Дослідження механізму, за допомогою якого Cistanche Deserticola лікує хворобу Альцгеймера за допомогою мережевої фармакології та експериментальної перевірки

[Анотація]

 

Мета: досліджуватиПотенційний механізм Cistanche Deserticola щодо хвороби Альцгеймера (AD)черезМережева фармакологіята експерименти з тваринами.

Методи:ПрогнозуванняЦілі, пов'язані з хворобою Кістанча та Альцгеймера, за допомогою мережевої фармакології; 40 чоловіків 7- мишей SAMP8-місячних SAMP8 були випадковим чином розділені на групу контрольної моделі (модель), низькодозові (L-GCS), групу лікування середньої дози (M-GC) та високодозові (H-GCS) та 10 мишей проти старіння чоловіків Anti-SAGE SAMR1 того ж віку, використовувались як контрольна група SAMR1. Після 30 д внутрішньокастрального введення GCS, для перевірки навчальних та пам'яті кожної групи мишей використовувались експерименти з водним лабіринтом Морріса та лабіринту. Фарбування NISSL використовували для спостереження за кількістю та морфологією нейронів у області гіпокампа СА1 мишей. Імуногістохімічні фарбування та експерименти з вестерн-блот були використані для виявлення експресії PI3K, P-AKT та P-TAU у гіпокампі мишей. Результати: 8 ефективних компонентів, включаючи вербаскозид, були обстежені з Cistanche Deserticola, а основні гени, що беруть участь у лікуванні AD, були AKT1, TNF, CASP3 і т. Д. Сигнальні шляхи, пов'язані з лікуванням AD за допомогою Cistanche Deserticola, включали PI3K-AKT, шляхи TNF та вікові шляхи. Експерименти на тваринах показали, що порівняно з модельною групою, затримка втечі та загальна відстань у тесті навігації з водного лабіринту Морріс значно зменшилися (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Ключові слова]Мережева фармакологія;Хвороба Альцгеймера; Cistanche deserticola; Миші SAMP8; Апоптоз

 

 

 

Якісні рослинні добавки Cistanche

 

1 матеріали та методи

1.1 Матеріали

1.1.1 Бази даних та аналізи аналізу

Основні бази даних та платформи аналізу, що використовуються в цьому дослідженні (табл. 1).

 

Вкладка 1 Відповідні аналітичні платформи та бази даних, що використовуються в цьому дослідженні

Назва	Веб -сайт	Версія
Традиційна база даних фармакології китайської медицини (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Уніол	https://www.uniprot.org/
Пабхем	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Венні	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/
Генетики	https://www.genecards.org/
База даних NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Омім	https://omim.org/
База даних рядків	https://cytoscape.org/	11
Програмне забезпечення Cytoscape	https://cytoscape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Метасак	https://metascape.org/

 

1.1.2 Експериментальні тварини

Експериментальними тваринами, які використовувались у цьому експерименті, були чоловіки, що стосуються миші, що прискорюються миші, що прискорюються миші (SAMP8), які підняли від 2 місяців до 7 місяців і включені в експеримент. Всі тварини були вирощені в кімнаті тваринного класу SPF в Експериментальному центрі тваринного медичного коледжу Баоту Медичного коледжу Монголії університету та техніки [Syxk (Meng) 2018-0001], з температурою (24. 0 ± 1. Було забезпечено достатню кількість кормів та питної води, а миші могли вільно їсти та пити. Світло -темний цикл становив 12 год/12 год, щоб забезпечити нормальний циркадний ритм мишей. Усі операції на тваринах та експериментальні протоколи, що беруть участь у цьому експерименті, проводилися відповідно до протоколу, затвердженого експериментальним комітетом з етики тварин Медичного коледжу Баоту (Baoyi Ethics 2018 № 011).

1.1.3 Основні реагенти та інструменти

Високоефективність буфера лізису (R0010), ECL Plus Ultra-чутливий люмінесцентний розчин (PE0010), буфер електрофорезу (T1070), трансферний буфер (D1060), буфер завантаження протеїну (P1015) тощо. Комплект імуногістохімії (PV -9000) був придбаний у Пекіну Чжуншан Джинкяо; Комплект виявлення білків BCA (23227) був придбаний у Thermo Scientific, США. Фосфоіноситид 3- кіназа (PI3K) антитіло, протеїнкіназа B протеїнкіназа B (AKT) (AF0016), P -AKT -антитіло (AF6261) були придбані у Whahan Qinke Biological Center Co., Ltd. Козячий анти-кролячий вторинний антитіло (SA 00001-2) було придбано у Proteintech, США.
Paraffin Slicer (Leica, Німеччина), Оптичний мікроскоп (Лейка, Німеччина), Камера відкритого поля (Шанхайський Xinruan), Морріс Водяний лабіринт -80 ультра-низький температурний холодильник (Thermo Fisher, США), електрофорезний пристрій (Beijing Liolizy Biotizy Co. (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), Система аналізу зображень протеїну (Shanghai Tanon Technology) та зчитувач мікропланшетів (Thermo Fisher, США).

 

1.2 Методи

1.2.1 Мережевий фармакологічний аналіз

1.2.1.1 Скринінг активних інгредієнтів та цільових точок Cistanche Deserticola

Screening of target points of Cistanche deserticola: All chemical active ingredients were searched in the TCMSP database (https://www.tcmsp-e.com) with Cistanche deserticola as the keyword, and oral bioavailability (OB) Greater than or equal to 30% and drug likeness (DL) Greater than or equal to 0.18 were used as limiting conditions to екранувати зібрані сполуки; the Swiss ADME platform was used to supplement the chemical ingredients not found in the TCMSP platform with a gastrointestinal absorption (GI absorption) score of "high" and drug likeness of at least 2 "Yes" as the standard, and together with the common active ingredients of Cistanche deserticola collected by literature search, the standard names of the targets were obtained through the Uniprot database
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 Придбання цілей АД

Використовуючи "хворобу Альцгеймера" в якості пошукового терміну, шукайте цілі захворювання в базах даних OMIM, GeneCards та NCBI.

 

1.2.1.3 Створення діаграми Венна та Мережа взаємодії з білковою білкою (PPI)

Введіть цілі наркотиків та цілі хвороби на веб -сайті Венні Діаграма, створіть діаграму Венна та отримайте перетин цілей. Імпортуйте базу даних String для побудови мережі взаємодії з білками, встановіть біологічний вид на "Homo sapiens" та отримайте діаграму мережі взаємодії білків. Використовуйте програмне забезпечення Cytoscape для фільтрування основних цілей на основі ступеня, близькості та значення між цілями та використовуйте плагін з аналізом для малювання графіку.

1.2.1.4 Перейти та Кегг -аналіз

Використовуйте онлайн-платформу David Online та Metascape Online Platform для виконання аналізу збагачення GO та KEGG на вищезгаданих суміжних цілях, і обстежуйте елементи з P менше або дорівнюють 0. 05. Діаграми міхурів аналізу Go та Kegg збагачувались за допомогою мікроінформації онлайн-креслення платформи.

 

1.2.2 Експериментальна групування тварин та підготовка моделі

40 мишей SAMP8 були випадковим чином розділені на модельну групу, групу DeSerticola з низькою дозою Cistanche Deserticola (L-GCS), групу Deserticola середньої дози Cistanche (M-GCS) та групу Deserticola Cistanche з високою дозою (H-GC), з 10 мишами у кожній групі; 10 мишей SAMR1 однієї статі та ваги використовувались як контрольна група SAMR1. Група L-GCS, група M-GCS та група H-GCS були Gaved з GCS у дозі 25 мг/(кг · д), 50 мг/
(кг · d) і 100 мг/(кг · d) відповідно. Група SAMR1 та модельна група отримували однакову дозу нормального фізіологічного розчину, і всі групи були призначені протягом 30 днів поспіль.

 

1.2.3 Поведінковий експеримент

1.2.3.1 Експеримент з водним лабіринтом Морріса

Експеримент з навігації щодо розташування: 24 -го по 30 -й день адміністрації GCS експеримент з навігації розташування проводився в перші 1 - 5 днів. Водяний лабіринт був розділений на чотири квадранти, а платформа була розміщена в третьому квадранті, трохи вище, ніж поверхня води на 2 см. Мишу поміщали у воду з головою обличчям до стіни басейну, і спостерігалося, чи зможе вона знайти платформу в межах зазначених 60 секунд і залишатися на платформі протягом 2 - 3 секунди. Частота тренувань для кожної миші становила чотири рази на день, а вихідною точкою кожного разу був різний квадрант. Інтервал часу між кожними двома тренінгами не повинен бути менше 15 хвилин. Якщо миша не знайшла платформу протягом 60 секунд, вона керувалася перебування на платформі протягом 3 - 5 секунд. Під час експерименту було зафіксовано затримку втечі та довжину шляху кожної групи мишей; Через 6-7 дні був використаний експеримент з просторовим розвідкою: платформа в третьому квадранті була видалена, а миші розпочали експеримент з розвідки з першого квадранта. Час розвідки становив 60 с, і було зафіксовано кількість переїздів платформ та відсоток часу в цільовому квадранті кожної групи мишей.

 

1.2.3.2 Експеримент з Y-Maze

Y-лабіринт складається з трьох рук однакового розміру та форми: початкової руки, роману та інших рук. Перед експериментом вхід нової руки був заблокований, що дозволило мишам вільно досліджувати дві руки протягом 10 хв. Через 1 год після розвідки був відкритий вхід у нову руку, а мишу розміщували на початку початкової руки. Час, коли миша досліджувала нову руку протягом 5 хв. Швидкість спонтанної чергування миші була обчислена [Швидкість чергування (%)=Кількість успішних чергувань/(загальна кількість записів ARM -2) × 100%] [14].

 

1.2.4 Фарбування NISSL

Після 30 днів прийому лікарських засобів мишам знеболювали та перфузували фізіологічним розчином у серці. Після того, як кров зливали, мишей вбивали і взяли тканину мозку. Тканину мозку мишей фіксували за допомогою занурення в 4% параформальдегіду для 24-48 год, зневоднювали висхідним градієнтним спиртом, прозорим ксилолом і вбудовували в парафін. Товщина зрізу становила 5 мкм. Рутинне девакс до води, метиленового синього фарбування, диференціації, дегідратації етанолу, прозорого ксилолу та герметизації смоли. Морфологія та кількість нейронів у області СА1 гіпокампу миші спостерігалися під мікроскопом у 200 разів.

1.2.5 Імуногістохімічне фарбування

Зрізи тканин мозку регулярно знецінювались у воду, поміщали в розчин відновлення антигену цитрату натрію та нагрівали мікрохвильову піч високим тиском, промивали буфером PBS протягом 5 хв × 3 рази, додали ендогенну блокатор пероксидазу, промивали PBS протягом 5 хв × 3 рази, інкубували первинним антитілом і інкубували за 4 градусами. The next day, rinsed with PBS buffer for 5 min×3 times, then added reaction enhancement solution, washed again with PBS for 5 min×3 times, incubated with secondary antibody at 37 degree for 20 min, rinsed with PBS for 5 min×3 times, then DAB staining solution was used for color development, hematoxylin counterstained the nucleus, dehydrated with ascending gradient ethanol, and transparentized with ксилол.

 

1.2.6 Вестерн -блот

Частину миші гіпокампальної тканини додавали до буфера лізису білка RIPA, повністю заземленим шліфувальним стрижнем, гомогенізували ультразвуком у крижаній ванті і залишали на льоду протягом 30 хв. Потім використовуйте низькотемпературну ультрацентрифугу до центрифуги при 12, 000 r/хв протягом 15 хв, прийміть супернатант і використовуйте метод BCA для визначення його концентрації білка. Візьміть 20 мкг білка і додайте його до буфера для завантаження білка, дентумуйте його на 100 градусів протягом 5 хв, встановіть попередньо конфігурований концентрований гель та гель поділу в електрофорезному резервуарі та виконайте 80 В електрофорезу постійної напруги протягом 60 хв після завантаження, а потім відрегулюйте на електрофорезу постійної напруги 120 В протягом 80 хв. Потім використовуйте постійний струм 300 мА і передавайте мембрану протягом 130 хв. Блокуйте з знежиреним молоком при кімнатній температурі протягом 2 год, розведіть первинне антитіло в 1: 1 500 разів, інкубуйте його в холодильнику при 4 градусах протягом ночі, промивайте мембрану та інкубуйте вторинне антитіло при кімнатній температурі протягом 2 год. Після розробки за допомогою системи аналізу візуалізації проаналізуйте сіру цінність кожної групи смуг.

 

1.2.7 Статистичний аналіз

Усі дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення (x  s), а SPSS 25. 0 та програмне забезпечення GraphPad Prism9.5 використовувались для аналізу та графіки даних. Для порівняння SNK-Q використовували тест, а одностороння Anona була використана для порівняння декількох зразків. С<0.05 indicated statistically significant differences.