Чому рецептор ретиноєвої кислоти Responder1 може сприяти розвитку гломерулярних захворювань?

Респондер1 рецептора ретиноєвої кислоти сприяє розвитку клубочкових захворювань через сигнальний шлях ядерного фактора-kB

Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katja Mo¨ller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 і Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrated Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet at Karolinska University Hospital, Huddinge, Стокгольм, Швеція; 2 Відділ лабораторної медицини, Відділення патології, Каролінський інститут при Каролінській університетській лікарні, Гуддінге, Стокгольм, Швеція; 3 Департамент медицини Худдінге, Каролінський інститут Каролінської університетської лікарні, Гуддінге, Стокгольм, Швеція; 4 Департамент клінічних наук, втручання та технології, Відділ ниркової медицини, Каролінський інститут, Стокгольм, Швеція; та 5 Bioscience Renal, Research, and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Гетеборг, Швеція

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2021.05.036

Copyright ª 2021, Міжнародне товариство нефрології. Опубліковано Elsevier Inc. Це стаття у відкритому доступі за ліцензією CC BY

Кореспонденція: Jaakko Patrakka, Department of Laboratory Medicine, Division of Pathology, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Sweden. Електронна адреса: jaakko.patrakka@ki.se Отримано 27 липня 2020 р.; переглянуто 11 травня 2021 р.; прийнято 20 травня 2021 р.; опубліковано онлайн 18 червня 2021 р

КЛЮЧОВІ СЛОВА: клубочковаендотеліальна клітина; НФ-кБ; подоцит; Rarres1

У більшості активуються запальні шляхиклубочкові захворюванняале молекулярні механізми, що приводять їх у дію в нирковій тканині, маловідомі. Ми ідентифікувалиретиноєва кислотарецептора-респондента 1 (Rarres1) як білка, високо збагаченого подоцитами, у здорових нирках. Дослідження на нокаутованих подоцит-специфічних тваринах показали, що Rarres1 не був потрібен для нормального розвитку або підтримки клубочкового фільтраційного бар’єру та не модулював результат захворювання нирок у моделі гломерулонефриту. Цікаво, що ми виявили індукцію експресії Rarres1 у гломерулярних і перитубулярних капілярних ендотеліальних клітинах при IgA та діабетичній хворобі нирок, а також при ANCA-асоційованому васкуліті. Аналіз загальнодоступних наборів даних РНК показав, що індукція експресії Rarres1 була поширеним молекулярним механізмом при хронічних захворюваннях нирок. Умовна лінія мишей із надлишковою експресією Rarres1 саме в ендотеліальних клітинах не показала жодного очевидного фенотипу нирок. Однак надмірна експресія сприяла прогресуванню ураження нирок у моделі гломерулонефриту. Відповідно до цього миші з умовним нокаутом, у яких відсутній Rarres1 в ендотеліальних клітинах, були частково захищені в моделі захворювання. Механічно Rarres1 сприяв запаленню та фіфіброзу через сигнальний шлях фактора транскрипції Nuclear Factor-kB шляхом активації рецепторної тирозинкінази Axl. Таким чином, індукція експресії Rarres1 в ендотеліальних клітинах є поширеним молекулярним механізмом у гломерулопатіях людини, і це, здається, відіграє патогенну роль у стимулюванні запалення та фіброзу через сигнальний шлях ядерного фактора-kB.

Заява про переклад

Ми визначили підвищення регуляціїретиноєва кислотаРецепторний білок 1 (Rarres1) в ендотеліальних клітинах (ЕК) звичайних гломерулопатій людини. Схоже, що індукція відіграє патогенну рольклубочкова хворобаоскільки прогресування гломерулонефриту (i) посилювалося у миші з надлишковою експресією Rarres1 саме в ECs, і (ii) покращувалося в EC-специфічній лінії нокауту Rarres1. Rarres1 може бути біомаркером для виявлення мікросудинного пошкодження при захворюваннях нирок і потенційно новою терапевтичною мішенню.

Гломерулярна хворобапроцеси є основною причиною кінцевої стадії ниркової недостатності. Діабетична нефропатія (ДН) у всьому світі є найпоширенішою причиною термінальної стадії ниркової недостатності, тоді як IgA-нефропатія (IgAN) є найбільш поширеним первинним гломерулонефритом (ГН).1,2 Гістологічно пошкодження клубочків при цих поширених захворюваннях проявляється дуже схожим мода. Це включає активацію гломерулярних ендотеліальних клітин (GEC), розширення позаклітинного матриксу, проліферацію мезангіальних клітин, пошкодження подоцитів і, зрештою, втрату подоцитів.3

Дослідження профілювання глобальних транскриптів у біоптатах нирок людини показали сильну ознаку запального процесу при гломерулярних розладах4–7, а дослідження на мишах продемонстрували, що активація ядерного фактора-kB (NF-kB) і трансформуючого фактора росту-b (TGF-b) сигнальні шляхи відіграють важливу роль у прогресуванні захворювання.8,9 Важливо, що фармацевтичне націлювання на шлях NF-kB має ренопротекторний ефект у тваринних моделях, що вказує на те, що цей шлях є потенційною мішенню для лікування.клубочкові захворювання.10,11 У подоцитах ми нещодавно ідентифікували G-білково-зв’язаний рецептор класу C групи 5 як модулятор NF-kB-опосередкованої запальної відповіді.12 Однак активація запальних шляхів при гломерулопатіях, ймовірно, обумовлена ​​кількома типами клітин . Фактично, активація сигнального шляху NF-kB виявляється в GEC при багатьох захворюваннях нирок людини.13,14 Молекулярні механізми, задіяні в активації NF-kB в GEC, погано вивчені.

Респондер1 рецептора ретиноєвої кислоти може сприяти розвиткуЗахворювання клубочків

У цьому дослідженні ми проаналізували молекулярні сигнатури людиниклубочкові захворюванняі виявив індукціюретиноєва кислотаекспресія рецептора-респондента 1 (Rarres1) у GECs як загальна молекулярна сигнатура при васкуліті, пов’язаному з DN, IgAN і антинейтрофільними цитоплазматичними аутоантитілами (ANCA). Дослідження на лініях мишей з активацією/інактивацією експресії Rarres1 в ендотеліальних клітинах (ЕК) демонструють, що ця індукція відіграє патогенну роль у мишачій моделі ГН. Механічно Rarres1 активує рецепторну тирозинкіназу Axl, що призводить до активації сигнального шляху NF-kB. Ми пропонуємо Rarres1 як новий біомаркер мікросудинного пошкодження, який може бути привабливою терапевтичною мішенню дляклубочкова хворобапроцеси шляхом модулювання запальних реакцій.

Малюнок 1|(Продовження) (c) Аналіз BackSPIN, що демонструє експресію Rarres1 саме в подоцитах (PD) у даних RNAseq тканини мишачої нирки (дані Woroniecka et al.6). (d) Відносні рівні мРНК Rarres1 в ізольованих Tub і Glom із зразків людини. Дані виражені як кратна зміна експресії Rarres1 у Glom порівняно з Tub. *P < 0.05="" проти="" tub.="" (e)="" репрезентативне="" конфокальне="" fl="" флуоресцентне="" мікроскопічне="" зображення="" експресії="" rarres1="" (зелений)="" подоцитами="" в="" клубочках="" людини="" від="" нормальних="" суб’єктів.="" (f)="" репрезентативні="" конфокальні="" мікроскопічні="" зображення,="" що="" демонструють="" експресію="" rarres1="" у="" подоцитах="" людей;="" віментин="" використовувався="" як="" маркер="" основних="" відростків,="" а="" нефрин="" –="" як="" маркер="" ніжкових="" відростків="" подоцитів.="" cd31="" використовували="" як="" маркер="" для="" ендотеліальних="" клітин,="" а="" ⍺-актин="" гладких="" м’язів="" (⍺sma)="" використовували="" як="" маркер="" мезангіальних="" клітин.="" прутки="50/10" мм.="" дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sem.="" т-критерій="" стьюдента="" використовувався="" для="" порівняння="" між="" 2="" групами.="" щоб="" оптимізувати="" перегляд="" цього="" зображення,="" перегляньте="" онлайн-версію="" цієї="" статті="" на="">

МЕТОДИ

Екстракція РНК і полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі

Клубочки виділяли, як описано раніше.15 РНК екстрагували за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen) і RNeasy Kit (Qiagen Inc.). Набір iScript cDNA Synthesis Kit був використаний для генерації кДНК. Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію проводили за допомогою системи виявлення CFX96 Touch Real-Time PCR з SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Використані праймери перераховані в додатковій таблиці S1. Відносні рівні експресії були розраховані за допомогою 2-методу DDCT.

Культура клітин

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – плазміда (VectorBuilder Inc. Клони були розширені за допомогою селекції пуроміцину (Merck KGaA). Трансфекція короткої інтерферуючої РНК (siRNA) для Axl/Rarres1 була виконана з використанням siRNA від Origene. Клітини були трансфіковані 30 нМ siRNA з подальшим утворенням комплексу з трансфекційним реагентом JetPEI (Polyplus-transfection SA) з або без стимулів TGF-b1 (10 нг/мл у культуральному середовищі).Інгібітор Axl R428 (Selleck Chemicals) додавали за 1 годину до обробки (3 ммоль/ л).

Чому рецептор ретиноєвої кислоти Responder1 може сприяти розвиткуЗахворювання клубочків?

Вестерн-блот

Клітини лізували буфером для лізису RIPA, доповненим сумішшю для інгібування протеази/фосфатази (Roche). Білки з ядерних фракцій виділяли за допомогою набору Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe). Лізати розділяли на 4-12-процентному трис-гліцин-додецилсульфаті натрію-поліакриламідному гелі (Invitrogen) і переносили на полівінілідендифторидні мембрани (Bio-Rad). Мембрани блокували 5% бичачим сироватковим альбуміном (Merck). Інкубацію з первинними антитілами проводили протягом ночі (антитіла в Додатковій таблиці S2). Для виявлення сигналів використовували вторинні антитіла, кон’юговані з пероксидазою хрону, і субстрат Clarity Western ECL (Bio-Rad). Вестерн-блот аналіз проводили принаймні двічі.

Гібридизація РНК in situ

Аналіз RNAscope проводили в залитих парафіном нирках людини згідно з протоколом виробника (ACD). Використовувалися зонди NPHS1 - Cat No. 416071-C2, PECAM1 - Cat No. 487381-C3 і RARRES1 - спеціальний зонд, націлений на нуклеотиди {{8 }}.

Оцінка ураження нирок

Співвідношення альбуміну та креатиніну в сечі оцінювали за допомогою набору Mouse Albumin ELISA Kit (Allbuwell M; Ethos Biosciences) і набору QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems). Тканини нирок фіксували в 10-відсотковому нейтральному забуференому розчині формаліну і заливали в парафін з подальшим розрізанням і періодичним фарбуванням кислотою-Шиффом. Електронну мікроскопію проводили на зразках, фіксованих у 2,5% глутаровому альдегіді.

Імунофарбування

Тканини, залиті парафіном, фіксували протягом 24 годин у формаліні. П’ятимікрометрові зрізи депарафінували та обробляли мікрохвильовою піччю або в буфері трис-етилендіамінтетраоцтової кислоти (10 мМ трис-основи, 1 мМ буферного розчину етилендіамінтетраоцтової кислоти, 0}05% Твіну 20, pH 9.0) або натрій цитратний буфер (10 мМ цитрат натрію, 0,05 відсотка Tween 20, pH 6,0), з подальшою пермеабілізацією 0,3% Triton X-100 і блокуванням з 10 відсотками нормальної козячої сироватки, 3 відсотками пероксидази водню та набором для блокування вектора (Vector Laboratories). Слайди були розроблені з використанням набору субстратів DAB пероксидази (пероксидази хрону), 3,30 -діамінобензидину (Vector Laboratories).

Для заморожених зрізів зрізи, фіксовані ацетоном, проникали за допомогою 0.1% Tween 20 і блокували 10% нормальної козячої сироватки. Використані первинні антитіла наведено в додатковій таблиці S1. Вторинні антитіла Alexa-Fluor для імунофлюоресценції були отримані від Molecular Probes (Life Technologies). Зображення були отримані за допомогою конфокального мікроскопа Leica SP8 (Leica Microsystems).

Людські зразки

Ниркові біопсії були отримані з Каролінської університетської лікарні (Стокгольм, Швеція). Контрольні зразки були отримані зі здорових полюсів нирок осіб, які перенесли пухлинну нефректомію. Місцевий етичний комітет схвалив дослідження (схвалення № 2010/579-31/1, Стокгольм, Швеція).

порівняно з контролем (Ctrl.) або ***P < {{0}}.001="" проти="" si-негативного="" контролю="" (скремблування)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" репрезентативні="" документи="" вестерн-блоттингу="" та="" узагальнені="" дані,="" що="" демонструють="" відносні="" рівні="" білка="" pp65="" в="" ізольованих="" ядерних="" фракціях="" подоцитів,="" оброблених="" 10="" нг/мл="" tgf-b1.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" проти="" контрольних="" подоцитів="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" репрезентативні="" документи="" вестерн-блоттингу="" та="" узагальнені="" дані,="" що="" демонструють="" відносні="" рівні="" білка="" pp65="" в="" ізольованих="" ядерних="" фракціях="" подоцитів,="" оброблених="" 10="" нг/мл="" tgf-b1="" ±3="" ммоль/л="" r428,="" n="2." (e)="" репрезентативний="" вестерн-блот,="" який="" показує,="" що="" надмірна="" експресія="" rarres1="" конститутивно="" активує="" axl.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" відносні="" рівні="" мрнк="" генів,="" пов’язаних="" з="" емт,="" у="" подоцитах="" із="" надмірною="" експресією="" rarres1="" (rarres1)="" або="" контрольних="" подоцитах="" (ctrl.),="" трансфікованих="" sirna="" для="" axl="" (siaxl),="" si-негативний="" контроль="" (змішування),="" ##p=""><0,01, ##="" #p="">< 0,001="" проти="" скремблування,="" n="3," або="" оброблено="" 3="" ммоль/л="" r428.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" проти="" контрольного="" значення,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" проти="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" проти="" rarres1,="" n="4." дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sd.="" критерій="" стьюдента="" використовувався="" для="" порівняння="" між="" 2="" групами.="" ю.т.,="">

Малюнок 3|Встановлення подоцит-специфічних нокаутних мишей Rarres1 (CreD/Rarres1flfl/flfl). (a) Генерація мишей з умовним нокаутом, у яких Rarres1 спеціально видаляється в подоцитах за допомогою системи рекомбінації Cre-LoxP. Екзон 3 видаляється під час рекомбінації, опосередкованої NPHS2-Cre. (b) Генотипування було підтверджено препаруванням хвоста та полімеразною ланцюговою реакцією у віці 4 тижнів. (Продовження)

Малюнок 3|(Продовження) (c) Репрезентативний вестерн-блот, що демонструє знижену експресію Rarres1 в ізольованих клубочках специфічних для подоцитів Rarres1 нокаутних (Creþ/Rarres1flfl/flfl) мишей. (d) Подоцит-специфічна втрата Rarres1 не впливає на рівень альбумінурії у мишей, які отримували нефротоксичну сироватку (NTS), як аналізували за співвідношенням альбуміну до креатиніну в сечі в різних групах мишей (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Мікрофотографії та кількісні показники, що демонструють типові зміни структури клубочків у різних групах мишей. Гломерулярні ураження були виявлені в зрізах, забарвлених періодичною кислотою за Шиффом. #P < 0.0001="" проти="" необробленого="" контролю="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" та="" кількісні="" показники="" середньої="" товщини="" базальної="" мембрани="" клубочка="" (gbm)="" і="" кількості="" щілин="" на="" мм="" gbm="" у="" різних="" групах="" мишей="" за="" допомогою="" трансмісійного="" електронного="" мікроскопічного="" аналізу.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" порівняно="" з="" необробленим="" контролем="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sem.="" односторонній="" дисперсійний="" аналіз="" з="" подальшим="" пост-тестом="" тьюкі="" для="" множинних="" порівнянь="" використовувався="" для="" груп="" із="" 3="" або="" більше="" осіб.="" щоб="" оптимізувати="" перегляд="" цього="" зображення,="" перегляньте="" онлайн-версію="" цієї="" статті="" на="">

Лінії миші

Floxed миші Rarres1 з фоном C57Bl/6J (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) були подоцин (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/Дж; Jackson Laboratory) і миші Tie2 cre (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J) для створення клітинно-специфічних нокаутних мишей. Мишей GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J схрещували з лінією Tie2-cre для активації експресії Rarres1 саме в ECs.17 Розведення та генотипування проводили відповідно до стандарту процедури. Усі дослідження на тваринах проводилися в доклінічній лабораторії (Каролінський інститут) згідно з відповідними рекомендаціями та правилами та були схвалені Етичним комітетом з питань догляду за тваринами (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336).

Нефротоксична сироватка (NTS)-індукована нефропатія у мишей

Мишам віком від семи до 9- тижнів отримували 50 мл повного ад’юванту Фрейнда (Merck) підшкірно з подальшою ін’єкцією NTS (в/в; 6 мл/кг маси тіла; Probetex Inc.) на 4 день.18 Сечу збирали 3, 7 , 10 і 14 днів після ін'єкції, а мишей вбивали на 14 день.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Prism 9.0 (GraphPad).

Дані спочатку перевіряли на нормальність (тест Шапіро-Вілка). Коли розподіл був Гауссовим, дані аналізували за допомогою параметричного тесту (t-критерій Стьюдента для 2 груп і дисперсійний аналіз за допомогою посттесту Тьюкі для більш ніж 2 груп). Якщо розподіл не був Гаусовим, використовували непараметричні тести (тест Фрідмана з пост-тестом Данна для більш ніж 2 груп і U-тест Манна-Уітні для 2 груп). Відмінності вважалися достовірними, коли P <>

РЕЗУЛЬТАТИ

Rarres1 експресується подоцитами

Спочатку ми оцінили модель експресії Rarres1 у нирковій тканині миші та людини. Аналіз полімеразної ланцюгової реакції показав, що Rarres1 експресується значно вище в клубочковій, ніж у тубулоінтерстиціальній фракції кори нирок миші (рис. 1a і b6). Аналіз секвенування одноклітинної РНК тканини мишачої нирки показав, що Rarres1 експресується виключно подоцитами (рис. 1c). У людей Rarres1 також був збагачений гломерулярною тканиною (рис. 1d). При імунофлюоресценції нормальної тканини нирок людини Rarres1 показав високий сигнал у клубочках (рис. 1e). Подвійне фарбування показало, що Rarres1 був розташований «поза» реактивністю нефрину в капілярних петлях, що свідчить про експресію подоцитів (рис. 1f). Колокалізація віментином вказала на локалізацію основних процесів. Не було виявлено перекриваючої реактивності для маркера EC CD31 або мезангіального маркера - актину гладких м'язів (рис. 1f).

Rarres1 сприяє передачі сигналів NF-kB і TGF-b1 через рецепторну тирозинкіназу Axl

Щоб з’ясувати роль Rarres1 у подоцитах, ми маніпулювали рівнями його експресії в увічнених людських подоцитах.16 Рівні Rarres1 були значно підвищені в подоцитах, стабільно трансфікованих людською кДНК Rarres1, і знижувалися після трансфекції Rarres1-націленою на siRNA (рис. 2а). Надмірна експресія Rarres1 посилювала експресію генів, пов’язаних з епітеліально-мезенхімальним переходом, тоді як зниження регуляції ендогенного Rarres1 мало протилежний ефект (рис. 2b). Оскільки передача сигналів NF-kB відіграє важливу роль в епітеліально-мезенхімальному переході, що призводить до фіфіброзу та запалення при ГН19, ми вимірювали індуковану TGF-b1 активацію передачі сигналу NF-kB in vitro. Надмірна експресія Rarres1 викликала підвищену активацію шляху NF-kB на початковому рівні та після стимуляції TGF-b1 (рис. 2c). Оскільки повідомлялося, що Rarres1 активує рецепторну тирозинкіназу Axl і таким чином сприяє сигнальному шляху NF-kB при запальному раку молочної залози20, ми оцінили, чи є Axl потенційним функціональним партнером Rarres1 у тканині нирок. TGF-b1-індукована активація NF-kB може бути інгібована R428, селективним низькомолекулярним інгібітором кінази Axl21,22 (рис. 2d), а надекспресія Rarres1 позитивно корелює з конститутивною активацією кінази Axl (рис. 2e). Зниження активності Axl за допомогою R428, але не глушіння гена Axl siRNA, може зменшити Rarres1-індуковану експресію генів, пов’язаних з епітеліально-мезенхімальним переходом, про що свідчить зниження рівнів мРНК (рис. 2f). Слід зазначити, що не було виявлено активації неканонічних шляхів NF-kB (додатковий малюнок S1). Таким чином, Rarres1 сприяв передачі сигналу NF-kB у культивованих подоцитах через активацію кінази Axl.

Чому рецептор ретиноєвої кислоти Responder1 може сприяти розвитку гломерулярних захворювань?

Інактивація Rarres1 у подоцитах не призводить до гломерулярних аномалій або модулює результат нефропатії в моделі GN з антигломерулярною базальною мембраною (GBM).

Щоб проаналізувати роль Rarres1 у подоцитах in vivo, ми створили нову лінію мишей Rarres1flfl/flfl (floxed) і схрестили її з мишами podocin-Cre для отримання мишей Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) (Малюнок 3a). ). Генотипи для алелів floxed/Cre були ідентифіковані шляхом генотипування вуха (рис. 3b). Аналіз полімеразної ланцюгової реакції тубулоінтерстиціальних і клубочкових фракцій, а також тканини печінки підтвердив делецію екзону 3 саме в клубочку (додатковий малюнок S2A), а рівні білка Rarres1 були знижені в клубочках мишей Creþ/Rarres1flfl/flfl (рисунок 3c).

Малюнок 4|Посилення регуляції Rarres1 у гломерулярних і перитубулярних капілярних ендотеліальних клітинах у пацієнтів із хронічною хворобою нирок. (a) Аналіз експресії генів Rarres1, колагену1a2 (COL1A2) і нефрину (NPHS1) у даних мікрочипів клубочків, виділених у пацієнтів з діабетичною нефропатією (ДН), васкулітом, IgA-нефропатією (IgAN) і контрольних (Контр.) суб’єктів. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" проти="" контрольних="" суб’єктів.="" (b)="" кількісний="" аналіз="" полімеразної="" ланцюгової="" реакції="" для="" генів="" rarres1,="" col1a2="" і="" nphs1="" в="" ізольованих="" клубочках="" пацієнтів="" із="" дн="" (n="5)" і="" контрольної="" групи="" (n="5)." **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" порівняно="" з="" контрольними="" суб’єктами.="" (c)="" аналіз="" експресії="" генів="" rarres1="" і="" col1a2="" у="" даних="" мікрочіпів="" канальцевої="" фракції,="" виділеної="" з="" dn,="" васкуліту,="" igan="" і="" пацієнтів="" контрольної="" групи.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 порівняно="" з="" контрольними="" суб’єктами.="" (d)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" імуногістохімічного="" фарбування="" rarres1="" у="" нирковій="" корковій="" тканині="" людини="" від="" контрольної="" групи="" та="" пацієнтів="" із="" дн="" (n="5)," васкулітом="" проти="" нейтрофільних="" цитоплазматичних="" антитіл="" (anca)="" (n="4)" та="" igan="" (="" n="5)." стрілки="" позначають="" rarres1-позитивні="" подоцити="" (контроль)="" та="" ендотеліальні="" клітини="" (ec)="" (dn,="" igan="" і="" васкуліт).="">

Малюнок 4|(Продовження) (e) Типові конфокальні мікроскопічні зображення, що демонструють експресію Rarres1 у клубочках пацієнтів з ДН. CD31 використовувався як маркер для ЕК. Прутки=50/10 мм. (f) Репрезентативні конфокальні FL флуоресцентні зображення РНКоскопа показують експресію гена Rarres1 у PECAM1-коекспресуючих клітинах у тубулярній фракції пацієнтів із ДН. Дані виражені як середнє ± SEM. Т-критерій Стьюдента використовувався для порівняння між 2 групами. Прутки=50/10 мм. Щоб оптимізувати перегляд цього зображення, перегляньте онлайн-версію цієї статті на www.kidney-international.org.

Миші Creþ/Rarres1flfl/flfl народилися з очікуваним коефіцієнтом успадкування Менделя, і вони були життєздатними та фертильними (дані не показані). Нирки не можна було відрізнити від контрольних однопометників (Cre- /Rarres1flfl/flfl ), проаналізованих за допомогою звичайного світлового та електронного мікроскопічного дослідження (додатковий малюнок S2B та C). Крім того, розподіл білків подоцитів нефрину та синаптоподіну не змінювався у мишей Creþ/Rarres1flfl/flfl (додатковий малюнок S2D)

Щоб з’ясувати роль Rarres1 в пошкодженні нирок in vivo, Creþ/Rarres1flfl/flfl лікували NTS, що призводить до відкладень IgG у GBM, альбумінурії та прогресуючого GN.23 Рівні альбумінурії були подібними як у Creþ/Rarres1flfl/flfl, так і в контролі. миші (рис. 3d). Світлове мікроскопічне дослідження не виявило істотних відмінностей у частці уражених клубочків (рис. 3e). Електронна мікроскопія не виявила різниці в товщині GBM або стирання відростка стопи, і GECs, здавалося, постраждали однаково в обох групах (рис. 3f). Маркери подоцитів нефрин, Wt1 і синаптоподін зазнали подібного впливу в обох групах (додатковий малюнок S3A). Крім того, фарбування для ЕК з використанням CD31 не показало відмінностей у клубочках або перитубулярних капілярах між групами (додатковий малюнок S3B і C). Крім того, експресія фіфіброзу та генів, пов’язаних із запаленням, була однаково підвищена в обох групах, які отримували NTS (додатковий малюнок S4).

Експресія Rarres1 індукується в клубочкових і перитубулярних капілярних ЕК при хронічній хворобі нирок (ХНН)

Щоб дослідити роль Rarres1 у ХХН, ми проаналізували його експресію в загальнодоступних наборах даних РНК. Ми спостерігали значно підвищені рівні Rarres1 у клубочках, виділених у пацієнтів з ДН, васкулітом, асоційованим з ANCA, та IgAN (рис. 4a), 4,6,24–26, тоді як інші гени, асоційовані з подоцитами, наприклад, нефрин, були значно знижені або не змінені. . Наш кількісний аналіз полімеразної ланцюгової реакції клубочків, виділених у пацієнтів із ДН (n=5), підтвердив індукцію експресії Rarres1 (рис. 4b). Через втрату подоцитів експресія генів подоцитів зазвичай знижується при прогресуванніклубочкові захворювання,6 і співвідношення експресії клубочків Rarres1 до експресії нефрину було збільшено приблизно в 20-рази в ДН порівняно зі здоровими клубочками (рис. 4b). Експресія Rarres1 також посилювалася в наборах даних тубулоінтерстиціальної тканини при DN, ANCA-асоційованому васкуліті та IgAN (рис. 4c).8–11

Далі ми проаналізували експресію Rarres1 імуногістохімічним шляхом у біоптатах нирок пацієнтів із ДН (n=5), IgAN (n=5) і ANCA-асоційованим васкулітом (n=4). У хворих клубочках фарбування Rarres1, здавалося, було локалізовано для GEC, як показано імунореактивністю на внутрішній стороні стінок капілярів (рис. 4d, вставки), тоді як сигнал від подоцитів виявився слабшим. У тубулоінтерстиціальному просторі фарбування було виявлено в перитубулярних капілярах (рис. 4d, вставки), що свідчить про експресію EC. Подвійне імунологічне маркування за допомогою CD31 підтвердило локалізацію EC як у клубочках, так і в перитубулярних капілярах (рис. 4e). Подібним чином експерименти з подвійним РНКоскопом показали колокалізацію мРНК Rarres1 з мРНК PECAM1 у DN (рис. 4f). Взяті разом, індукція експресії Rarres1 у клубочкових і перитубулярних капілярних ECs була поширеним явищем при ХХН.

Генерація та характеристика лінії миші з надмірною експресією Rarres1 в EC

Оскільки Rarres1 індукується при ХХН людини, ми створили нову трансгенну лінію мишей, у якій кДНК Rarres1 була введена в локус Rosa26 під промотором CAG,27 з касетою lox-STOP-lox між акцепторними сайтами сплайсингу (рис. 5a). Лінію схрестили з лінією Tie2-cre для створення мишей Rarres1_Tie2_KI, і мишей ідентифікували за допомогою генотипу вуха за алелями нокін і Cre (рис. 5а). Миші Rarres1_Tie2_KI продемонстрували значно підвищені рівні білка Rarres1 у нирковій тканині (рис. 5b), і успішну стратегію нокамінування було додатково підтверджено аналізом експресії мРНК Rarres1 у GFP-позитивних FACS-сортованих GECs (Малюнок 5c).

Ми фенотипували нирки мишей Rarres1_Tie2_KI та контрольних мишей у відповідних за віком групах. При дослідженні під світловим мікроскопом морфологія нирок у мишей Rarres1_Tie2_KI не відрізнилася від контрольних однопометників (рис. 5d). Подібним чином електронна мікроскопія показала незмінну товщину GBM і ширину відростка подоцита (рис. 5e). Більше того, експресія маркерів подоцитів нефрину та синаптоподіну, здавалося, не змінюється в клубочках Rarres1, які надмірно експресують (рис. 5f). Слід зазначити, що в інших основних органах макроскопічно чи мікроскопічно не було виявлено жодних очевидних аномалій (дані не показано).

Малюнок 5|Встановлення специфічних для ендотеліальних клітин мишей Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI). (a) Покоління умовних мишей, у яких експресія Rarres1 спеціально індукована в ендотеліальних клітинах (EC) за допомогою системи рекомбінації Cre-LoxP. Мишей Tie2-Cre схрестили з мишами, які експресують націлюючий вектор (Rarres1_casetteþ), що містить касету lox-STOP-lox між сплайсом (продовження)

Малюнок 5|(продовження) акцепторні сайти та кДНК Rarres1 під промотором CAG, який був введений у локус Rosa26, були ідентифіковані за допомогою генотипування вуха. Генотипування було підтверджено препаруванням вуха та полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) у віці 4 тижнів. (b) Репрезентативний вестерн-блот, що демонструє підвищену експресію Rarres1 у корі нирок від EC-специфічних мишей Rarres1 knockin (Rarres1_Tie2_KI). **P < 0.01="" проти="" контрольної="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_рівня2_ki,="" n="5," манн-уїтні="" u="" тест).="" (c)="" кількісна="" плр="" для="" rarres1="" в="" ізольованих="" ек.="" **p="">< 0,01="" порівняно="" з="" контролем="" (cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="3," t-критерій="" стьюдента).="" (d)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" зрізів,="" забарвлених="" періодичною="" кислотою="" по="" шиффу,="" що="" демонструють="" типові="" клубочкові="" структури="" в="" різних="" групах="" мишей.="" (e)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" та="" кількісні="" показники="" середньої="" товщини="" базальної="" мембрани="" клубочка="" (gbm)="" і="" кількості="" щілин="" на="" мм="" gbm="" у="" різних="" групах="" мишей="" за="" допомогою="" трансмісійної="" електронної="" мікроскопії="" (t-тест="" стьюдента).="" (f)="" репрезентативні="" конфокальні="" мікроскопічні="" зображення,="" що="" демонструють="" експресію="" подоцит-специфічного="" маркера="" синаптоподіну="" та="" нефрину="" в="" ec-специфічних="" мишах="" rarres1="" (rarre1_tie2_ki)="" і="" ctrl.="" миші.="" прутки="10" мм.="" дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sem.="" щоб="" оптимізувати="" перегляд="" цього="" зображення,="" перегляньте="" онлайн-версію="" цієї="" статті="" на="">

Індукція Rarres1 в ECs модулює сигнальний шлях NF-kB і результат нефропатії, регулюючи активацію Axl

Щоб оцінити, чи експресія Rarres1 в ECs модулює прогресування захворювання, ми індукували GN у трансгенних мишей та їхніх однопомітників за допомогою однієї ін’єкції NTS. Миші Rarres1_- Tie2_KI розвинули значно вищі рівні альбумінурії, ніж контрольні, через 3 дні, тоді як суттєвої різниці в альбумінурії не спостерігалося на 7, 10 та 14 днях (рис. 6а). Гістологічний аналіз через 14 днів після індукції показав, що у мишей Rarres1_Tie2_KI не було більше змін клубочків, таких як склеротичні та півмісяцеві ураження (рис. 6b). Електронно-мікроскопічна оцінка показала, однак, значно товщі GBM і більше стирання відростка стопи у мишей Rarres1_Tie2_KI (рис. 6c). Крім того, у мишей лінії Rarres1_Tie2_KI спостерігався підвищений рівень актину гладких м’язів у корі нирки (рис. 6d). Аналіз маркерів подоцитів нефрину, синаптоподіну та WT1 показав глибоке зниження, що свідчить про дедиференціацію та значну втрату подоцитів (рис. 6d). Важливо, що клубочки Rarres1_Tie2_KI показали менше WT1-позитивних подоцитів порівняно з контрольними тваринами, що вказує на те, що Rarres1, експресований EC, сприяє пошкодженню подоцитів. Крім того, більше фібринових тромбів було виявлено в клубочках Rarres1_Tie2_KI (рис. 6e). Відповідно до цього, експресія різних генів запалення, фіфіброзу та пошкодження ниркових канальців була значно посилена у мишей Rarres1_- Tie2_KI, як показало аналіз полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі для Il -1бета, Col1a1, TGF-b1 і молекула пошкодження нирок-128 у тканині кори нирок (рис. 6f). Однак не було виявлено відмінностей у значеннях азоту сечовини крові та S-креатиніну між групами (рис. 6g). Крім того, фарбування для ЕК з використанням CD31 не показало відмінностей у клубочках або перитубулярних капілярах між групами (додатковий малюнок S5A та B). У сукупності EC-специфічна індукція експресії Rarres1 посилювала патологію клубочків при NTS-індукованій нефропатії.

Механічно ми проаналізували, чи сприяла надмірна експресія Rarres1 в ECs активації передачі сигналів Axl і NF-kB in vivo, подібно до наших спостережень in vitro (рис. 2). Як миші Rarres1_Tie2_KI, так і контрольні миші, які отримували NTS, продемонстрували активацію сигнального шляху Axl, як показано збільшенням фосфорилювання Axl (рис. 6h). Однак ця активація була більш значною у мишей Rarres1_- Tie2_KI (рис. 6h). Відповідно, активація шляху NF-kB сприяла у цих мишей, як показано кількістю pP65-позитивних ядер у клубочках (рис. 6і). Коли рівні pP65 вимірювали вестерн-блоттингом, ми виявили подібну тенденцію для активації шляху NF-kB, хоча це було незначним, можливо, через один викид (додатковий малюнок S5C).

Інактивація Rarres1 у ECs зменшує пошкодження клубочків у моделі гломерулонефриту проти GBM

Щоб підтвердити патогенну роль Rarres1, отриманого з EC, у ХХН, ми створили лінію миші, в якій Rarres1 було видалено в EC за допомогою Tie2-Cre (рис. 7a). Генотипи для алелів floxed і Cre були ідентифіковані шляхом генотипування вуха (рис. 7b). Існувала тенденція до підвищення регуляції Rarres1 у мишей, які отримували NTS, яка була скасована у мишей Rarres1_Tie2_KO (рис. 7c). У мишей не виявлено жодних явних аномалій нирок (дані не показані). Ін’єкція NTS викликала подібну альбумінурію у Rarres1_Tie2_KO та контрольної групи (рис. 7d). Однак гістологічний аналіз через 14 днів після індукції показав менше клубочкових змін у мишей Rarres1_- Tie2_KO (рис. 7e). Під час електронної мікроскопії миші Rarres1_Tie2_KO показали менше стирання відростка стопи та потовщення GBM (рис. 7f). Імунне фарбування не показало істотних відмінностей для aSMA, нефрину або синаптоподіну (рис. 7g). Однак кількість WT1-позитивних подоцитів була значно більшою у мишей Rarres1_Tie2_KO (рис. 7g). Фарбування на pP65 показало зменшення кількості позитивних ядер у клубочках Rarres1_Tie2_KO, що свідчить про залучення сигнального шляху NF-kB (рис. 7h).

Малюнок 6|(продовження) кількісне визначення середньої товщини базальної мембрани клубочка (GBM) і кількості щілин на мм GBM у різних групах мишей за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії аналізують зрізи (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Ті2_KI, n=12). (d) Репрезентативні конфокальні мікроскопічні зображення, що демонструють експресію нефрину, синаптоподіну, α-актину гладких м’язів (⍺Sma) і WT1 у нирках різних груп мишей. Бари {{10}}/10 мм. ⍺Sma–позитивну область підраховували на поперечному зрізі кори, а WT1 підраховували на клубочку (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Ничья2_KI, n {{20}}). (e) Наявність фібринових тромбів у клубочках, як виявлено за допомогою фарбування трихоми (підраховано на поперечний зріз клубочка) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Ничья2_KI, n=5). (f) Відносні рівні мРНК різних генів, пов’язаних із запаленням, фіфіброзом і ураженням ниркових канальців, у корі нирок мишей, які отримували NTS (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_рівня2_KI, n=6–10). (g) Рівні креатиніну сироватки та азоту сечовини крові (BUN) у NTS-ctrl. (n=3) і миші NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3). (h) Репрезентативні документи вестерн-блоттингу та узагальнені дані, що демонструють відносні рівні білка Paxil у корі нирок у різних групах мишей, які отримували NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Tie2_KI, n=5). (i) Репрезентативні мікрофотографії імуногістохімічного фарбування pP65 у нирковій кортикальній тканині різних груп мишей, які отримували NTS. pP65-позитивні ядра на клубочки були кількісно визначені в різних групах мишей (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC-специфічні інфіковані миші Rarres1 (миші Rarres1_Tie2_KI); мишей з касетою Rarres1 і без експресії Cre (Ctrl.) використовували як контроль. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" порівняно="" з="" необробленим="" контролем="" (контр.),="" *p="">< 0,05="" проти="" nts-обробленого="" контролю="" (nts-контроль).="" дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sem.="" т-критерій="" стьюдента="" використовувався="" для="" порівняння="" між="" 2="" групами.="" односторонній="" дисперсійний="" аналіз="" з="" подальшим="" пост-тестом="" тьюкі="" для="" множинних="" порівнянь="" використовувався="" для="" груп="" із="" 3="" або="" більше="" осіб.="" щоб="" оптимізувати="" перегляд="" цього="" зображення,="" перегляньте="" онлайн-версію="" цієї="" статті="" на="">

ДИСКУСІЯ

Rarres1 вперше був ідентифікований у культурах шкірних рафтів, оброблених тазаротеном29, і було показано, що він діє як репресор інвазії в клітинних лініях раку передміхурової залози.30 При запальному раку молочної залози Rarres1 регулює in vitro інвазію ракових клітин через посередництво сигнального шляху Axl. . Детальніше, Rarres1 стабілізує Axl шляхом інгібування протеасомозалежної деградації Axl. Крім того, виснаження Rarres1 у клітинах SUM149 знижує експресію Axl та інактивує NF-kB, що призводить до зниження інвазії запальних клітин раку молочної залози.20 Крім того, експресія Rarres1 індукується у пацієнтів із пізнім фіброзом, і профібротична роль Rarres1 була виявлена. запропоновано на моделі фіброзу легенів щурів і під час фіброзної активації зірчастих клітин печінки.31 У сукупності попередні дослідження in vitro свідчать про роль Rarres1 у фіфіброзі, запаленні та інвазії раку.

Спочатку Rarres1 викликав наш інтерес, оскільки він був дуже збагачений клітинами подоцитів. Ми могли б показати, що Rarres1 сприяв запальній і профіброзній передачі сигналів у подоцитах через Axl-опосередковану активацію шляху NF-kB. З іншого боку, подоцит-специфічні нокаутні тварини не показали жодної очевидної різниці в порівнянні з контролем у здорових умовах, а також у мишачій моделі ГН. Це може бути пов’язано з компенсаторними механізмами, оскільки сигнальний шлях NF-kB регулюється низкою молекул і біологічних процесів.

Молекулярний профіль пацієнтів з діабетом показав, що Rarres1 був індукований у клубочкових і перитубулярних капілярних ЕК при ДН. Важливо, що експресія Rarres1 не була виявлена ​​в ЕК у пацієнтів з діабетом без нефропатії. Таким чином, ми припускаємо, що Rarres1 може бути новим маркером діабетичного мікросудинного захворювання, і показані дослідження у зразках плазми та сечі, щоб дослідити можливість використання Rarres1 як неінвазивного біомаркера. Ми ідентифікували індукцію Rarres1 також у пацієнтів з IgAN і васкулітом. Спокусливо припустити, що Rarres1 відіграє патогенну роль у цих гломерулопатіях і сприяє прогресуванню захворювання. Функціонально ми показали, що індукція Rarres1 в ECs посилила пошкодження нирок у мишачої моделі GN, тоді як інактивація Rarres1 в ECs полегшила пошкодження. Фенотиповий аналіз показав, що подоцити були уражені у мишей, які надмірно експресують Rarres1 у EC. Це може бути прямим впливом Rarres1 на подоцити, оскільки була описана розчинна форма Rares.32 Крім того, пошкодження подоцитів може бути вторинним по відношенню до пошкодження фільтраційного бар’єру клубочка.

Раніше було показано, що ендотеліальна активація NF-kB відіграє патогенну роль у розвитку захворювання нирок при васкуліті.13 Примітно, що інгібування ендотеліального шляху NF-kB у моделі півмісяцевого ГН скасувало прогресування. Показано, що інгібітори Axl є корисними при експериментальному анти-GBM нефриті. Миші, яких лікували найбільш селективним низькомолекулярним інгібітором, R428, продемонстрували значне збереження функції нирок і зниження вироблення запальних цитокінів.33 Це вказує на те, що шлях може бути терапевтичним варіантом дляклубочкова хворобапроцеси. Однак, оскільки і Axl, і NF-kB модулюють ряд різних клітинних процесів в організмі, навряд чи він буде хорошим кандидатом для фармацевтичного націлювання при ХХН. Rarres1 може забезпечити більш пов’язану з нирками ціль.

Показано, що Tie2-Cre стимулює експресію в субпопуляції гемопоетичних клітин.34 Деякі з цих клітин можуть модулювати запальну відповідь у моделі, індукованій NTS, і тому ми не можемо виключити, що Rarres1, отримані з гемопоетичних клітин, сприяють прогресування захворювання в лініях Tie2-Cre. Однак, оскільки ми не виявили жодної очевидної експресії Rarres1 в інфільтрованих імунних клітинах, ми вважаємо, що це менш імовірно.

Поки цей рукопис готувався, Чен та ін.32 повідомили про розчинну форму Rarres1, яка сприяєклубочкова хворобапрогресування. Вони визначили, подібно до нас, підвищення регуляції Rarres1 при звичайних захворюваннях клубочків людини. Дослідження підтверджує наш висновок про те, що підвищена експресія Rarres1 корелює зі зниженням функції нирокзахворювання клубочків людини. Однак, на відміну від наших результатів, вони дійшли висновку, що підвищення регуляції Rarres1 було спричинене надмірною експресією в подоцитах. Ми не можемо виключити таку можливість, але ми виявили при захворюваннях людини чітку індукцію експресії Rarres1 в ЕК. Одним із механізмів, що пояснює наші висновки, може бути те, що розчинна форма Rarres1, що виробляється подоцитами, поглинається GEC. Однак результати, які ми виявили мРНК Rarres1 в EC шляхом гібридизації in situ і що Rarres1 також був індукований у перитубулярних капілярних EC, рішуче підтверджують ідею про те, що експресія Rarres1 при захворюваннях нирок в основному має ендотеліальне походження.

Малюнок 7|Ендотеліально-специфічна абляція Rarres1 послаблює пошкодження нирок у мишей, які отримували нефротоксичну сироватку (NTS). (a) Генерація мишей з умовним нокаутом, у яких Rarres1 специфічно видаляється в ендотеліальних клітинах за допомогою системи рекомбінації Cre-LoxP. Екзон 3 видаляється під час рекомбінації, опосередкованої Tie2-Cre. (b) Генотипування було підтверджено препаруванням хвоста та полімеразною ланцюговою реакцією на (продовження)

Малюнок 7|(продовження) 4 тижні. (c) Репрезентативні документи вестерн-блоттингу та узагальнені дані, що демонструють відносні рівні білка Rarres1 у корі нирок у різних групах мишей, які отримували NTS (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Tie2_KO, n=4) і необроблені миші (Control [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (відношення="" альбуміну="" до="" креатиніну="" в="" сечі)="" у="" різних="" групах="" мишей,="" які="" отримували="" nts="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" мікрофотографії="" та="" кількісні="" показники,="" що="" демонструють="" типові="" зміни="" структури="" клубочків="" у="" різних="" групах="" мишей.="" гломерулярні="" ураження="" були="" виявлені="" в="" періодичних="" зрізах,="" забарвлених="" кислотою="" за="" шиффом="" (ctrl.,="" n="3;" контроль,="" оброблений="" nts="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" та="" кількісні="" показники="" середньої="" товщини="" базальної="" мембрани="" клубочка="" (gbm)="" і="" кількості="" щілин="" на="" мм="" gbm="" у="" різних="" групах="" мишей="" за="" допомогою="" трансмісійної="" електронної="" мікроскопії="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_ничья2_ko,="" n="16)." (g)="" репрезентативні="" конфокальні="" мікроскопічні="" зображення,="" що="" демонструють="" експресію="" нефрину,="" синаптоподіну,="" актину="" гладкої="" мускулатури="" (sma)="" і="" wt1="" у="" нирках="" різних="" груп="" мишей.="" прутки="50/10" мм.="" sma-позитивну="" область="" підраховували="" на="" поперечному="" зрізі="" кори="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" репрезентативні="" мікрофотографії="" імуногістохімічного="" фарбування="" pp65="" кортикальної="" тканини="" нирок="" у="" різних="" групах="" мишей,="" які="" отримували="" nts.="" pp65-позитивні="" ядра="" на="" клубочки="" були="" кількісно="" визначені="" в="" різних="" групах="" мишей="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" проти="" необробленого="" ctrl.,="" *p="">< 0,05="" проти="" nts-ctrl.="" дані="" виражені="" як="" середнє="" ±="" sem.="" т-критерій="" стьюдента="" використовувався="" для="" порівняння="" між="" 2="" групами.="" односторонній="" дисперсійний="" аналіз="" з="" подальшим="" пост-тестом="" тьюкі="" для="" множинних="" порівнянь="" використовувався="" для="" груп="" із="" 3="" або="" більше="" осіб.="" щоб="" оптимізувати="" перегляд="" цього="" зображення,="" перегляньте="" онлайн-версію="" цієї="" статті="" на="">

У цьому дослідженні є кілька обмежень, які слід визнати. По-перше, дослідження in vitro проводили на подоцитах, тоді як in vivo ми маніпулювали експресією в EC. Тому ми не можемо напряму пов’язати Rarres1 з активацією Axl у EC. По-друге, хоча ми могли ідентифікувати індуковану Rarres1- (залежну від Axl) активацію сигналізації NF-kB у подоцитах, ми не досліджували молекулярний механізм цього процесу. Необхідні додаткові дослідження, щоб дослідити попередній висновок про те, що Rarres1 сприяє активації Axl шляхом інгібування його протеасомно-залежної деградації. Нарешті, ми випробували наших нокаутованих тварин лише за допомогою моделі нефропатії, індукованої NTS. Таким чином, показані додаткові дослідження на тваринних моделях, щоб побачити, чи має Rarres1 патогенну роль також в інших хворобливих процесах.

Підводячи підсумок, наше дослідження демонструє, що при звичайних гломерулопатіях людини білок Rarres1, збагачений подоцитами, індукується в ЕК, що призводить до запалення, пошкодження подоцитів і фіброзу. Це потенційно опосередковується посиленням сигнального шляху NF-kB через активацію рецепторної тирозинкінази Axl (рис. 7). Rarres1 є новим біомаркером мікросудинного ураження та потенційно може бути новою терапевтичною мішенню для придушення запалення та фіброзу при ХХН

РОЗКРИТТЯ

ML є співробітником AstraZeneca, Гетеборг, Швеція. Дослідження JP підтримує AstraZeneca. Усі інші автори заявили про відсутність конкуруючих інтересів.

ПОДЯКА

Це дослідження було підтримано KM-H від Diabetes Wellness Sverige та JP від ​​KI/AZ Integrated Metabolic Center, Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, Swedish Diabetes Foundation, Swedish Kidney Foundation та Center for Innovative Medicine.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

KM-H, ML і JP розробили дослідження; КМ-Н, ДД, ЕС, СЗ, ГГ виконали дослідження; KM-H і XL проаналізували дані; AW надав зразки людей; а KM-H і JP написали статтю.

Чому рецептор ретиноєвої кислоти Responder1 може сприяти розвитку гломерулярних захворювань?

ДОДАТКОВИЙ МАТЕРІАЛ

Додатковий файл (PDF)

Таблиця S1. У цьому дослідженні для RT-PCR у реальному часі використовувалися пари праймерів цільових генів.

Таблиця S2. У цьому дослідженні використовували антитіла. Додатковий файл (PowerPoint)

Малюнок S1. Надмірна експресія Rarres1 не активує неканонічний сигнальний шлях NF-kB. Типовий документ вестерн-блоттингу та узагальнені дані, які показують, що надмірна експресія Rarres1 не активує p100/p52 у подоцитах, оброблених 10 нг/мл TGF-b1 (n=2). Дані виражені як середнє значення ± SD. Для порівняння між двома групами використовувався t-критерій Стьюдента. Ю.Т., нелікований.

Малюнок S2. Встановлення подоцит-специфічних мишей з нокаутом Rarres1 (Creþ/Rarres1flfl/flfl). (A) Традиційний ПЛР-аналіз канальцевої та клубочкової фракцій, а також тканини печінки. (B) Гістологічне дослідження (PAS-фарбування) патології нирок у мишей Cre– /Rarres1flfl/flfl і Creþ/Rarres1flfl/flfl. (C) Репрезентативні трансмісійні електронні мікрофотографії (TEM) і кількісне визначення середньої товщини базальної мембрани клубочка (GBM) і кількості щілин на мм GBM у різних групах мишей (n=3). (D) Репрезентативні конфокальні мікроскопічні зображення, що демонструють експресію подоцит-специфічних маркерів, синаптоподіну та нефрину, у специфічних для подоцитів Rarres1 нокаутних (Creþ/Rarres1flfl/flfl) та контрольних (Cre– /Rarres1flfl/flfl) мишей. Стержень=10 мм.

Малюнок S3. Рівні експресії маркерів подоцитів і CD31 у нирках мишей, які отримували NTS. (A) Репрезентативні конфокальні мікроскопічні зображення, що демонструють експресію нефрину, WT-1 і синаптоподіну в подоцитах мишей, які отримували NTS-специфічні нокаути подоцитів Rarres1 (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) і контрольних однопомітних тварин (Cre– /Rarres1flfl/ flfl ). Штрих=10 мм (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Частка CD31-позитивних капілярів у перитубулярних областях. Тридцять перитубулярних областей оцінювали на мишу. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Контрольна робота студента. (C) Напівкількісна оцінка сигналу CD31 у клубочках: 0=немає сигналу, 1=слабкий сигнал, 2=помірний сигнал, 3=сильний сигнал. Десять клубочків, оцінених у кожної миші (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Контрольна робота студента.

Малюнок S4. Рівні експресії маркерів фіброзу, запалення та пошкодження канальців у нирках мишей, які отримували NTS. (A) Репрезентативні конфокальні мікроскопічні зображення, що демонструють експресію -Sma в нирках у мишей, які отримували NTS, нокаутованих специфічних подоцитів Rarres1 (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) і контрольних однопомітних (Cre– /Rarres1flfl/flfl ). Стержень=100 мм. (B) Відносні рівні мРНК різних генів, пов’язаних із запаленням, фіброзом і пошкодженням ниркових канальців, у корі нирок мишей, які отримували NTS. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" порівняно="" з="" контролем="" (контроль);="" дані="" виражені="" як="" середнє="" значення="" ±="" sem.="" для="" порівняння="" між="" 2="" групами="" використовувався="" t-критерій="" стьюдента="" (фіктивне="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Малюнок S5. Експресія C31 і активованого P65 в оброблених NTS нирках. (A) Частка CD31-позитивних капілярів у перитубулярних областях. Тридцять перитубулярних ділянок оцінювали на мишу (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Т-критерій Стьюдента. (B) Напівкількісна оцінка сигналу CD31 у клубочках: 0=немає сигналу, 1=слабкий сигнал, 2=помірний сигнал, 3 =сильний сигнал. У кожної миші було оцінено десять клубочків (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Т-критерій Стьюдента. (C) Репрезентативні документи вестерн-блоттингу та узагальнені дані, що демонструють відносні рівні білка pP65 у корі нирок у різних групах мишей, які отримували NTS, і контрольних мишей без лікування (контроль) (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Tie2_KI, n=10). Дані виражені як середнє значення ± SEM. Т-критерій Стьюдента використовувався для порівняння між 2 групами.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Reidy K, Kang HM, Hostetter T, Susztak K. Молекулярні механізми діабетичної хвороби нирок. J Clin Invest. 2014; 124: 2333-2340.

2. Lai KN, Tang S, Schena F та ін. IgA нефропатія. Nat Rev Dis Primers. 2016; 2: 16001.

3. Lal MA, Patrakka J. Розуміння біології подоцитів для розробки нових засобів для лікування нирок. Фронт Ендокринол (Лозанна). 2018; 9: 409.

4. Ju W, Greene C, Eichinger F та ін. Визначення специфічності клітинного типу на транскрипційному рівні при захворюваннях людини. Genome Res. 2013; 23: 1862–1873.

5. Ju W, Nair V, Smith S та ін. Ідентифікація епідермального фактора росту як біомаркера хронічного захворювання нирок на основі тканинного транскриптому. Sci Transl Med. 2015;7:316ra193.

6. Воронецька К.І., Парк А., Мохтат Т. та ін. Транскриптомний аналіз діабетичної хвороби нирок людини. Цукровий діабет. 2011;60:2354-2369.

7. Віггінс JE, Patel S, Shedden K та ін. NFkappaB сприяє запаленню, коагуляції та фіброзу старіючого клубочка. J Am Soc Nephrol. 2010; 21: 587-597.

8. Пракура Н., Каввадас П., Корман Р. та ін. NFkappaB-індукований періостин активує передачу сигналів інтегрину-бета3, щоб сприяти пошкодженню нирок при ГН. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1475-1490.

9. Chang AS, Hathaway CK, Smithies O, Kakoki M. Трансформуючий фактор росту бета1 і діабетична нефропатія. Am J Physiol Renal Physiol. 2016; 310: F689–F696.

10. Mudge SJ, Paizis K, Auwardt RB та ін. Активація ядерного фактора каппа B подоцитами в аутологічній фазі пасивного нефриту Геймана. Kidney Int. 2001;59:923-931.

11. Томіта Т., Такано М., Томіта Р. та ін. Транскрипційний фактор-приманка для NFkappaB пригнічує експресію цитокінів і молекули адгезії в синовіальних клітинах, отриманих від ревматоїдного артриту. Ревматологія (Оксфорд). 2000;39:749–757.

12. Zambrano S, Möller-Hackbarth K, Li X та ін. GPRC5b модулює запальну реакцію вклубочкові захворюваннячерез шлях NF-kappaB. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1573-1586.

13. Choi M, Schreiber A, Eulenberg-Gustavus C та ін. Блокада ендотеліального NF-kappaB скасовує ANCA-індукований ГН. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 3191-3204.

14. Zheng L, Sinniah R, Hsu SI. In situ гломерулярна експресія активованого NF-kappaB при вовчаковому нефриті та іншій непроліферативній протеїнурічній гломерулопатії. Вірховська арка. 2006;448:172-183.

15. Takemoto M, He L, Norlin J та ін. Широкомасштабна ідентифікація генів, залучених до розвитку та функції ниркових клубочків. EMBO J. 2006; 25: 1160–1174.

16. Saleem MA, O Hare M, Reiser J та ін. Умовно увічнена клітинна лінія подоцитів людини, що демонструє експресію нефрину та подоцину. J Am Soc Nephrol. 2002;13:630-638.

17. Kisanuki YY, Emoto N, Ohuchi T, et al. Низький кров'яний тиск у мишей з нокаутом ендотеліну 1, специфічних для ендотеліальних клітин. Гіпертонія. 2010;56:121-128.

18. МакАду С.П., Пусі К.Д. Антигломерулярна хвороба базальної мембрани. Clin J Am Soc Nephrol. 2017; 12: 1162-1172.

19. Qi XM, Wang J, Xu XX та ін. FK506 зменшує альбумінурію шляхом покращення експресії подоцитів нефрину та подоцину у діабетичних щурів. Inflflamm Res. 2016;65:103-114.

20. Wang X, Saso H, Iwamoto T та ін. TIG1 сприяє розвитку та прогресуванню запального раку молочної залози через активацію Axl-кінази. Cancer Res. 2013;73:6516–6525.

21. Holland SJ, Pan A, Franci C та ін. R428, селективний маломолекулярний інгібітор Axl-кінази, блокує поширення пухлини та подовжує виживаність у моделях метастатичного раку молочної залози. Cancer Res. 2010;70:1544-1554.

22. Майерс Ш., Брантон В.Г., Юніті-Броцета А. Інгібітори AXL при раку: перспектива медичної хімії. J Med Chem. 2016;59:3593–3608.

23. Salant DJ, Darby C, Couser WG. Експериментальний мембранозний гломерулонефрит у щурів. Кількісні дослідження утворення клубочкових імунних відкладень в ізольованих клубочках і цілих тварин. J Clin Invest. 1980;66:71-81.

24. Berthier CC, Bethunaickan R, Gonzales-Rivera D, et al. Міжвидовий аналіз транскрипційної мережі визначає спільні запальні реакції при вовчаковому нефриті мишей і людини. J Immunol. 2012; 189: 988-1001.

25. Грейсон П, Едді С, Тароні Дж та ін. Метаболічні шляхи та імунометаболізм при рідкісних захворюваннях нирок. Енн Реум Дис. 2018;77: 1226–1233.

26. Liu P, Lassen E, Nair V та ін. Транскриптомне та протеомне профілювання дає уявлення про функцію мезангіальних клітин при IgA-нефропатії. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 2961-2972.

27. Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Ефективний відбір трансфектантів з високою експресією з новим еукаріотичним вектором. Ген. 1991;108:193-199.

28. Loefflfler I, Wolf G. Перехід епітелію в мезенхіму при діабетичній нефропатії: факт чи вигадка? Клітини. 2015; 4: 631-652.

29. Нагпал С, Пател С, Асано А та ін. Тазаротен-індукований ген 1 (TIG1), романретиноєва кислотарецепторно-реагуючий ген у шкірі. J Invest Dermatol. 1996;106:269-274.

30. Jing C, El-Ghany M, Beesley C та ін. Експресія гена 1 (TIG1), індукована тазаротеном, у карциномах передміхурової залози та її зв’язок із пухлиногенністю. J Natl Cancer Inst. 2002;94:482-490.

31. Teufel A, Becker D, Weber SN та ін. Ідентифікація RARRES1 як основного регулятора при фіброзі печінки. J Mol Med (Берл). 2012;90:1439-1447.

32. Chen A, Feng Y, Lai H та ін. Розчинний RARRES1 індукує апоптоз подоцитів для сприянняклубочкова хворобапрогресування. J Clin Invest. 2020; 130: 5523–5535.

33. Zhen Y, Lee IJ, Finkelman FD, Shao WH. Цілеспрямоване інгібування тирозинкінази рецептора Axl полегшує вовчакоподібний нефрит, індукований анти-GBM. J Аутоімунний. 2018;93:37-44.

34. Tang Y, Harrington A, Yang X та ін. Внесок лінії Tie2þ в примітивні та дефінітивні гемопоетичні клітини. Буття. 2010; 48: 563-567