Фіксатор Карновського запобігає виникненню артефактів у вигляді вакуолізації, яка є результатом обробки тканин у нирках, оброблених антисмисловим олігонуклеотидом Ⅰ

Анотація: Антисмисловий олігонуклеотид(ASO) терапія була визначена як новий метод лікування дляважковиліковні хвороби. внирок, оброблених АСО, в проксимальних канальцях, крім базофільних гранул, часто спостерігаються вакуолі. У деяких звітах описано, що ці вакуолі, ймовірно, є вторинним явищем у результатівилучення АСОпід час обробки тканин. У цьому дослідженні ми порівнювали морфологію нирок після фіксації фіксатором за Карновським або 4% параформальдегідфосфатним буфером (PFA) з морфологією 10% нейтрального буферного формальдегідного розчину (NBF). Було досліджено самок щурів Sprague-Dawley, яким чотири рази внутрішньовенно вводили 50 мг/кг блокованої нуклеїнової кислоти, що містить антисмислові олігонуклеотиди (LNA-ASO) протягом 1 або 2 тижнів. Мікроскопічно в нирках, фіксованих NBF, спостерігалися вакуолі та базофільні гранули в проксимальних канальцях. Базофільні гранули свідчать про накопичення ASO. Крім того, деякі з вакуолей також містили слабкі базофільні гранули, що свідчить про те, що вакуолі мають відношення до накопичення ASO. Хоча помірна вакуолізація спостерігалася в проксимальних канальцях, більшість вакуолізованих епітеліїв були негативними на молекулу пошкодження нирок-1 при імуногістохімічному фарбуванні. Вакуолі в проксимальних канальцях не спостерігалися у зразках, підданих фіксації за Карновським, хоча спостерігалися базофільні гранули. У зразках, підданих фіксації PFA, спостерігалися вакуолі та базофільні гранули в проксимальних канальцях, подібні до тих, що були у зразках, підданих фіксації NBF. Загалом, наші результати продемонстрували можливість переоцінки вакуолізації через артефакти під час обробки тканини при використанні звичайної фіксації NBF. Фіксатор Карновського вважається корисною альтернативою для відмінності штучних вакуолей від справжньої нефротоксичності. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Ключові слова:антисмисловий олігонуклеотид, артефакт,фіксатор Карновського, вакуолізація, базофільна гранула, нирка

Добавка Cistanche Доповнення для підтримки функції нирок PhGs75% Ech 30% Act 12%

Нещодавно терапія антисмисловими олігонуклеотидами (ASO) була створена як нові способи лікування важковиліковних захворювань1, 2. ASO – це короткі синтетичні одноланцюгові олігодезоксинуклеотиди, які зв’язуються з рибонуклеїновою кислотою та пригнічують експресію генів3.

Токсикологічно індукована ASO токсичність класифікується на залежну від гібридизації токсичність, пов’язану з послідовністю ASO, і незалежну від гібридизації токсичність, пов’язану з хімічною модифікацією. Токсичність, яка не залежить від гібридизації, спричинена трьома основними механізмами: 1) накопиченням ASO, 2) прозапальними ефектами та 3) ефектами зв’язування аптамерів4. Накопичення АСО в першу чергу спостерігається в печінці та нирках, а надмірне накопичення призводить до дисфункції цих органів5. Прозапальний ефект індукується стимуляцією вродженої імунної системи через зв’язування з Toll-подібними рецепторами у гризунів і мавп або активацією альтернативного шляху комплементу через інгібування фактора H ASOs у мавп6. Ефект зв’язування аптамерів індукує активацію тромбоцитів і агрегацію/тромбоцитопенію для зв’язування тромбоцит-специфічного рецептора7. Крім того, аптамерне зв’язування з внутрішньоклітинними білками в гепатоцитах вважається однією з причин гепатотоксичності 8–10. Щоб виявити цю токсичність, дослідники розробили кілька доклінічних аналізів; серед них патогістологічне дослідження є одним із найбільш чутливих тестів для виявлення накопичення ASO.

Гістопатологічно накопичення ASO зазвичай спостерігається у вигляді базофільних гранул у цитоплазмі клітин Купфера в печінці або проксимальних канальцях нирок. Помітне накопичення базофільних гранул корелює з підвищеною частотою або тяжкістю дегенеративних змін, які зазвичай спостерігаються як вакуолізація або дегенерація/некроз проксимального канальцевого епітелію в нирках4. Базофільні гранули самі по собі не вважаються токсикологічно значущими11; отже, диференціація накопичення базофільних гранул від дегенеративних змін є важливою для оцінки токсичності, пов’язаної з ASO.

Вакуолі, які часто спостерігаються в проксимальних канальцях нирок мавп cynomolgus, яких лікували ASO, містять базофільний матеріал і демонструють такий самий загальний розподіл у клітинах, як і базофільні гранули11, 12. Кілька звітів припускають, що процес фіксації може впливати на поява накопичення ASO всередині фаголізосомального компартменту5, 11. Крім того, Henry et al. і Engelhardt описали, що вакуолі в проксимальних канальцях, ймовірно, є вторинним явищем, що виникає в результаті екстракції ASO під час обробки, оскільки вакуолі відсутні в нирках, фіксованих перфузією параформальдегіду/глутаральдегіду5, 11. Вакуолі в проксимальних канальцях яванських мавп, які отримували лікування припускали, що з міпомерсеном з’являються під час процесу фіксації13.

Таким чином, хоча вакуолізація внаслідок лікування ASO може бути артефактом у деяких випадках, ця гіпотеза не була чітко доведена, і жодні звіти не ідентифікували відповідний метод фіксації для токсикологічної оцінки. Відповідно, у цьому дослідженні ми порівнювали морфологію нирок після фіксації фіксатором за Карновським або 4% параформальдегідфосфатним буфером (PFA) з морфологією 10% нейтрального буферного формальдегідного розчину (NBF). Крім того, ми продемонстрували корисність фіксатора Карновського як альтернативного фіксатора для запобігання вакуолізації, спричиненої артефактами.

Чотиритижневі самки щурів Sprague-Dawley були придбані в Charles River Laboratories Japan Inc. (Канагава, Японія) і акліматизовані до лабораторних умов. Тварин утримували в контрольованих умовах (12-годинний цикл світла/темряви, температура 23 ± 2 градуси, відносна вологість 50 ± 25%) і мали вільний доступ до стандартної комерційної дієти (автоклавований CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Токіо, Японія) і водопровідну воду. Двадцять тварин було розподілено на наступні чотири групи (по п’ять тварин у кожній): група 1-тижневого лікування фізіологічним розчином (контроль- 1W), 2-група тижневого лікування фізіологічним розчином (контроль{ {14}}W), 1-група, оброблена антисмисловим олігонуклеотидом (LNA-ASO), 1-заблокована нуклеїнова кислота (LNA-ASO) (ASO-1W), і 2-група, оброблена LNA ASO (ASO-2W). На момент початку введення 50 мг/кг LNA-ASO тваринам було 5 тижнів. LNA-ASO вводили внутрішньовенно чотири рази загалом за такою схемою: дні 1, 4, 8 та 11 у групі ASO-2W; і дні 1, 2, 3 і 4 у групі ASO-1W. Тварин у групах Control-1W та ASO-1W були забиті на 7-й день. Тварин у групах Control-2W та ASO-2W були забиті в день 14. При кожному термінальному розтині трупа зразки крові на клінічну патологію відбирали з черевної порожнистої вени під глибокою анестезією ізофлураном. Після забору крові всіх щурів евтаназували шляхом знекровлення шляхом негайного перерізання черевної аорти. Зовнішня поверхня тіла, грудна і черевна порожнини, внутрішні органи були досліджені макроскопічно, а ліві нирки були вилучені та оброблені для мікроскопічного дослідження. Усі процедури проводились згідно з Правилами годівлі та зберігання піддослідних тварин і експериментальних тварин Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Зразки сироватки отримували центрифугуванням зразків крові при 4 градусах. Біохімічний аналіз сироватки проводили за допомогою приладу TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Точігі, Японія) для оцінки рівнів азоту сечовини крові (BUN) і креатиніну (CRE).

Нирки фіксували за допомогою трьох фіксуючих розчинів наступним чином: після поділу нирки поперечно на три сегменти середню частину, включаючи ниркову балію, фіксували в 10% NBF протягом 5 днів; краніальну частину фіксували у фіксаторі Карновського (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Токіо, Японія); і каудальна частина була зафіксована в 4% PFA протягом 17 годин при 4 градусах, а потім поміщена в 10% NBF на 24 години. Кожен фіксований зразок був зневоднений і залитий у парафін. Зрізи тканини готували для фарбування гематоксиліном і еозином (H&E). Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням антитіл, націлених на молекулу пошкодження нирок-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота, США; розведення 1:300) та лізосомально-асоційований мембранний білок 2 (LAMP{{ 13}}; Уолтем, Массачусетс, розведення 1:1000) після вилучення антигену (цитратний буфер, рН 6,0, нагрівання протягом 10 хвилин або нагрівання під тиском протягом 20 хвилин). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Токіо, Японія) використовували як вторинне антитіло.

Служба підтримки Wecistanche:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop