KLRG1 позначає підмножини Т-клітин CD4, що інфільтрують пухлину, асоційовані з прогресуванням пухлини та відповіддю імунотерапії

Анотація

Сучасні методи виявлення біомаркерів та ідентифікації мішеней в імуноонкології ґрунтуються на статичних знімках імунітету пухлини. Щоб детально охарактеризувати тимчасову природу протипухлинної імунної відповіді, ми розробили 34-панель спектральної проточної цитометрії з параметрами та провели високопродуктивний аналіз у критичних контекстах.

Ми використали дві різні доклінічні моделі, які рекапітулюють імунодедитування раку (NPKC1) і реакцію блокади імунної контрольної точки (ICB) (MC38), відповідно, і профільували кілька відповідних тканин у ключових точках перегину імунного нагляду та втечі та/або відповіді ICB.

Мішені стосуються важливих біомолекул у клітинах, таких як білки, ферменти та рецептори. Розпізнавання цілей — це використання хімічних і біологічних методів для визначення специфічних властивостей і функцій цих біомолекул для застосування в лікуванні захворювань і розробці ліків.

Імунітет означає здатність організму протистояти вторгненню чужорідних патогенів і росту ендогенних аномальних клітин. Ядром імунної системи є імунні клітини та молекули, які мають тісні зв’язки та взаємодію зі своїми мішенями.

У лікуванні захворювань і розробці ліків зв'язок між ідентифікацією мішені та імунітетом є дуже важливим. Наприклад, механізм дії багатьох ліків полягає в розпізнаванні мішеней, націлюванні на специфічні білки, ферменти, рецептори та інші молекули, впливаючи на їхні функції та регулюючи передачу сигналу, щоб досягти терапевтичних ефектів. Клітини та молекули імунної системи також можуть бути мішенями ліків. Наприклад, протипухлинні препарати досягають терапевтичних ефектів, впливаючи на імунну відповідь ракових клітин і регулюючи апоптоз і проліферацію клітин.

Таким чином, при розробці ліків і клінічному лікуванні всебічне врахування ідентифікації мішені та факторів імунітету може призвести до більш ефективної розробки ліків і покращення терапевтичного ефекту. З цієї точки зору нам потрібно підвищувати імунітет. Цистанхея здатна підвищити імунітет. Цистанхе багатий різноманітними антиоксидантними речовинами, такими як вітамін С, вітамін С, каротиноїди тощо. Ці інгредієнти можуть поглинати вільні радикали, зменшувати окислювальний стрес та покращувати імунітет. опір системи.

Натисніть порошок екстракту цистанчи трубчастої

Аналіз даних, керований машинним навчанням, виявив шаблон експресії KLRG1, який однозначно ідентифікував внутрішньопухлинні ефекторні популяції Т-клітин CD4, які конститутивно асоціюються з пухлинним тягарем у моделях пухлин і втрачаються в пухлинах, які зазнають регресії у відповідь на ICB. Подібним чином, Helios-KLRG1 плюс підгрупа регуляторних Т-клітин (Tregs), що інфільтрують пухлину, була пов’язана з прогресуванням пухлини від імунної рівноваги до виходу, а також була втрачена в пухлинах, які реагували на ICB.

Валідаційні дослідження підтвердили сигнатури KLRG1 в Т-клітинах CD4, що інфільтрують пухлину людини, асоційовані з прогресуванням захворювання при раку нирки. Ці висновки визначають популяції KLRG1 плюс CD4 Т-клітин як підгрупи для подальшого дослідження імунітету проти раку та демонструють корисність профілювання поздовжнього спектрального потоку як двигуна динамічного виявлення біомаркерів та/або цілей.

вступ

Зараз імунотерапія є основою лікування раку. Проте відповіді на більшість імунотерапевтичних засобів залишаються рідкісними, обмежуються обмеженою кількістю типів пухлин і їх важко передбачити (1). Поліпшення рівня відповіді та розробка біомаркерів, що передбачають відповідь, є центральними цілями галузі імунології пухлин, але це залишається складним завданням.

Безліч складних багатоклітинних взаємодій може керувати результатом протипухлинної імунної відповіді у будь-якого пацієнта. Тому загальноприйнято, що окремі біомаркери – або терапевтична модуляція окремих шляхів – мають тенденцію бути корисними для деяких, але не для більшості хворих на рак.

Наприклад, існує три імунозалежних біомаркери, які зараз широко використовуються в клінічній практиці; (i) мутаційний тягар пухлини (TMB), виміряний безпосередньо або передбачуваний через наявність мутацій, що відключають механізми відновлення ДНК (2-4), (ii) експресія PD-L1 за допомогою імуногістохімії (IHC) (5) та (iii) існуючий імунітет, який вимірюється за наявністю Т-клітин CD8 у пухлинах та навколо них, що називається Immunoscore (6).

Незважаючи на те, що кожен з них значною мірою пов’язаний з відповіддю на імунотерапію в певних контекстах, чутливість і специфічність цих предикторів залишаються неоптимальними (7). Ці унімодальні підходи, ймовірно, не в змозі повністю охопити складні механізми, що лежать в основі протипухлинного імунітету, включаючи динамічну природу таких відповідей, що відбуваються в тканинах і з часом.

Таким чином, застосування високомультиплексних одноклітинних підходів імунного профілювання до виявлення біомаркерів і виявлення мішеней у поперечній тканині поздовжнім способом може забезпечити нюансовані імунні фенотипи з більшою прогностичною та трансляційною корисністю.

З цією метою ми розробили 34-параметричну спектральну проточну цитометричну панель і конвеєр високовимірного аналізу даних для опитування імунних фенотипів на рівні білка, пов’язаних з різними фазами циклу імунодедитування раку, включаючи імунний вихід і ріст пухлини, а також імунну контрольну точку відповідь блокади (ICB) на доклінічних моделях.

Ми склали профіль моделей MC38, оброблених NPK-C1 і ICB, аналізуючи численні тканини (пухлина, лімфатичні вузли, що дренують і не дренують, і кров) над і навколо ключових точок перегину прогресії пухлини. Це полегшило глибоку характеристику динаміки, що лежить в основі природної та індукованої ICB регресії пухлини, переходу до імунної рівноваги та подальшого переходу від рівноваги до неконтрольованого виходу пухлини. Валідаційні дослідження одноклітинних наборів даних раку нирки людини підтвердили трансляційну релевантність цих висновків.

Матеріали та методи

миші. Самці та самки мишей C57BL/6J (віком 5-6 тижнів) були придбані в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, ME). На момент використання мишам було 6-8 тижнів. Усіх тварин утримували у суворій відповідності до правил NIH та Американської асоціації догляду за лабораторними тваринами. Усі експерименти та процедури для цього дослідження були схвалені Комітетом медичного центру Колумбійського університету з догляду та використання тварин (IACUC).

Клітинні лінії. Клітинну лінію NPK-C1 (спочатку LM7304) надав доктор Корі АбатеШен з Колумбійського університету. Дивіться попередні посилання для отримання додаткової інформації (8,9). Клітини NPK-C1 витримували в R10, що складалося із середовища RPMI (Corning; Corning, NY) з додаванням 10 відсотків FBS (HyClone; Logan, UT), 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мг/мл стрептоміцину (Gibco; Gaithersburg, UT). MD). Клітини карциноми товстої кишки MC38 були придбані у Kerafast і культивовані в D10, що складається з DMEM (Corning; Corning, NY) з додаванням 10 відсотків FBS, 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мг/мл стрептоміцину (Gibco; Gaithersburg, MD).

Виклик пухлини та терапевтичні ін’єкції. Клітини NPK-C1 з 70-90 відсотками злиття або клітини MC38 з 50-75 відсотками злиття збирали з 0.05% трипсину (Gibco, Gaithersburg, MD), промитого PBS, підрахували та ресуспендували при 10x106 клітин/мл у крижаному PBS. У день 0 6-8-тижневим мишам імплантували на правий бік 1x106 клітин NPK-C1 або MC38. Вимірювання пухлини реєстрували за розмірами X, Y і Z (найбільший діаметр, найменший діаметр і найбільша висота відповідно) кожні 2-3 днів цифровим штангенциркулем, а об’єм пухлини обчислювали шляхом множення X*Y*Z. Анти-PD-1 (RMP1- 14 IgG2a,κ) або антитіла ізотипу щурячого IgG2a (Bio X Cell; Ліван, NH) розводили в стерильному PBS і вводили шляхом внутрішньоочеревинної (IP) ін’єкції по 200 мкг/ мл на мишу в дні 3, 6, 9 і 12 після імплантації MC38.

Забір тканин. Після евтаназії миші приблизно 200 мкл крові виділяли за допомогою серцевої пункції з використанням 0,2-відсоткового розчину гепарину (StemCell Technologies; Ванкувер, Британська Колумбія), покритого шприц-голкою, і поміщали на лід у пробірках, що містили 10 мкл 0,5 М EDTA (Corning; Corning, NY). Пахові лімфатичні вузли, що дренують і не дренують пухлину, розрізають і поміщають у 48-лункові планшети, що містять 150 мкл середовища R10 на льоду.

Пухлини збирали, масували, а до 50 мг пухлини нарізали кубиками та поміщали в середовище X-Vivo 15 (Lonza; Базель, Швейцарія) у 5 мл пробірки Eppendorf на льоду. ДНКазу (40 мкл розчину 20 мг/мл; Roche; Базель, Швейцарія) і колагеназу D (125 мкл розчину 40 мг/мл; Roche; Базель, Швейцарія) додавали до зразків пухлини перед інкубацією на шейкері при 37°C протягом 30 хвилин. Реакції розщеплення були припинені перемішуванням на вортексі (30 секунд) і додаванням 5 мл середовища R10. Дайджести пухлини фільтрували через фільтри 70 мкм (Miltenyi; Bergisch Gladbach, GE) і гранулювали. Зразки крові лізували еритроцити двома послідовними 2-хвилинними інкубаціями в 2 мл буфера ACK (Quality Biological; Gaithersburg, MD) і гасіли в R10 перед осадженням. Лімфатичні вузли фізично дезагрегували за допомогою поршня шприца об’ємом 1 мл у 48-лунковому планшеті, потім суспензію фільтрували через 40-мкм-фільтри. Усі зразки поміщали в планшети з U-подібним дном 96-лунки для фарбування.

Проточна цитометрія. Зразки промивали PBS. Мертві клітини фарбували ресуспендуванням у 100 мкл PBS плюс барвник Live/Dead Fixable Blue (1:500; Invitrogen; Waltham, MA). Цей та всі подальші етапи фарбування або фіксації виконували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі на планшетному шейкері, захищеному від світла. Зразки промивали 2 рази PBS, потім ресуспендували в FACS (PBS плюс 3 відсотки FBS плюс 1мМ EDTA плюс 10мМ HEPES) з додаванням TruStain FcX (1:50; BioLegend; Сан-Дієго, Каліфорнія) і блокатором моноцитів TruStain (1:20; BioLegend; Сан-Дієго, Каліфорнія) і помістили на лід.

Поверхневі антитіла готували в оптимальних розведеннях (див. додаткову таблицю S1) у FACS, доповненому буфером Brilliant Stain Plus (BD; Franklin Lakes, NJ), потім додавали до зразків у блокуючому розчині. Після фарбування зразки промивали 2 рази буфером FACS і фіксували в 100 мкл буфера FoxP3 Fixation/Permeabilization Kit (eBioscience; Сан-Дієго, Каліфорнія). Зразки двічі промивали 1X буфером для пермеабілізації (1X PW), а потім фарбували 1X PW плюс внутрішньоклітинні антитіла. Потім зразки двічі промивали в 1X PW, потім фіксували в 100 мкл буфера FluoroFix (BioLegend: Сан-Дієго, Каліфорнія), двічі промивали FACS, потім ресуспендували в 200 мкл FACS і запечатували в 96-лункові планшети для збору наступного дня на Cytek Aurora 5-лазерний цитометр.

Одночасно пофарбовані зразки спленоцитів використовували для контролю з одним фарбуванням. Аналіз і статистика. Експерименти поздовжнього профілювання проводилися один раз для моделей MC38 і NPK-C1. Всього було оцінено n=10-25 мишей за один момент часу. Дані проточної цитометрії були проаналізовані у FlowJo v10.8.1 (BD; Франклін-Лейкс, Нью-Джерсі), а алгоритми плагінів великої розмірності UMAP і FlowSOM були завантажені з FlowJo Exchange. До 30 000 живих CD45 плюс клітин, що інфільтрують пухлину, і до 15 000 живих CD45 плюс клітин крові або LN-похідних клітин на зразок було об’єднано для багатовимірного аналізу.

Усе зменшення розмірності та кластеризацію було виконано у FlowJo. Статистичний аналіз проводився в GraphPad Prism v9.3.1. Кореляцію Пірсона використовували для генерації коефіцієнтів кореляції, а непарні Т-тести Стьюдента з поправкою Велча використовували для порівняння частот кластерів між групами. Аналітичні методи однієї клітини описані раніше (10,11).

Регулон KLRG1 було виділено з консенсусного метаVIPER регулону KLRG1 від Obradovic, et al (11). Щоб обчислити сигнатуру регулону KLRG1, ми підібрали регресійну модель випадкового лісу з генами регулонів як ознаками та KLRG1 як ціллю, а потім обчислили показники важливості Джіні генів регулону, щоб визначити їхній вплив на експресію KLRG1. Оцінка регулону KLRG1 для кожної клітини була задана зваженою сумою показників експресії всіх генів регулону в клітині з оцінками важливості як ваговими коефіцієнтами.

For more information:1950477648nn@gmail.com