбільш значущі позитивні фактори, що впливають на продукцію таксолу вибраним ізолятом гриба, були оптимізовані за допомогою експериментального дизайну моделі ПЗС типу поверхні відгуку [47]. Використовуючи CCD, концентрації компонентів середовища були оптимізовані, а їх досліджувані взаємодії були використані для створення загалом 20 експериментів для трьох змінних. Для визначення оптимальних рівнів змінних для виробництва таксолу із сильнодіючого грибкового ізоляту, тривимірні (3D) поверхневі криві реакції були побудовані для вивчення взаємодії між різними факторами та визначення змінного стану кожного фактора, що впливає на виробництво таксолу. Тривимірні графіки були створені шляхом утримання констант трьох факторів на ідеальному рівні та побудови отриманої відповіді виходу таксолу для різних рівнів двох інших факторів.

Вплив гамма-опромінення на вихід таксолу

Потужні ендофітні ізоляти, що продукують таксол, піддавали опроміненню джерелом 60кобальту (гамма-клітина 4000-A-Індія) при різних дозах гамма-випромінювання (0.25–3.0 кГр) у порівнянні до контролю неопромінених культур; потужність дози 1,2 кГр/год на момент експериментів. Оптимізоване середовище було засіяно опроміненою культурою за стандартних культуральних умов у порівнянні з інокулятом неопромінених спор як контроль. Культури інкубували при 30±2° протягом 15 днів на роторному шейкері (120 об/хв). Після інкубації культури фільтрували, а таксол екстрагували, очищали та кількісно визначали за допомогою ТШХ і ВЕРХ, як описано вище.

Синтез і характеристика наночастинок золота (AuNPs); Кон'югація з таксолом

Протиракова активність таксолу

Активність очищених таксолу та кон’югатів таксол-PVP-AuNPs проти карциноми печінки (HPG2) і карциноми молочної залози (MCF7) визначали 3- (4,5-диметилтіазол- 2-іл) Аналіз -2,5-дифенілтетразолію броміду (MTT) [48]. Планшет із 96-лунками засівали 103 клітинами на лунку та інкубували протягом ночі при 37°C, потім додавали різні концентрації препарату та планшети повторно інкубували протягом 48 годин. Додавали реагент МТТ (25 мкл) та інкубували протягом 2 годин, і фіолетове забарвлення розробленого формазанового комплексу вимірювали при λ570 нм. Значення IC50 виражали кількістю препарату, що зменшує ріст на 50 відсотків від початкової кількості пухлинних клітин, що нормалізується до позитивного контролю.

Антимікробна активність таксолу та кон’югатів таксол-AuNPs

Протимікробну активність таксолу та кон’югатів таксол-AuNPs оцінювали проти різних бактеріальних ізолятів; Bacillus subtilis ATCC 6633 і Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli та Enterobacter agglomerans на додаток до Candida albicans. Досліджувані бактеріальні клітини суспендували в стерильній пептонній воді з отриманням стандартного інокулята ~0.5 McFarland (1–1,5) × 1{{10}}8 КУО/мл при λ6{{18 }}0 нм. Пригнічення росту (мм) мікробних збудників оцінювали методом дифузії дисків у агарі. Як позитивний контроль використовували стерильні стандартні антибіотичні диски діаметром 6,0 мм. Стерильні диски з антибіотиками (6,0 мм) завантажували 20 мкл метанолу та амоксицилін-клавуланової кислоти (AMC) як негативний і позитивний контроль. Диски завантажували однаковою концентрацією таксолу, таксол-PVP-AuNP та AuNP (1,0 мкг/мл). Було підготовлено три біологічні повтори. Планшети інкубували при 37°С протягом 24 годин і вимірювали зони інгібування. Для нормалізації антимікробної активності таксолу використовували амоксицилін клавуланову кислоту (АМК) та ністатин. Зону пригнічення росту визначали штангенциркулем (мм).

Статистичний аналіз

Морфологічна та молекулярна ідентифікація потужних продуцентів таксолу

Морфологічні ознаки сильнодіючого грибкового ізоляту, що продукує таксол, досліджували відповідно до макроскопічних і мікроскопічних описових ключів, як описано в матеріалах і методах, і виявили його морфологічну близькість до A. favus (рис. 2). Ізолят грибів вирощували на КПК при 30 градусах протягом 10 днів, і макроскопічні та мікроскопічні характеристики показали його ідентичність, наприклад конідіальні головки, спосіб розгалуження, ідентичність стигми та конідіальну онтологію, а також утворення плодових тіл відповідно до універсальних морфологічні ключі [33], і було виявлено, що вони ідентичні Aspergillus favus. Потужний ізолят A. favus, що продукує таксол, було додатково ідентифіковано на основі його ITS-послідовностей, використовуючи гДНК як матрицю. Амплікони ПЛР (~550 bp) A. favus були розділені, очищені та секвеновані (рис. 2). Послідовність ITS A. favus була проведена безнадлишковий пошук у базі даних NCBI, показуючи 99-відсоткову схожість з A. favus, з нульовими значеннями E. та 95-відсотковим покриттям запиту. Таким чином, за результатами мікроскопічного та молекулярного аналізів було підтверджено, що цільовий ізолят є A. favus і зберігається в GenBank з інвентарним номером MW485934.1, а також ізолят зберігається в Мікологічному центрі Асьютського університету (AUMC), Єгипет з депозитний номер AUMC13892. Поточний ізолят мав 99 відсотків схожості з ізолятами A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Рис. 1 Морфологічний вигляд рослини жожоба. B Культури потужних ендофітних грибів, що продукують таксол; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) і A. oryzae Bd (25) на PDA після 8 днів інкубації при 30 градусах. Ізоляти грибів вирощували на PDB та інкубували за стандартних умов, а таксол екстрагували та перевіряли за допомогою ТШХ (C). D ВЕРХ хроматограма таксолу із сильнодіючих грибкових ізолятів. E Вихід таксолу, кількісно визначений за допомогою ВЕРХ. F, спектральний аналіз UV-Vis екстрагованого таксолу з ізолятів грибів. G FT-IR аналіз екстрагованого таксолу порівняно з автентичним

Рис. 2 A Макроморфологічні особливості A. favus, ендофіта жожоба після 3, 5 та 8 днів росту на КПК. Мікроморфологічні особливості, конідіальна головка A. favus при 400-кратному збільшенні. C ПЛР-амплікон A. favus ITS області 500 п.н., нормалізований до сходової ланки 1 кб (номер кат. SM0312). D Філогенетичний аналіз ITS A. favus методом максимальної правдоподібності [44]