Добавки заліза уповільнюють старіння та подовжують тривалість життя клітин завдяки посиленню функції мітохондрій Ⅱ
Mar 23, 2023
3.2. Добавки заліза підвищують стійкість до окислювального стресу
Старіння клітин пов'язане зпідвищений окислювальний стресщо пошкоджує біологічні системи та пом’якшує вікові захворювання [34]. Оскільки добавки заліза сповільнювали старіння, ми дослідили його вплив наокислювальний стрес. Ми використовувалиокислювальний стрессполука-індуктор, перекис водню (H2O2), щоб перевірити стійкість клітин до окислення. Клітини спочатку вирощували в присутності заліза до стадії стаціонарної фази (72 год) у середовищі SD. Після цього клітини промивали та інкубували з різними концентраціями H2O2 у середовищі YPD і росли протягом 24 год.Окислювальнийстійкість до стресу аналізували шляхом порівняння росту клітин, оброблених H2O2-, з необробленим контролем. Ми виявили, що клітини, додані залізом, були стійкими до окислювального стресу порівняно з контролем (рис2a і S3). Щоб підтвердити, що добавки заліза забезпечують стійкість до окислювального стресу, BPS додали до заліза та росту клітин з H2O2 було проаналізовано. Додавання BPS зменшило стійкість до окислювального стресу клітин, що містять залізо (рис2б). Ці результати корелюють із роллю добавок заліза в уповільненні старіння та подовженні тривалості життя клітин.
3.3. Добавки заліза посилюють функції мітохондрій
Мітохондрії є основним клітинним центром для утилізації та метаболізму заліза [35–38]. Зниження функцій мітохондрій пов’язане зі старінням [39–43]. Залізо є кофактором кількох мітохондріальних білків, включаючи залізо-сірчані кластери та гемовмісні білки [44–46]. Ці білки, що містять залізо, беруть участь у циклі мітохондріальної трикарбонової кислоти (TCA) і ланцюзі транспортування електронів (ETC) (рис. 3a). Ми досліджували, чи потребує мітохондріальних функцій збільшення тривалості клітинного життя за допомогою добавки заліза. Щоб перевірити це, ми проаналізували експресію генів мітохондріального циклу TCA. Ми виявили, що добавки заліза значною мірою індукують експресію кількох генів циклу TCA (рис. 3b і S4a). Метаболіти циклу TCA - кетоглутарат і оксалоацетат можуть продукувати глутамат і аспартат шляхом катаплеротичних реакцій у мітохондріях (рис. 3а). Ці амінокислоти використовуються в біосинтезі білків, ліпідів і нуклеотидів [47–49]. Цікаво, що експресія біосинтетичних генів глутамату (GDH1 і GDH3) і аспартату (AAT1 і AAT2) була знижена в клітинах, доповнених залізом (рис. 3c). Цей профіль експресії свідчить про те, що добавки заліза сприяють збереженню, а не споживанню проміжних продуктів циклу TCA. Згідно з цією ідеєю, експресія генів мітохондріального анаплеротичного шляху (PYC1, PYC2 і GDH2) була значно збільшена в клітинах з добавками заліза (рис. 3c). PYC1 і PYC2 кодують піруваткарбоксилазу, яка перетворює піруват в оксалоацетат. GDH2 кодує глутаматдегідрогеназу, яка синтезує -кетоглутарат з глутамату. Разом ці результати свідчать про те, що добавки заліза налаштовують клітини в метаболічний стан, який сприяє анаплерозу та запобігає катаплерозу для активізації метаболітів циклу ТЦА.
малюнок 3.Добавки заліза покращують функції мітохондрій. (a) Огляд мітохондрійЦикл TCA (трикарбонової кислоти) та ETC (ланцюг транспортування електронів) з основними катаплеротичними тапроілюстровано анаплеротичні реакції. (b) Штам прототрофних дріжджів інкубували зі 100µM FeSO4 і вирощували в середовищі SD протягом 8 годин при 30◦C. РНК екстрагували з культур іЕкспресію зазначених генів циклу ТСА аналізували за допомогою кількісної ОТ-ПЛР. (c) Виразаналіз катаплеротичних генів (GDH1, GDH3, AAT1,іAAT2) і анаплеротичні гени (PYC1, PYC2,іGDH2) проводили за допомогою кількісної RT-PCR. (d) Аналіз експресії генів ETC проводивкількісна RT-PCR. Статистична значущість (*p < 0.05) was determined by Student's t-тест.
Реакції циклу TCA утворюють NADH і FADH2 які окислюються ETC-комплексами I і II і необхідні для функціонування циклу ТСА (рис.3а). ХочаS. cerevisiaeне має комплексу I, відновлюючі еквіваленти переносяться в дихальний ланцюг через НАДН-дегідрогенази. Сукцинатдегідрогеназа відіграє центральну роль і бере участь як у циклі ТСА, так і в комплексі ETC II (рис.3а). Вражає, що експресія сукцинатдегідрогенази (SDH1іSDH2) був сильно активований серед усіх проаналізованих генів циклу TCA (рис3б,г). Ці результати вказують на те, що потік циклу TCA продовжується до ETC замість накопичення конкретного проміжного продукту. Подібним чином, експресія всіх інших генів комплексів ETC була сильно активована в клітинах, які отримували залізо (рис.3г). ETC пов'язаний з утворенням активних форм кисню (АФК), які регулюють експресіюSOD2ген [50]. Він кодує марганець-супероксиддисмутазу (MnSOD), яка є основним поглиначем мітохондріального супероксиду.SOD2експресія генів посилювалася в клітинах із добавками заліза (додатковий малюнок S4a), що узгоджується з експресією генів ETC. Далі ми проаналізували мітохондріальний мембранний потенціал (ММП), який генерується протонними насосами комплексів ETC I, III та IV. Ми виявили, що добавки заліза підвищують ММП клітин (додатковий малюнок S4b). Потім ми досліджували структуру мітохондрій за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Ми виявили, що добавки заліза запобігають фрагментації мітохондрій (додатковий малюнок S4c). Загалом ці результати вказують на те, що добавки заліза потенціюють мітохондріальні функції клітин.
3.4. Добавки заліза підвищують рівень АТФ, необхідний для продовження тривалості життя клітин
Реакції мітохондріального циклу TCA створюють відновні еквіваленти NADH і FADH2, які передають електрони до ETC і генерують аденозинтрифосфат (АТФ) шляхом окисного фосфорилювання (OXPHOS) (рис.3а). Оскільки експресія циклу TCA та генів ETC була посилена добавками заліза, ми перевірили його вплив на синтез АТФ. У відповідності з профілем експресії мітохондріального циклу TCA, експресія гена ETC і рівні АТФ були високими в клітинах, які отримували залізо (рис.4а). Потім ми запитали, чи потрібен АТФ для подовження тривалості життя клітин, доповнених залізом. Ми пригнічували синтез АТФ і вимірювали CLS дріжджів. Антиміцин А (AMA) є інгібітором синтезу АТФ, який зв’язується з комплексом III і блокує перенесення електронів у мітохондріальних ETC [51]. Спочатку ми перевірили рівень АТФ і виявили, що лікування AMA пригнічує синтез АТФ (рис4б). Ми далі перевірили вплив AMA на тривалість життя клітин, що містять залізо. Дріжджові клітини інкубували із залізом і AMA в середовищі SD. Ріст клітин досяг насичення через 24 години (додатковий малюнок S5). Згодом ми виміряли виживаність і виявили, що лікування AMA пригнічує опосередковане добавками заліза подовження тривалості життя (рис.4в). Разом ці результати показують, що добавки заліза підвищують рівень АТФ, який необхідний для продовження тривалості життя клітин. Ми також спостерігали, що тривалість життя клітин, оброблених АМА, була нижчою, ніж контроль (рис4c), додатково підтверджуючи, що нездатність синтезувати АТФ погіршує тривалість життя.
3.5. Добавки заліза запобігають прискореному старінню нокаутного мутанта AMPK
AMPK є головним регулятором гомеостазу клітинної енергії [20,21]. Висококонсервативний людський аналог AMPK у дріжджахS. cerevisiaeце білок Snf1 [52]. AMPK активує мітохондріальні функції для виробництва АТФ в умовах обмеженої енергії. Недавні звіти показали, що зниження мітохондріальних функцій із віком частково відбувається через порушення активності AMPK в організмах різного віку [53,54]. Таким чином, відсутність активності AMPK впливає на функції мітохондрій і ставить під загрозу численні клітинні функції, включаючи метаболізм, стійкість до стресу та виживання клітин, які є найважливішими детермінантами старіння та тривалості життя. Відповідно до попередніх досліджень мивиявив, щоsnf1нокаутна мутація скомпрометувала рівень АТФ, стійкість до окислювального стресу та тривалість життя (рис.5a–c).
малюнок 5.Добавки заліза рятують від прискореного старіння нокаутного мутанта AMPK. Theдріжджовий прототрофний дикий тип і нокаутний мутант AMPK (snf1∆) штами вирощували до стаціонарнихфазі в середовищі SD протягом 72 годин при 30◦C. (a) Аналіз АТФ дикого типу іsnf1∆ штами. (b) Окислювальнийаналіз стресу дикого типу іsnf1∆ штами з різними H2O2 концентрації. (c) Хронологічнийаналіз тривалості життя (CLS) дикого типу таsnf1∆ штами. (d) Аналіз АТФ дикого типу іsnf1∆ штамиінкубували з різними концентраціями FeSO4. (e) Аналіз окисного стресу дикого типу таsnf1∆ штами, інкубовані з різними концентраціями FeSO4. (f) CLS-аналіз дикого типу таsnf1∆ штами, інкубовані з різними концентраціями FeSO4. Статистична значущість (*p < 0.05) was determinedвід Student'st-тест.
Оскількиsnf1мутант має дефекти мітохондріальних функцій, ми перевірили, чи можуть добавки заліза врятувати фенотипи прискореного старіння. Тому ми доповнили залізо доsnf1мутант і проаналізував рівень АТФ, окислювальний стрес і тривалість життя. Ми виявили, що добавки заліза підвищують рівень АТФ, стійкість до окислювального стресу та тривалість життя (рис.5d–f). Загалом ці результати підтвердили, що добавки заліза уповільнюють старіння та подовжують тривалість життя клітин за рахунок збільшення функцій мітохондрій.
4. Обговорення
Поживні речовини визначають функціональний стан клітин, а дефіцит основних поживних речовин загрожує здоров’ю людини [55,56]. Крім того, поживні речовини є основними регуляторами клітинного метаболізму, який контролює декілька біологічних процесів, у тому числістаріння, основний фактор ризику кількоххронічні захворювання. Зниженняметаболічна активністьє однією з ознакстаріння [10]. Нещодавні дослідження на різних організмах, включаючи ссавців, показали, що затримка старіння та збільшення тривалості здоров’я є можливим шляхом втручання проти старіння, включаючи введення препаратів рапаміцину та метформіну [11,16]. Ці препарати спрямовані на комплекси чутливих до поживних речовин TORC1 і AMPK, які є важливими метаболічними регуляторами клітин [11,16].
Залізо є важливою поживною речовиною, яка бере участь у кількох важливих метаболічних реакціях у клітинах [23–26]. Дефіцит заліза порушує метаболічну активність, що призводить до порушення клітинних функцій, що призводить до багатьох захворювань, включаючи анемію, когнітивні порушення та втратусила м'язів [26,57–59]. Дефіцит заліза широко поширений серед людей похилого вікуБільше або дорівнює65 років [60–62].
Оскільки залізо регулює обмінні процеси, ми дослідили його роль у старінні. Ми використали дріжджі як модель організму для вивчення ролі заліза в хронологічному старінні. Ми досліджували вплив добавок заліза на CLS дріжджів. Ми виявили, що обидва FeSO4 і FeCl3 збільшив тривалість життя клітин. Використовуючи різні солі сульфату, хлориду та хелатора заліза, ми підтвердили, що залізо подовжує тривалість життя клітини. Старіння пов’язане з поступовим накопиченням окисного стресу, який шкідливий для клітинних функцій і знижує виживання клітин [34]. Оскільки ми виявили, що добавки заліза сповільнюють старіння, ми перевірили, чи можуть вони забезпечити стійкість до окислювального стресу. Щоб дослідити фенотип окисного стресу, ми обробили клітини індуктором окиснення H2O2 і вимірювали виживання клітин. Ми виявили, що добавки заліза підвищили стійкість до окисного стресу порівняно з контролем. Ці висновки корелюють із роллю добавок заліза в подовженні тривалості життя.
Ми далі розгадали механізм омолодження старіння добавок заліза. Мітохондрії є основними клітинними споживачами утилізації та метаболізму заліза [35–38]. Спочатку ми проаналізували експресію генів мітохондріального циклу TCA. Ми виявили, що експресія майже всіх генів циклу TCA була активізована за допомогою добавок заліза. Важливо, що добавки заліза знижували експресію мітохондріального анаплерозу та посилювали катаплеротичні метаболічні гени. Ці результати показують, що добавки заліза посилюють синтез проміжних продуктів циклу TCA і запобігають їх використанню клітинами. Ці висновки підтвердили антистарільну дію добавок заліза, оскільки регулярний експорт проміжних продуктів циклу TCA впливає на цілісність мітохондрій [47]. Крім того, поповнення мітохондріального пулу вуглецю є важливим для підтримки мітохондріальних функцій, необхідних для виживання під час клітинного старіння.
Проміжний цикл TCA було показано, що кетоглутарат подовжує тривалість життя різних організмів [63]. Однак ми виявили, що добавки заліза посилюють експресію -кетоглутаратдегідрогеназа (KGD1і2 кг), який перетворює - кетоглутарат з утворенням сукциніл-КоА. Крім того, ми спостерігали, що експресія генів сукцинатдегідрогенази (SDH1іSDH2) був сильно активований серед інших протестованих генів циклу ТСА. Важливо, що сукцинатдегідрогеназа бере участь як у циклі ТСА, так і в комплексі ETC II. Ці результати свідчать про те, що замість накопичення певного проміжного продукту циклу TCA, антистарільна активність добавок заліза може включати шлях ETC.
Оскільки цикл TCA функціонально пов’язаний з ETC, ми проаналізували експресію генів ETC. Ми виявили, що добавки заліза сильно регулюють експресію генів ETC. Продукти циклу TCA NADH і FADH2 окислюються комплексами ETC і генерують АТФ через OXPHOS. Ми виявили, що добавки заліза підвищують рівень клітинного АТФ, що корелює з активацією циклу ТСА та генів ETC. Далі ми з’ясували, чи потрібне збільшення рівня АТФ за допомогою добавки заліза для продовження тривалості життя клітин. Ми виявили, що подовження тривалості життя за допомогою добавок заліза було скасовано шляхом інгібування синтезу АТФ. Таким чином, ці висновки свідчать про те, що добавки заліза підвищують рівень АТФ, який необхідний для продовження тривалості життя клітин. Наші результати узгоджуються з попередніми звітами, які показують роль АТФ у тривалості життя клітин [51,64,65]. Крім того, ми використовували добавки заліза для посилення мітохондріальних функцій і врятували короткий термін життя та чутливий до окислювального стресу фенотип мутанта AMPK. Загалом, ці результати показали, що добавки заліза потенціюють функції мітохондрій, які затримують старіння та збільшують тривалість життя клітин.
Недавні дослідження показали, що добавки заліза відновлюють мітохондріальний дефект мутантів з порушенням лізосом і запобігають занепаду мітохондрій під час старіння [66,67]. Таким чином, наші результати підтверджують попередні висновки про те, що добавки заліза покращують функції мітохондрій. Цікаво, що одне з попередніх досліджень показало, що добавки заліза врятували прискорене реплікативне старіння мутантів з порушенням лізосом; однак,вплив на клітини дикого типу не було включено до звіту [67]. Тим не менш, наші результати співвідносяться з попередніми висновками, і, незважаючи на різні моделі старіння (хронологічне старіння), ми виявили, що добавки заліза затримують старіння та збільшують тривалість життя клітин. Таким чином, у сукупності наші результати та попередні звіти чітко свідчать про те, що добавки заліза можуть бути потенційним терапевтичним засобом для боротьби зі старінням і збільшення тривалості здоров’я.
Додаткові матеріали:Рисунок S1: Аналіз росту та хронологічної тривалості життя дріжджових клітин із добавками заліза; Рисунок S2: Аналіз росту різних дріжджових клітин, що містять залізо, сульфат і хлорид; Рисунок S3: Аналіз стійкості до окислювального стресу дріжджових клітин, доданих заліза. Рисунок S4: Експресія мітохондріальних генів, мембранний потенціал і аналіз структури дріжджових клітин із добавками заліза; Рисунок S5: Аналіз росту дріжджових клітин, доданих залізом і антиміцином А; Таблиця S1: Список праймерів, використаних для RT-PCR у цьому дослідженні.
Авторські внески:JLJ: методологія, формальний аналіз, дослідження та рецензування; TCYN: Методологія, формальний аналіз, дослідження та рецензування; FN: перевірка, формальний аналіз та рецензування; FE: рецензування, редагування та нагляд; MA: концептуалізація, курація даних, методологія, написання, рецензування, редагування та контроль. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.
Фінансування:Цю роботу підтримали Інститут біоінформатики (BII), Фонд розвитку кар’єри A*STAR (C210112008) і грант Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758-00).
Подяки:Ми дякуємо Маурер-Стро Себастьяну, Лі Хві Куану, Лу Літ Сину, Чіаму Кенг Хві та Пракашу Арумугаму за підтримку цього дослідження.
Конфлікт інтересів:Автори заявляють про відсутність конкуруючих фінансових і нефінансових інтересів.
Список літератури
1. Блум, DE; Каннінг, Д.; Любет, А. Глобальне старіння населення: факти, виклики, рішення та перспективи.Чел. Solut. Перспектива. Дедал2015, 144, 80–92.
2. Департамент ООН з економічних і соціальних питань, Відділ народонаселення.Перспективи світового населення 2019; Основні моменти (ST/ESA/SERA/423); ООН: Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2019.
3. Робін Дж.Старіння населення: ми живемо довше, але чи здоровіші?ООН, Департамент економіки та соціальних справ, Відділ народонаселення: Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2021 р.; UN DESA/POP/2021/TP/NO.
4. Нікколі, Т.; Партрідж, Л. Старіння як фактор ризику захворювання.Curr. Biol.2012, 22, R741–R752. [CrossRef] [PubMed]
5. Хоу, Ю.; Ден, X.; Баббар, М.; Вей, Ю.; Hasselbalch, SG; Крото, DL; Бор, В. А. Старіння як фактор ризику нейродегенеративних захворювань.Нац. Нейрол.2019, 15, 565–581. [CrossRef] [PubMed]
6. Харман Д. Процес старіння: головний фактор ризику захворювань і смерті.Proc. Natl. акад. Sci. США1991, 88, 5360–5363. [CrossRef] [PubMed]
7. Партридж, Л.; Ділен, Дж.; Slagboom, PE Перед обличчям глобальних викликів старіння.природа2018, 561, 45–56. [CrossRef] [PubMed] 8. Фонтана, Л.; Кеннеді,
BK; Лонго В.Д.; Тюлені Д.; Мелов С. Медичні дослідження: лікування старіння.природа2014, 511, 405–407. [CrossRef] [PubMed]
9. Фонтана, Л.; Партрідж, Л.; Лонго, В. Д. Подовження здорового життя - від дріжджів до людини.Наука2010, 328, 321–326. [CrossRef] [PubMed]
10. López-Otín, C.; Blasco, MA; Партрідж, Л.; Серрано, М.; Кромер Г. Характерні ознаки старіння.Стільниковий2013, 153, 1194–1217. [CrossRef]
11. Партридж, Л.; Фуентеальба, М.; Кеннеді, Б. К. Прагнення уповільнити старіння через відкриття ліків.Нац. Rev. Drug Discov.2020, 19, 513–532. [CrossRef]
12. Циммерман, А.; Хофер, С.; Пендл, Т.; Кайнц, К.; Зроблений з.; Carmona-Gutierrez, D. Дріжджі як інструмент для ідентифікації сполук проти старіння.FEMS Дріжджі Res.2018, 18, foy020. [CrossRef]
13. Кеберляйн, М.; Бертнер, CR; Кеннеді, Б.К. Останні розробки в галузі старіння дріжджів.PLoS Genet.2007, 3, e84. [CrossRef]
14. Лонго В.Д.; Шадель, Г.С.; Кеберляйн, М.; Кеннеді, Б. Реплікативне та хронологічне старіння вSaccharomyces cerevisiae. клітинний метаб.2012, 16, 18–31. [CrossRef] 15. Лонго В.Д.; Фабріціо, П. Хронологічне старіння Saccharomyces cerevisiae.Старіння Res. Дріжджі2011, 57, 101–121. [CrossRef]
16. Кулкарні, А.С.; Губбі, С.; Барзілай, Н. Переваги метформіну в послабленні ознак старіння.клітинний метаб.2020, 32, 15–30. [CrossRef]
17. Альфата, М.; Вонг, Дж. Х.; Крішнан В.Г.; Лі, Ю.К.; Sin, QF; Го, CJH; Конг, KW; Лі, В.Т.; Льюїс, Дж.; Хун, С.; та ін. TORC1 регулює транскрипційну відповідь на глюкозу та цикл розвитку за допомогою шляху Tap42-Sit4-Rrd1/2 у Saccharomyces cerevisiae.BMC Biol.2021, 19, 1–22. [CrossRef]
18. Сакстон, Р.А.; Сабатіні, Д. М. Передача сигналів mTOR у рості, метаболізмі та хворобах.Стільниковий2017, 168, 960–976. [CrossRef]
