Внутрішньом’язове підсилення HIFN-Alpha 2b посилює індукований BCGphipps захист у мишачої моделі прокази

Анотація:

Імунітет господаря до Mycobacterium leprae охоплює спектр механізмів, які варіюються від захисту, зумовленого клітинним імунітетом, до пошкодження, пов’язаного з гуморальним імунітетом, як у реакціях прокази типу -2. Хоча інтерферони типу I (ІФН) беруть участь у елімінації внутрішньоклітинних патогенів, їхній внесок у вироблення антитіл і CD3 плюс FOXP3 плюс регуляторних Т-клітин (Tregs) у опосередкованому вакциною БЦЖ захисті від прокази невідомий. Приймінг BCGphipps (BCGph) з наступним внутрішньом’язовим підсиленням hIFN- 2b значно зменшив розмір уражень і ріст Mycobacterium lepraemurium у шкірі. Т-фолікулярні регуляторні клітини (TFR), підгрупа Tregs, індукованих імунізацією або інфекцією, знаходяться в зародкових центрах (GC) і модулюють вироблення антитіл.

Ми виявили порушення індукції Treg і покращення GC у дренуючих лімфатичних вузлах мишей, які отримали прайм BCGph і hIFN- 2b. Крім того, ці миші викликали значну кількість IL-4 та IL-10 у сироватці. Таким чином, наші результати підтверджують ад’ювантні властивості hIFN- 2b у контексті праймування BCGph для посилення захисного імунітету проти шкірної прокази.

Захисний імунітет означає здатність організму захищатися від збудників інфекцій шляхом вироблення антитіл, Т-клітин тощо, і є одним із важливих механізмів протистояння організму хворобам. Імунітет відноситься до здатності організму розпізнавати різні сторонні речовини (включаючи патогени, сторонні тіла, пухлинні клітини тощо) і реагувати на них, включаючи клітинний імунітет і гуморальний імунітет. Захисний імунітет є частиною імунітету, і вони тісно пов’язані між собою. Хороший імунітет може сприяти покращенню захисного імунітету, щоб краще запобігати виникненню захворювань. У той же час підвищення захисного імунітету також може підвищити імунітет, дозволяючи організму краще справлятися з різними зовнішніми викликами. Тому підтримка здорової імунної системи, включно з хорошим захисним імунітетом, дуже важлива для збереження здоров’я. З цієї точки зору дуже важливий і імунітет. Якщо ми хочемо підвищити свій імунітет, цистанхе може значно підвищити імунітет людини. Полісахариди в Cistanche можуть регулювати імунну відповідь імунної системи людини та покращувати імунні клітини. Стрес-здатність, підсилює бактерицидну дію імунних клітин.

Клацніть на переваги цистанчі для здоров’я

Ключові слова:

Mycobacterium lepraemurium; мишача проказа; інтерферон альфа; BCGphipps; зародкові центри; регуляторні Т-клітини.

1. Введення

Mycobacterium leprae і Mycobacterium lepromatosis, етіологічні агенти лепри людини [1,2], уражають шкіру та периферичні нерви [3]. Незважаючи на наявність комплексного лікування прокази (MDT), кількість нових випадків залишається стабільною (700 000 на рік).

Крім того, відсутність ефективної діагностичної процедури ускладнює відстеження передачі M. leprae [4–7]. Генетична схильність до ранньої прокази [8] підкреслює необхідність своєчасної діагностики та розробки недорогих імунотерапій для зниження захворюваності на проказу в розвинених країнах [9,10]. Спектр клінічних проявів лепри корелює з типом викликаної імунної відповіді. Наприклад, туберкулоїдна лепра (ТТ), що характеризується домінуючою відповіддю Th1, обмежує ріст бацил через IFN-керовану активацію мікробіцидних функцій макрофагів. Навпаки, виробництво класичних цитокінів Th2 (IL-4 та IL-10) було пов’язане з втратою захисту та посиленим ростом бактерій при дисемінованій лепроматозній проказі (LL) [10]. Існують також проміжні підтипи, які представляють суміш відповідей Th1 і Th2 [10].

Зараження мишей M. lepraemurium (MLM) [11,12] використовувалося для вивчення імунологічних механізмів прокази людини [11–13], хоча MLM не виявляє тропізму до периферичних нервів [11,13], як M. leprae робить [14]. Тим не менш, обидві мікобактерії не культивуються і повільно ростуть у хазяїні, подвоюючи свою кількість за 1–3 тижні.

Експериментальна підшкірна інфекція невеликими дозами бактерій точно імітує природне захворювання, яке зазвичай виникає, коли порушення бар’єрів сприяє колонізації мікобактерій, запускаючи імунну реакцію на периферичному рівні [13,15–17]. У той час як клітинно-опосередкований імунітет (CMI) порушується, гуморальний імунітет практично не змінюється при проказі людини та миші [18]. Крім того, клітини Th1- або Th2-, інші Т-лімфоцити, формують імунітет господаря до інфекції M. leprae [18,19].

Цікаво, як M. leprae впливає на імунітет господаря при різних підтипах мікобактеріального захворювання. Одна з гіпотез полягає в тому, що збудник знижує регуляцію гуморального та клітинного імунітету господаря, щоб інфікувати шкіру та периферичні нерви [3,14,15]. Є також докази того, що паличка порушує активацію макрофагів. Він також знижує експресію TNF-альфа та молекул, таких як простагландини, які індукують продукцію IL-1 та реактивних проміжних продуктів кисню та азоту (ROI та RNI), критичних для мікобактерицидних функцій макрофагів [20–22].

У протективному імунітеті проти збудників беруть участь гуморальні відповіді, що генеруються в ГК вторинних і третинних лімфоїдних тканин [23–26]. Нещодавній звіт про проказу підкреслив критичну роль Tregs у інгібуванні відповідей клітин Th1 і Th17 [19]. Дійсно, баланс між цими підмножинами Т-клітин у ГК [27–29] визначає захисні або патологічні наслідки інфекційних та аутоімунних захворювань [30,31] і має вирішальне значення для розробки терапії для індукції захисного імунітету [26,27]. ].

Зокрема, Т-хелперні фолікулярні клітини (TFH) і особливо Т-фолікулярні регуляторні клітини (TFR) модулюють відповідь GC, щоб індукувати довготривалі гуморальні імунні відповіді, одночасно запобігаючи виробленню аутоантитіл [32,33]. Враховуючи, що ІФН типу I пов’язаний із утворенням як TFH, так і Tregs, він стає перспективним ад’ювантом для стимуляції відповідей TFH у GCs у контексті вакцинації БЦЖ [34].

Введення на слизову оболонку ІФН типу I індукує дозрівання дендритних клітин і генерацію CXCR5 плюс CD4 плюс TFH, полегшуючи розвиток GC і виробництво високоафінних антитіл у лімфатичних вузлах [34]. На відміну від цього, ІФН типу I скасовують імунітет хазяїна при туберкульозі людини шляхом пригнічення виробництва індуцибельної синтази оксиду азоту (iNOS), IL-12p40, IL-1A та IL-1, одночасно індукуючи Антагоністи IL-10 та IL-1R [35–38]. Таким чином, участь ІФН типу I є контекстно-залежною [38–42]. ІФН типу I виробляються на стабільному рівні, але як тільки внутрішньоклітинний патоген вторгається в хазяїна, індукуються кілька гетерогенних і складних противірусних або антибактеріальних вроджених реакцій [43–48], включаючи перемикання класів антитіл, соматичну гіпермутацію та посилення. наявності антигену в ГК, що призведе до сильних і ефективних відповідей антитіл [34,49].

Раніше ми повідомляли про захист, який забезпечується послідовним внутрішньом’язовим підсиленням IFN у мишей, вакцинованих Mycobacterium bovis BCG і заражених MLM [42] або проти аерозольного зараження M. tuberculosis [41]. У мишей, яких заражали MLM, захист корелював із посиленням виробництва iNOS, оксиду азоту та антитіл IgG3 [42]. У контексті зараження M. tuberculosis захищені миші викликали відповідь Th1 [41].

У нещодавньому дослідженні ІФН типу I модулювали аутофагію та метаболізм у хворих на проказу [50]. У цьому дослідженні ми вирішили додатково вивчити захист від мишачої прокази, спричиненої вакцинацією M. bovis BCGphipps (BCGph) і фармацевтичною формою людського IFN- 2b [51]. У останніх дослідженнях рекомбінантний БЦЖ, який експресує людський IFN- 2b, використовувався для успішного лікування раку сечового міхура [51–55]. Згідно з цими даними, нашою метою в цьому дослідженні було проаналізувати захист, спричинений праймуванням BCGph та посиленням hIFN- 2b у мишачій моделі прокази. Загалом наші результати передбачають потенціал підшкірного праймінгу BCGph та внутрішньом’язового підсилення hIFN- 2b для індукції захисного імунітету проти людської прокази.

2. Матеріал і методи

2.1. Тварини

Мишей Balb/c, вільних від специфічних патогенів, розводили та містили в тваринницьких приміщеннях Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Національного політехнічного інституту в Мехіко.

Усі експерименти на тваринах проводилися після схвалення (07 березня 2014 р.) Комітетом з догляду та управління тваринами (CIE-ENCB ZOO 016/2014).

2.2. мікроорганізми

Штам BCG Phipps (ATCC® 35744™) (BCGph) є варіантом штаму BCG, який втратив ділянку RD1, яка кодує ESAT-6 і CFP10, з найменшою кількістю Т-клітинних епітопів , 316, проти BCG Tokyo, 359, і BCG Pasteur, 331, (Zhang et al., 2013) [51] і надано доктором Ернандесом-Пандо (INCMNSZ, Мехіко, Мексика). Потім суспензії вакцини зберігали при –80 ◦C до використання. Некультивований штам Mycobacterium lepraemurium (MLM) був виділений із селезінки мишей, які несли чотиримісячну інфекцію, за допомогою процедури, описаної Prabhakaran et al., 1976 [56], з подальшим очищенням за допомогою процедури особистої ізоляції, описаної Draper P. , 1980 [57]. Коротко, 4 г тканини селезінки суспендували в 20 мл 0,2 М сахарози і подрібнили в скляному гомогенізаторі типу Поттера-Ельвех'єма. Отриману суспензію центрифугували протягом 20 хвилин при 150 × g для видалення залишків клітин (Sorvall RV5B, ротор HB4) (Sorvall Instruments, Wilmington, DE, USA). Потім 9 мл супернатанту наносили на 12 мл 0,3 М сахарози, і пробірки центрифугували при 3500 × g протягом 10 хвилин при 4–10 ◦C (Sorvall RC5B). Отриманий бацилоподібний осад ресуспендували в 20 мл 0,2 М сахарози, а 9 мл аликвоти наносили на 12 мл 1,5 М KCl.

Потім пробірку центрифугували при 4 ◦C протягом 10 хв при 3500× g. Бацили збирали, тричі промивали фосфатним буферним розчином (PBS) (0,01 М Na/K фосфат, 0,15 М NaCl, рН 7,4) і ресуспендували в 40 мл розчину, що містить суміш Percoll (3 частини) і 0,1 відсотка Tween 80 (7 частин). Суспензію центрифугували при 23,000×g. Осад бацил збирали і п'ять разів промивали PBS до видалення Percoll. Чистота бацилярного препарату була підтверджена фарбуванням за Цілем-Нільсеном. Очищену бацилярну суспензію готували в синтетичному середовищі 7H9 Middlebrook brothOADC (DIFCO, Детройт, штат Мічиган, США) (середовище 7H9-OADC) і кількісно визначали за допомогою нефелометричної контрольної кривої, отриманої з відомою кількістю бактерій. Бацилярну суспензію ділили на аліквоти та заморожували при -20 ◦C до готовності до використання.

2.3. Імунізації

Групи восьмитижневих мишей Balb/c (n=6) були підшкірно імунізовані 8 × 103 колонієутворюючих одиниць (КУО) BCGphipps у 200 мкл стерильного PBS. Через місяць кожну групу мишей внутрішньом’язово стимулювали протягом трьох послідовних днів (30, 31 і 32 дні після вакцинації) 100 мкл PBS або 100, 200 або 300 міжнародних одиниць (МО) hIFN{{14} }b (Urifron, Probiomed, Azcapotzalco, Мехіко, Мексика).

2.4. M. lepraemurium Виклик

Для експериментів із зараженням мишам внутрішньошкірно інокулюють 2 × 106 життєздатних MLM у 20 мкл PBS. Потім мишей містили в стандартних умовах і забезпечували очищеною водою та чіпсами для гризунів Purina (Cuautitlan Izcalli, Мексика) ad libitum. За інфікованими мишами спостерігали протягом восьми тижнів, моментів часу, коли ураження були очевидними на шкірі інфікованих тварин. Прогресування захворювання було різним у мишей і корелювало з експериментальними методами лікування (PBS, BCGph або hIFN- 2b).

2.5. Імуноферментні аналізи (ELISA)

Антитіла в сироватках MLM-інфікованих мишей вимірювали за допомогою непрямого імуноферментного аналізу (ELISA). Коротко, 96-лункові планшети (Nunc, Рочестер, Нью-Йорк, США) покривали протягом ночі при 4 ◦C 10 мкг пептидогліколіпідів, розчинених в етанолі [38]. Після випаровування етанолу при кімнатній температурі [37] неспецифічне зв'язування було заблоковано 3% знежиреним молоком у PBS протягом 2-3 годин. Після видалення блокуючого розчину 0.1 мл сироватки, розведеної (1:100) в 1% знежиреного молока в PBS, додавали в лунки та інкубували протягом ночі при 4 ◦C.

Потім планшети ретельно промивали PBS і зв’язані антитіла виявляли за допомогою {{0}}.1 мл антимишачого IgG (1:4000, BD 550487, BD Pharmingen, San Дієго, Каліфорнія, США), IgG1-HRP (1:2500, ab 97240, Abcam, Cambridge, MA, USA), IgG2a-HRP (1:2500, ab97245, Abcam), IgG2b-HRP (1: 2500, ab97250, Abcam), або IgG3-HRP (1:2500, ab97260, Abcam), або кон’юговане з біотином щуряче антимишаче IgA моноклональне антитіло (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen), а потім антитіло щура проти мишачого Ig, кон’юговане пероксидазою хрону (HRP) (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen) або авідин-HRP (ab 59653, abcam) Хромогенний субстрат, тетраметилбензидин у 0,05 М цитратно-фосфатному буфері (pH 5.2), з додаванням 0,01% перекису водню (H2O2), додавали в лунки для прояву кольору. Реакцію зупиняли 1 М H3PO4. Оптичну густину вимірювали при 450 нм у рідері ELISA для мікропланшетів (LabSystems Multiskan Plus, LabX, Мідленд, Онтаріо, Канада). IFN-, IL-4, IL-17, IL-6, TNF- та IL-10 вимірювали в сироватці за допомогою спеціальних наборів для сендвіч-ELISA (PEPROTEC Inc., Cranbury) , Нью-Джерсі, США). відповідно до інструкцій виробника.

2.6. Вимірювання NO в сироватці мишей

Коротко, сироватки обробляли етанолом (1:1) для осадження білків та інших заважаючих факторів. Після центрифугування при 3000 об/хв протягом 20 хв, 20 мкл виділеної сироватки поміщали в лунки планшета для ELISA разом зі 100 мкл реактиву Грисса та 80 мкл дистильованої води. Реактив Ґрісса являє собою об’ємно-об’ємну суміш розчину А (2 відсотки сульфаніламіду в 5 відсотках фосфорної кислоти) і розчину В (0,1 відсотка N-(1-нафтил)етилендіаміну, дигідрохлорид. Після 30 хвилин інкубації при 25 ◦ C, розвинуте рожеве забарвлення було зареєстровано в рідері ELISA при 595 нм Значення екстраполювали на стандартну криву нітриту натрію в діапазоні 1–100 мкМ.

2.7. Імунофлюоресценція

Первинні антитіла були отримані від таких компаній: козячі анти-iNOS (клон M-19, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), кролячі анти-нітротирозин (AB 5411, EMD, Millipore, Burlington, MA, USA ), біотиновий щур Ly6C/Ly6G (клон RB6-8C5, BD Pharmingen), козячий анти-CD3 епсилон (клон M-20, Santa Cruz Biotechnology), щурячий антимишачий FoxP3 (клон FJK{{12} }s, eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), ядерний антиген антипроліферуючих клітин кози (клон C-20, Santa Cruz Biotechnology), FITC-аглютинін арахісу (L7381- 1MG, SIGMA, St Луїс, Міссурі, США), і APC-щурячий антимишачий CD45R (клон RA3-6B2, BD Pharmingen).

Первинні антитіла були виявлені за допомогою таких вторинних антитіл: Alexa Fluor 568 ослячий IgG проти кози (A11057, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США), Alexa Fluor 488 ослячий IgG проти кролика (711-546, Jackson ImmunoResearch Laboratories) , Вест-Гроув, Пенсильванія, США) і Alexa Fluor 680 стрептавідин (S32358, Thermo Fisher Scientific).

Парафіновані зрізи розміром 5 мкм, фіксовані формаліном, інкубували при 60 ◦C протягом ночі для депарафінізації. Зрізи тканин швидко переносили в ксилоли (247642-2.5L, SIGMA) і гідратували шляхом послідовного занурення предметних стекол в абсолютний спирт, 96% спирт, 70% спирт і воду. Скела занурювали в розчин для вилучення антигену, кип’ятили протягом 30 хв і охолоджували протягом 10 хв при кімнатній температурі (КТ). Скела кілька разів промивали у воді та переносили в PBS. Неспецифічне зв’язування було заблоковано 5% звичайної ослячої сироватки в PBS, що містить 0,1% Tween 20 і 0,1% Triton-X-100, протягом 30 хвилин при кімнатній температурі у вологій камері. Первинні антитіла додавали до предметних стекол та інкубували протягом ночі у вологій камері при кімнатній температурі. Предметні скла обережно промивали PBS, а вторинні антитіла, мічені флуоресцентною міткою, інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі або протягом ночі у вологій камері.

Нарешті, слайди промивали протягом 1 години в PBS і монтували за допомогою Vectashield antifade монтажного середовища з DAPI (H-1200, Vector Laboratories, Берлінгейм, Каліфорнія, США). Знімки зроблені за допомогою мікроскопа Zeiss Axioplan. Усі зародкові центри (ГЦ) у розрізі лімфатичних вузлів вимірювали за допомогою автоматичного інструменту мікроскопа Carl Zeiss, а середній розмір ГЦ розраховували за допомогою програмного забезпечення Prism. CD3 плюс FoxP3 плюс Tregs підраховували в 5 випадкових полях 200 × на тканину, щоб обчислити середню кількість позитивних клітин на поле.

2.8. Статистичний аналіз

Статистично значущі відмінності між групами обчислювали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу, множинних порівнянь Ньюмана–Кейлса, непарного/парного двостороннього t-критерію Стьюдента, а значення P < 0.05 вважали статистично значущими. Статистичні відмінності були розраховані за допомогою Graph Pad Prism.

3. Результати

3.1. BCGphipps (BCGph)-праймінг з подальшим послідовним внутрішньом’язовим підсиленням hIFN- 2b захищає мишей Balb/c від внутрішньошкірного зараження M. lepraemurium.

Раніше ми розробили протокол первинної стимуляції, заснований на послідовному внутрішньом’язовому стимулюванні IFN після вакцинації БЦЖ мишей [42] з багатообіцяючими результатами захисту. Недавні дослідження використовували рекомбінант БЦЖ, який експресує людський IFN- 2b, для лікування раку сечового міхура [51,53]. Таким чином, у цьому дослідженні наша мета полягала в тому, щоб проаналізувати захист, викликаний праймінгом BCGph з подальшим посиленням hIFN- 2b у мишачій моделі прокази, дотримуючись схеми, зображеної на малюнку 1.

Малюнок 1. Протокол первинного посилення для оцінки захисту мишей від внутрішньошкірного зараження M. lepraemurium. Групи мишей Balb/c (n=6) були підшкірно вакциновані низькою дозою BCGph (8 × 103 КУО). Мишам з кожної групи вводили внутрішньом’язову стимуляцію протягом послідовних днів (30, 31 і 32 дні після вакцинації) PBS або hIFN- 2b. Мишей заражали 2 × 106 життєздатних MLM через вісім тижнів після останнього стимулювання. Після цього мишей умертвляли, а біозразки збирали через вісім тижнів після зараження. Розвиток уражень шкіри спостерігали та вимірювали, як описано в матеріалах і методах.

Коротко, мишам внутрішньошкірно вводили MLM через вісім тижнів після третьої стимуляції 300 МО hIFN- 2b. Прогресування захворювання спостерігали протягом наступних восьми тижнів. Наприкінці цього періоду ми зібрали пахові лімфатичні вузли для виявлення GC і підрахували Tregs та інші популяції клітин за допомогою імунофлюоресценції. Ми також використовували імунофлуоресценцію для візуалізації продукції iNOS активованими макрофагами, розташування залишків нітротирозину (NT) і накопичення Gr-1 плюс мієлоїдних клітин у шкірі наших експериментальних мишей. Крім того, ми зібрали сироватку для вимірювання цитокінів і антитіл до гліколіпідів MLM за допомогою ELISA (рис. 1).

По-перше, щоб оцінити захисний ефект праймування BCGph та посилення hIFN{{0}}b проти внутрішньошкірного зараження мишей з MLM, ми виміряли ураження шкіри та візуалізували колонізацію шкіри бацилами за допомогою фарбування за Цилем–Нільсеном (Малюнок 2A–E). Шкіра необроблених мишей, які отримували лише носій (PBS), без зараження MLM, не виявила бацил (Фіг. 2A). Миші, інокульовані носієм і заражені MLM, показали велику кількість бацил MLM у шкірі (рис. 2B), тоді як праймування мишей BCGph призвело до зниження росту мікобактерій (рис. 2C). Послідовне введення hIFN- 2b також зменшувало ріст мікобактерій у шкірі порівняно з мишами, яким заражали MLM (рис. 2D). Миші, яким вводили BCGph і стимулювали hIFN- 2b, мали найнижчий ріст мікобактерій (рис. 2E). Згідно з цими даними, у здорових мишей, яким вводили MLM, які отримували лише носій (PBS), розвинулися найбільші ураження шкіри (35 ± 9,9 мм2), тоді як у мишей, яким вводили BCGph, були ураження шкіри такого ж розміру, як ті, що розвинулися в мишей, інокулованих носієм і заражених MLM (13,5 ± 4,24 мм2) (Фіг. 2F). Миші, яким підшкірно вводили hIFN- 2b, показали менші пошкодження шкіри (20 ± 1,77 мкм2). Варто відзначити, що миші, які отримували прайм BCGph і стимулювали hIFN- 2b, продемонстрували значне зменшення розміру ураження шкіри (5 ± 7,07 мм2) (p < 0,05) (Малюнок 2F).

\

Рисунок 2. Ураження шкіри та ріст мікобактерій у Balb/c, інфікованих M. lepraemurium. Захист мишей оцінювали за розвитком ураження шкіри та візуалізацією росту мікобактерій у шкірному ураженні через вісім тижнів після зараження MLM. Ураження шкіри фарбували за Цилем-Нільсеном. Типові зображення зі збільшенням 400× (A) непраймованих мишей і незаражених мишей; (B) мишей, інокульованих PBS і заражених MLM; (C) мишей, яких було введено BCGph і заражено MLM; (D) мишей, яким внутрішньом'язово щеплено hIFN- 2b і заражено MLM; (E) миші, яким вводили BCGph, стимулювали hIFN- 2b і заражали MLM; (F) Ефективний захист еквівалентний або відсутності уражень шкіри, або значному зменшенню розміру уражень шкіри, вираженого в мм2, n=6 мишей/групу. * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 вважалося статистично значущим.

3.2. Мінімальна шкірна патологія у мишей, яких обробили BCGphipps і посилили hIFNa 2b, корелює зі зниженим накопиченням нітротирозину та порушенням інфільтрації нейтрофілів

Оксид азоту є критично важливим для знищення внутрішньоклітинних патогенів. Однак надмірне утворення оксиду азоту, супероксидного радикалу (O,- та перекису водню призводить до утворення токсичного та нестабільного пероксинітриту, молекули, яка реагує із залишками тирозину на білках з утворенням стабільної NT 56-601. Хоча пероксинітрит вбиває мікобактерії, він також пошкоджує імунні клітини [57-59].

Таким чином, ми вирішили шукати клітини, що продукують iNOS, і нейтрофіли в шкірі наших піддослідних мишей за допомогою імунофлюоресценції. Ми бачили фонові сигнали для iNOS і NT і дуже мало клітин Gr-1 plus у шкірі мишей, які отримували лише PBS (рис. 3A). Підвищене мікобактеріальне навантаження та збільшені некротичні ураження шкіри корелювали з накопиченням залишків NT у некротичній ділянці шкіри (58, 59 невакцинованих (рис. 3B) і мишей, оброблених BCGph, яким інфікували MLM (рис. 3C), що відповідає більш збалансованій місцевій запальній відповіді та полегшення шкірної патології, NT та інфільтрація нейтрофілів зменшилися у мишей, які отримували послідовну інокуляцію hIFN- 2b (рис. 3D) або мишей, яким BCGph примували та стимулювали hIFN 2b (рис. 3E). }} плюс нейтрофіли та зменшені ділянки NT збігалися з найменшою ділянкою запалення в гістологічних зрізах шкіри мишей, оброблених BCGph та посилених hIFN- 2b (рис. 3F).

Малюнок 3. Захист пов’язаний зі зниженням накопичення нітротирозину, порушенням накопичення нейтрофілів і полегшенням запалення шкіри. Зрізи ураження шкіри пофарбували комбінацією антитіл, специфічних для iNO (червоний), NT (зелений) і Gr-1 (білий). Репрезентативні зображення 200× від (A) шкіри непраймованих і незаражених мишей, (B) мишей, інокульованих PBS і заражених MLM, (C) мишей, заражених BCGphipps і заражених MLM, ( D) мишей, яким внутрішньом'язово щеплено hIFN- 2b і заражено MLM, і (E) мишей, яким примували BCGph, стимулювали hIFN- 2b і заражали MLM; (F, G) кількісне визначення запальної зони за допомогою автоматизованих інструментів мікроскопа Zeiss Axioplan, пошкодження шкіри збирали через вісім тижнів після зараження MLM, графіки показують середню площу, зайняту запальними клітинами в ураженнях шкіри прокази, виражену в мкм2. Масштаб=100 мкм. n=6 мишей/група * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 вважався статистично значущим.

Вироблення NO не було статистично значущим порівняно з іншими експериментальними групами, однак у групі мишей, які отримували BCGph і були підсилені hIFN- 2b, концентрація NO була вищою (68,28 мкМ/л ± 0 0,889), ніж у групах PBS і MLM (62,79 мкМ/л ± 1.04), BCGph (63,37 мкМ/л ± 0,225), hIFN- 2b (62,57 мкМ/л ± 1,028) ) (Малюнок 3G).

3.3. Протизапальні цитокіни збільшуються в сироватці крові мишей, які отримували BCGphipps і посилені hIFN- 2b

Про- та протизапальні цитокіни вимірювали в сироватці мишей Balb/c після зараження MLM. Відповідно до імуносупресивного стану, викликаного MLM, концентрації прозапальних цитокінів були низькими в сироватці мишей Balb/c, інокульованих PBS і заражених MLM (IFN-, 625 ± 442 пг/мл; TNF-, 697 ± 436 пг/мл). мл; IL-6, 68 ± 48 пг/мл; IL-17, 95 ± 67 пг/мл). Навпаки, у них був помірний рівень протизапальних цитокінів у сироватці крові (IL-10, 1763 ± 124 пг/мл та IL-4, 1250 ± 173 пг/мл). Незважаючи на те, що миші були захищені праймуванням BCGph і послідовним бустеруванням hIFN- 2b, системна кількість прозапальних цитокінів статистично не відрізнялася від такої у мишей, інокульованих PBS і заражених MLM. Несподівано концентрація IL-4 (1875 ± 352 пг/мл, p < 0,05) та IL-10 (4250 ± 271 пг/мл) була значно збільшена в сироватці цих мишей порівняно з з мишами, інокульованими PBS і зараженими MLM (Таблиця 1). Ці результати свідчать про те, що наш протокол вакцинації може активувати протизапальні шляхи, щоб запобігти пошкодженню тканин.

3.4. Порушення накопичення Treg у дренуючих лімфатичних вузлах (DLN) мишей, які отримували прайм BCGphipps або посилені hIFN- 2b

Враховуючи, що Tregs продукують IL-10 [61,62], ми вирішили кількісно визначити CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs у дренуючих лімфатичних вузлах (DLN), розташованих поблизу місця вакцинації. У неінфікованих мишей (PBS) Tregs все ще були присутні (113 ± 9,8 CD3 плюс FOXP3 плюс Treg/200 × поле) (Малюнок 4A). Як і очікувалося, Tregs були значно збільшені у мишей, яким вводили MLM, які не отримали вакцину (BCGph) або hIFN- 2b (214 ± 30 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Малюнок 4B). Конгруентно нижчі рівні Tregs спостерігалися у мишей, які отримували праймування BCGph (160 ± 26 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (рис. 4C) і мишей, які отримували hIFN- 2b (162 ± 33 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Рис. 4D); миші, які отримували прайм BCGph і стимулювали hIFN- 2b (127 ± 16 CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs/200 × поле) (Малюнок 4E), мали подібну щільність Tregs, ніж невакциновані миші без hIFN- 2b посилення. Однак після сліпого підрахунку CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs у DLN наших піддослідних мишей ми виявили, що Tregs були значно знижені в DLN мишей після праймування BCGph (p=0.0013), hIFN- 2 b інокуляція (p=0.0074) або комбіноване праймування BCGph і посилення hIFN- 2b (p=0.0013) у порівнянні з мишами, яким заражали MLM (рис. 4E).

Малюнок 4. Порушення накопичення регуляторних Т-клітин (Tregs) у дренуючих лімфатичних вузлах (DLN) мишей, які отримували прайм BCGphipps та стимулювали hIFN- 2b. Мишей умертвляли, а DLN збирали через вісім тижнів після зараження MLM. DLN фарбували антитілами, специфічними для CD3 (червоне) і FOXP3 (зелене ядро), щоб виявити CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs за допомогою імунофлуоресценції. (A) Базальне накопичення Tregs в DLN невакцинованих мишей; (B) Треги в DLN були збільшені після зараження MLM і порівняно знижені в (C) BCGph-праймованих, (D) hIFN- 2b інокульованих, (E) BCGph-праймованих-hIFN- 2b бустовані миші; (F) морфометричний аналіз показує значне зниження Tregs у DLN мишей, які були праймовані BCGph/hIFN- 2b. Масштаб=100 мкм, n=6 мишей/група * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p < 0,0005 вважалося статистично значущим.

3.5. Праймінг BCGphipps і посилення hIFN- 2b впливають на відповіді GCs у DLN миші

Існують спеціальні Tregs, розташовані в GC, відомі як Т-фолікулярні регуляторні клітини (TFR. Вони модулюють відповіді GCs і запобігають утворенню аутореактивних плазматичних клітин (28, 33). Зменшення Tregs у DLN свідчить про те, що відповіді GCs можуть вивільнятися у мишей. праймовані BCGph і посилені hlFN-a 2b. Відповідно до відсутності антигенної стимуляції ми не виявили GC в DLN неінфікованих мишей (рис. 5A). Невеликі GC були присутні в DLN непраймованих мишей, заражених MLMLigure 5B).

Малюнок 5. Праймінг BCGphipps і посилення hFN-a 2b впливають на відповіді GC у DLN після виклику MLM. Мишей умертвляли через вісім тижнів після зараження ML M. Дренажні лімфатичні вузли (DLN) фарбували ядерним антигеном проліферуючих клітин антитіл (PCNA, червоні ядра), аглютиніном арахісу (PNA, зелений) і CD45R (B22{{13). }}, білий) для ідентифікації GC, що містять компактні кластери PCNA*PNA плюс * B220B-клітини з низьким вмістом GC. GC B-клітини в DL Ns (A) непраймованих і незаражених мишей; (B) мишей, інокульованих PBS і заражених MLM; (C) мишей, оброблених BCGph і заражених MLM; (D) мишей, яким внутрішньом'язово стимулювали hlFN-a 2b і заражали MLM; (E) миші, яким вводили BCGph, підсилений hlFN-a 2b, і заражали ML M; (F) GC вимірювали в окремих DL N експериментальних мишей обчислюють середній розмір GC. Масштаб=100 um.=6 мишей на групу. " p < 0.05, * p < 0,005; *** y < 0,0005 вважалося статистично значущим.

Малюнок 5. Праймінг BCGphipps і посилення hlFN-a 2b впливають на відповіді GC у DLN після зараження ML M. Мишей умертвляли через вісім тижнів після зараження ML M. Дренажні лімфатичні вузли (DLN) фарбували антитілами, специфічними до ядерного антигену проліферуючих клітин (PCNA, червоні ядра), аглютиніну арахісу (PNA, зелений) і CD45R (B22{{ 13}}, білий) для ідентифікації GC, що містять компактні кластери PCNAPNA plus плюс B220low GC B-клітин. GC B-клітини в DL Ns (A) непраймованих і незаражених мишей; (B) мишей, інокульованих PBS і заражених MLM; (C) мишей, яких було введено BCGph і заражено MLM; (D) миші, яким внутрішньом'язово стимулювали hlFN-a 2b і заражали MLM; (E) миші, яким вводили BCGph, стимулювали hlFN-a 2b і заражали MLM; (F) GC вимірювали в окремих DLN експериментальних мишей для розрахунку середнього розміру GC. Масштаб=100 um. 1=6 мишей на групу. " y < 0.05. * y < 0,005, *** y < 0,0005 вважалося статистично значущим.

Цікаво, що миші, яким вводили BCGph, мали значно більші GC, ніж миші, яким вводили MLM (рис. 5C). Миші, імунізовані hlFN-a 2b (Фігура 5D), мали GCs порівнянного розміру з тими у мишей, яким заражали MLM. Миші, яким вводили BCGph і стимулювали hlFN-a 2b, мали GC проміжного розміру (Фігура 5E). Щоб отримати більш кількісну оцінку відповідей GC в DLN, ми розрахували середній розмір GC в окремих розділах DLN. Згідно з нашими спостереженнями, ми виявили значне зменшення середнього розміру GC у DLN після ін’єкції hlFN-a 2b і в протоколі праймінгу BCGph/hIFN-a 2b (Малюнок 5E).

3.6. Порівнянні рівні гліколіпід-специфічних антитіл у мишей, заражених M. lepraemurium, після праймування BCGphipps та підсилення hIFN{3}}b

Згідно з відмінностями, що спостерігаються у формуванні та організації GC, ми вимірювали концентрацію антитіл, специфічних до гліколіпідів, екстрагованих з MLM. Загалом наші результати показують, що системні кількості різних класів та ізотипів гліколіпід-специфічних антитіл не змінювалися вакцинацією, послідовним введенням hIFN- 2b або протоколом праймування BCGph/hIFN- 2b ( Таблиця 2). Миші, які отримували стимуляцію лише hIFN- 2b, викликали більшу кількість антитіл IgG та IgG1 у сироватці. Однак рівні антитіл IgG та Ig G1 не були статистично значущими порівняно з іншими експериментальними групами (табл. 2).

4. Обговорення

У цьому дослідженні ми показали, що наш протокол первинної стимуляції, заснований на підшкірному праймінгу BCGphipps і послідовному внутрішньом’язовому бустингу зі збільшенням кількості hIFN- 2b, захищав мишей від внутрішньошкірного зараження MLM.

Протокол первинного підсилення запобігав росту MLM у шкірі та покращував місцеву патологію шляхом зменшення продукції NT та нейтрофільного запалення (рис. 3E). Це також призвело до індукції протизапальних цитокінів (IL-4 та IL-10), які, ймовірно, протидіяли надмірному запаленню шкіри та проявлялися системно. Несподівано, хоча терапевтичний режим зменшив CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs у DLN (рис. 4E), відповіді GC не були різко посилені (рис. 5E), а сироваткові концентрації гліколіпід-специфічних антитіл були подібними в усіх експериментальних групах, за винятком групи з мишей, яким щеплено лише hIFN- 2b (табл. 2). Тим не менш, наші експериментальні дані підтверджують потенційне використання праймінгу БЦЖ з ад’ювантом із внутрішньом’язовим підсиленням IFN 2b як багатообіцяючої імунотерапії, яка заслуговує на дослідження при проказі людини.

Клінічні прояви лепри корелюють з імунологічним спектром, виявленим у пацієнтів, і коливаються від LL до TT [2,4,14,18]. Загалом, імунітет хазяїна до M. leprae характеризується головним чином поляризованою відповіддю Т-хелпера (Th1/Th2). З одного боку спектру, хоча LL характеризується енергією, все ще існує деяка реактивність до мікобактеріальних антигенів і продукування IL-4 та IL-10. Навпаки, при ТТ переважна відповідь Th1 призводить до керованої IFN активації макрофагів, що прискорює елімінацію бацил. У мишей, інфікованих MLM, зазвичай розвивається лепроматозна проказа без явного домінування гуморального або клітинного імунітету [18–20].

Захисні антитіла, викликані інфекцією або вакцинацією [63], виробляються шляхом процесу, який називається дозріванням афінності, який відбувається в зародкових центрах, утворених у вторинних (селезінка, лімфатичні вузли) або третинних лімфоїдних органах (TLO), що утворюються в периферичних тканинах [23,25] . Саме в GC продукція В-клітин пам’яті та довгоживучих плазматичних клітин, що секретують антитіла, сприяє формуванню довготривалого імунітету до майбутніх зустрічей з патогенами. Ефективна індукція відповідей GC залежить від взаємодії багатьох типів клітин, включаючи В-клітини, Т-фолікулярні хелперні клітини (TFH), макрофаги з відтінками тільця та фолікулярні дендритні клітини (FDC) [64]. Дійсно, вакцини викликають успішну реакцію ГК і ектопічні зародкові центри в лімфатичних вузлах [24,25,31,49].

Крім того, Т-фолікулярні клітини-хелпери та Т-фолікулярні регуляторні клітини [27–30] підтримують тонкий баланс між індукцією ефективних відповідей антитіл і аутоімунітетом. Хоча ми не виключали індукцію аутоімунітету в нашому дослідженні, ми все ж зосередилися на ефектах протоколу первинного посилення з BCGph і hIFN- 2b на Tregs від DLN. Захищені миші мали значно менше CD3 плюс FOXP3 плюс Tregs у своїх DLN. Однак необхідні подальші дослідження, щоб визначити, чи є деякі з цих Treg Т-клітинами-хелперами фолікула, які регулюють реакції GC [27–30]. Ці результати можуть означати, що ефективна індукція захисного імунітету в поєднанні з невеликим зниженням Tregs в DLN необхідна для контролю росту мікобактерій і запобігання патологічного запалення шкіри.

Попередні дослідження повідомляли про системні та слизові ефекти ІФН типу I на Т-фолікулярні хелперні клітини та Т-фолікулярні регуляторні клітини [19,32,64]. Дійсно, ІФН типу I опосередковано збільшує TFH у лімфатичних вузлах шляхом стимуляції праймування Т-клітин дендритними клітинами [34]. ІФН типу I також сприяє зміні ізотипу в ШК. Крім того, нещодавнє дослідження показало, що ІФН типу І запускає CXCL13-утворення TLO в легенях [49].

Таким чином, індукція CXCL13 ІФН типу I може посилити залучення наївних В-клітин до вторинних лімфоїдних органів і збільшити виробництво плазматичних клітин, що секретують антитіла, глобально покращуючи довготривалу пам’ять та імунологічні реакції плазматичних клітин [23–25,64]. ], особливо в присутності ад’ювантів, таких як полі IC [65]. Крім того, введення ІФН типу I індукує утворення ГК у легенях пацієнтів, уражених аутоімунними захворюваннями [31] або туберкульозом [66,67]. Таким чином, блокада CXCL13 може допомогти в лікуванні цих хронічних запальних захворювань [49]. У цьому контексті ми спостерігали дуже помірне зменшення розміру GC у DLN захищених прайм-бустованих мишей (рис. 5E). Однак необхідні додаткові дослідження, щоб краще визначити кореляцію між утворенням GC і захистом, викликаним у цих прайм-бустованих мишей. В експериментальних налаштуваннях праймування з BCGph та внутрішньом’язової стимуляції hIFN{15}}b (51) миші в нашому дослідженні зазнали більшого захисту при введенні BCGph-hIFN- 2b (80 відсотків), ніж при введенні лише BCGph (60 відсотків), що визначається відсутністю або малим розміром уражень шкіри (рис. 2) і порівнянною кількістю антитіл IgG та IgG1, специфічних для гліколіпідів MLM (табл. 2). Наші результати контрастують із збільшенням кількості IgG у мишей, захищених вакцинацією іншим штамом BCG (Pasteur) [41]. Ці дані свідчать про те, що тип штаму БЦЖ, використаний для виготовлення вакцини, може впливати на результат гуморальної імунної відповіді проти MLM або M. leprae [51].

Крім того, кілька досліджень туберкульозу показали потенційні та корисні ефекти гетерологічної стратегії прайм-бустування в індукції захисних імунних реакцій [68–70]. Крім того, добре відомо, що тип і шлях імунізації впливають на величину антитіл і клітинної імунної відповіді. Дивно, що захищені миші показують значно вищі IL-4 та IL-10 у сироватці порівняно з мишами, які отримували лише PBS, BCGph або hIFN- 2b (таблиця 1). Як протизапальні цитокіни впливають на захисний імунітет при проказі, зараз досліджується в нашій лабораторії. Проте кілька досліджень показали, що ефективний клітинний імунітет до мікобактерій залежить від тонкого балансу між захистом і запобіганням патології [71]. Крім того, є докази індукції обох типів цитокінів в інших експериментальних моделях [72–75].

Наші сукупні результати свідчать про те, що успіх нашого протоколу первинного посилення залежить від індукції збалансованої імунної відповіді, яка ефективно усуває MLM у шкірі та обмежує пошкодження тканин шляхом індукції протизапальних цитокінів (IL-4 та IL10), які ймовірно, захищають імунні клітини [76,77]. Дійсно, IL-10, що виробляється індукованим Tregs, модулює запалення на поверхнях слизової оболонки, зокрема ті, які пов’язані із запальними захворюваннями кишечника [77,78]. Ці знахідки вимагають детального кінетичного дослідження активації В-клітин, утворення та регуляції GC, генерації Т-фолікулярних регуляторних клітин і активації NF-κB у нашій прайм-буст системі з BCGph та hIFN- 2b з подальшим інфікуванням MLM до мають більш механістичне розуміння ролі імунних клітин і шляхів NF-κB в індукції захисного імунітету в шкірі та лімфатичних вузлах після виклику MLM.

5. Висновки

З цих даних можна зробити висновок, що послідовне внутрішньом’язове підсилення hIFN- 2b посилює вакцинацію БЦЖ M. bovis, захищаючи від внутрішньошкірного зараження MLM і виявляючи багатообіцяючі ад’ювантні властивості людського IFN-a 2b у контексті БЦЖ вакцинація для профілактики інфекцій прокази в ендемічних районах. Наскільки нам відомо, це перший звіт про терапевтичну ефективність BCGphipps у поєднанні з фармацевтичною формою hIFN- 2b у доклінічній моделі проказоподібного захворювання.

Авторські внески:

Дизайн дослідження, GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M.; проведення дослідження, GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M.; аналіз даних: GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M.; інтерпретація даних, GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M.; складання рукопису, ГГГ, ОР-Е., СОІ-Т. та JR-M.; перегляд вмісту рукопису, GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M.; GGG, OR-E., SOI-T. і JR-M. нести відповідальність за цілісність аналізу даних. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування:

GGG і OR-E. були підтримані SNI, CONACYT (Мехіко, Мексика). GGG отримав підтримку від Perfil Prodep 2019–2022 та JR-M. було підтримано внутрішніми коштами Департаменту медицини Університету Рочестерського медичного центру та RO1AI111914.

Заява інституційної наглядової ради:

Усі експерименти на тваринах проводилися після схвалення Комітетом з догляду та управління тваринами (ZOO-010-2020). CIE-ENCB ZOO 016/2014, 7 березня 2014 р.

Заява про інформовану згоду:

Не застосовується.

Заява про доступність даних:

Дані будуть надані відповідно до інституційних інструкцій.

Подяки:

Ми вдячні Рікардо Вільялобосу за допомогу з IHC та Рохеліо Ернандесу Пандо (INCMNSZ, Мехіко), який надав штам BCGphipps.

Конфлікт інтересів:

Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Список літератури

1. ХТО. Всесвітня організація охорони здоров'я: Туберкульоз—Глобальні факти 2011/2102. Женева: Департамент ВООЗ «Зупинимо туберкульоз». 2012. Доступно в Інтернеті: http://www.who.int/tb/publications/2011/factsheet_tb_2011.pdf (дата доступу: 1 лютого 2021 р.).

2. Файн, П. Е. Проказа: Що «ліквідується»? Бик. Всесвітній орган охорони здоров'я. 2007, 85, 1–2. [CrossRef]

3. Rambukkana, A. Як Mycobacterium leprae впливає на периферичну нервову систему? Trends Microbiol. 2000, 8, 23–28. [CrossRef]

4. Родрігес, ЮІА; Тріеллато, GL; Meirelles, NML; Тейшейра, CC; Ліон, С.; Esteves, ARM Методи класифікації прокази: порівняльне дослідження в Бразилії. Міжн. Ж. Інфікувати. дис. 2016, 45, 118–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Гелюк А.; van der Ploeg, J.; Телес, ОБР; Кіс, Л.; Франкен, MC; Прінс, К.; Ваутер, ді-джей; Сарно, NE; Сампайо, Е.П.; Otenhoff, THM. Раціональне поєднання пептидів, отриманих з різних білків Mycobacterium leprae, покращує чутливість для імунодіагностики інфекції M. leprae. Clin. Vacc. Immunol. 2008, 15, 522–533. [CrossRef] [PubMed]

6. Гелюк А.; Бобоша, К.; Шип, JJVDP-V.; Спенсер, Дж.С.; Бану, С.; Мартінс, MVSB; Чо, SN; Франкен, KLMC; Кім, HJ; Бекеле, Ю.; та ін. Нові біомаркери, що мають відношення до діагностики прокази, застосовні в зонах з гіперендемією прокази. J. Immunol. 2012, 188, 4782–4791. [CrossRef]

7. Гелюк, А. Біомаркери для прокази: Ви б віддали перевагу Т (клітинам)? Лепр. 2013, 84, 3–12. [CrossRef] [PubMed]

8. Алкайс, А.; Альтер, А.; Антоні, Г.; Орлова М.; Нгуєн, В.Т.; Сінгх, М.; Вандерборгт, PR; Катох, К.; Міра, М.Т.; Vu, HT; та ін. Поетапна реплікація визначає алель лімфотоксину з низьким рівнем вироблення як основний фактор ризику раннього початку лепри. Нац. Жене. 2007, 39, 517–522. [CrossRef] [PubMed]

9. Аванзі К.; Сінгх, П.; Трумен, RW; Suffys, PN Молекулярна епідеміологія прокази: оновлення. Інфікувати. Жене. еволюція 2020, 86, 104581. [CrossRef]

10. Ласторія, JC; Абреу, М. А. Лепра. Огляд епідеміологічних клінічних та етнопатогенних аспектів - частина 1. Бюстгальтери. Дерматол. 2014, 89, 205–218. [CrossRef]

11. Rojas-Espinosa, O. Current Topics on the Profiles of Host Immunological Response to Mycobacterial Infections; Книга відгуків; Tomioka, H., Ed.; Дослідницький покажчик: Тривандрам, Індія, 2009; С. 97–140.

12. Адамс, Л.Б.; Пена, Т.М.; Шарма, Р.; Хагге, AD; Шурр, Е.; Трумен, Р. В. Відомості про імуногенетику прокази на тваринних моделях. Огляд. Мем. ін-т Освальдо. Круз. 2012, 107, 197–208. [CrossRef]

13. Рохас-Еспіноза, О.; Becerril-Villanueva, E.; Век-Родрігес, К.; Арсе-Паредес, П.; Reyes-Maldonado, E. Параліч задніх кінцівок у мишей, інфікованих Mycobacterium lepraemurium, є результатом пошкодження кісток, а не ураження нервів. Clin. Exp. Immunol. 2005, 140, 436–442. [CrossRef]

14. Модлін, Л.Р. Вроджена імунна відповідь при проказі. Curr. Опін. Immunol. 2010, 22, 48–54. [CrossRef]

15. Олівейра, Р.Б.; Очоа, Монтана; Сілінг, Пенсільванія; Rea, TH; Рамбуккана, А.; Сарно, EN; Модлін, Р. Л. Експресія Toll-подібного рецептора 2 на клітинах Шванна людини: механізм пошкодження нервів при проказі. Інфікувати. Імунна. 2003, 71, 1427–1433. [CrossRef] 16. MacMicking, J.; Се, QW; Nathan, C. Оксид азоту та функція макрофагів. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 323–350. [CrossRef]

17. Еванс, Т.; Баттері, Л.; Карпентер, А.; Спрінгол, ДР; Полак, Дж.; Cohen, J. Оброблені цитокінами нейтрофіли людини містять індуковану синтазу оксиду азоту, яка виробляє нітрацію бактерій, що проковтнули. Proc. Natl. акад. наук. США 1996, 93, 9553–9554. [CrossRef] [PubMed]

18. Фонсека, А. Б.; Саймон, доктор медичних наук; Каззаніга, Р.А.; де Моура, TR; де Алмейда, РП; Duthie, MS; Рід, С.Г.; de Jesus, AR Вплив вроджених і адаптивних імунних реакцій на диференціальні клінічні результати прокази. Інфікувати. дис. Бідність 2017, 6, 5–13. [CrossRef] [PubMed]

19. Садху, С.; Хайтан Б.К.; Джоші, Б.; Сенгупта, У.; Nautiyal, AK; Мітра, Д. К. Взаємність між регуляторними Т-клітинами та клітинами Th17: значення для поляризованого імунітету при проказі. PLoS Negl. Троп. дис. 2016, 10, e0004338. [CrossRef] [PubMed]

20. Рохас-Еспіноза, О.; Век-Родрігес, К.; Arce-Paredes, P. Вплив екзогенної пероксидази на еволюцію мишачої прокази. Міжн. Ж. Лепр. Інші Mycobact. дис. 2002, 70, 191–200.

21. Ischiropoulos, H. Біологічне нітрування тирозину: патофізіологічна функція оксиду азоту та активних форм кисню. Арк. біохім. біофіз. 1998, 356, 1–11. [CrossRef]

22. Янг, Д. Б. Ліпід прокази є ключем до проникнення в клітину Шванна. Trends Microbiol. 2001, 9, 52–54. [CrossRef]

23. Беннард, О.; Cyster, JG Зародкові центри: запрограмовані на дозрівання афінності та диверсифікацію антитіл. Curr. Опін. Immunol. 2017, 45, 21–30. [CrossRef] [PubMed] 24. Віктора, Д.Г.; Nussenweig, MC Зародкові центри. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 429–457. [CrossRef] [PubMed]

25. Сіреллі, К.М.; Crotty, SH Посилення зародкового центру шляхом розширеної доступності антигену. Curr. Опін. Immunol. 2017, 47, 64–69. [CrossRef]

26. Гуд-Джейкобсон, К.Л.; Szumilas, CG; Чен, Л.; Шарп, AH; Томайко, М.М.; Shlomchik, MJ PD-1 регулює виживання В-клітин зародкового центру та утворення та афінність довгоіснуючих плазматичних клітин. Нац. Immunol. 2010, 11, 535–542. [CrossRef]

27. Волленберг, І.; Агуа-Доче, А.; Ернандес, А.; Алмейда, К.; Олівейра, В.Г.; Фаро, Дж.; Graca, L. Регулювання реакції зародкового центру Foxp3 плюс фолікулярні регуляторні Т-клітини. J. Immunol. 2011, 187, 4553–4560. [CrossRef] [PubMed]

28. Літтерман, М.А.; Пірсон, В.; Лі, С.К.; Калліс, А.; Кавамото, С.; Рейнер, Т. Ф.; Срівастава, М.; Дивекар Д.П.; Бітон, Л.; Хоган, Дж. Дж.; та ін. FOXP3 плюс фолікулярні регуляторні Т-клітини контролюють відповідь зародкового центру. Нац. Мед. 2011, 17, 975–982. [CrossRef]

29. Майлз, Б.; Connick, E. Контроль зародкового центру фолікулярними регуляторними Т-клітинами під час інфекції. Фронт. Immunol. 2018, 9, 2704–3710. [CrossRef]

30. Фу, В.; Лю, X.; Лін, X.; Фен, Х.; Сонце, Л.; Лі, С.; Чен, Х.; Тан, Х.; Лу, Л.; Джин, В.; та ін. Дефіцит Т-фолікулярних регуляторних клітин сприяє аутоімунітету. J. Exp. Мед. 2018, 215, 815–825. [CrossRef]

31. Піцаліс К.; Джонс, ГВ; Бомбардьєрі, М.; Jones, SA Ектопічні лімфоподібні структури при інфекції, раку та аутоімунітеті. Нац. Rev. Immunol. 2014, 14, 447–462. [CrossRef]

32. Алулу, М.; Карр, EJ; Гадор, М.; Біньон, А.; Liblau, RS; Фазільо, Н.; Лінтерман, Массачусетс Фолікулярні регуляторні Т-клітини можуть бути специфічними для імунізуючих антигенів і походити від наївних Т-клітин. Нац. Комун. 2016, 7, 10579–10589. [CrossRef]

33. Вінуеса, CG; Санц, І.; Cook, MC Порушення регуляції зародкових центрів при аутоімунних захворюваннях. Нац. Rev. Immunol. 2009, 9, 845–857. [CrossRef]

34. Cucak, H.; Йрлід, У.; Рейзіс, Б.; Калінке, У.; Johansson-Lindborn, B. Передача сигналів інтерферону типу I в дендритних клітинах стимулює розвиток резидентних Т-фолікулярних хелперних клітин лімфатичних вузлів. Імунітет 2009, 31, 491–501. [CrossRef]

35. Desvignes, L.; Вовк, AJ; Ернст, Дж. Д. Динамічна роль IFN типу I та II типу при ранньому інфікуванні Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 2012, 188, 6205–6215. [CrossRef]

36. Телес, МБР; Гребер, Г.Т.; Круцик Р.С.; Монтойя, Д.; Шенк, М.; Лі, Дж.Д.; Комісопулу, Е.; Келлі-Скампія, К.; Чун, Р.; Айєр, СС; та ін. Інтерферон типу I пригнічує антимікобактеріальну відповідь людини, викликану інтерфероном типу II. Наука 2013, 339, 1448–1453. [CrossRef]

37. Цзи, DX; Ямасіро, LH; Чен, К.Дж.; Мукайда, Н.; Крамник, І.; Дарвін, KH; Vance, RE Сприйнятливість до Mycobacterium tuberculosis, викликана інтерфероном I типу, опосередковується IL-1Ra. Нац. мікробіол. 2019, 4, 2128–2135. [CrossRef]

38. Манка, К.; Ценова Л.; Бергтольд, А.; Фріман, Ш.; Тові, М.; Муссер, М.Дж.; Баррі, ЄС, 3-й; Фрідман, HV; Kaplan, G. Вірулентність клінічного ізоляту Mycobacterium tuberculosis у мишей визначається нездатністю індукувати імунітет типу Th1 і пов’язана з індукцією IFN-/. Proc. Natl. акад. наук. США 2007, 98, 5752–5757. [CrossRef] [PubMed]

39 Телеска К.; Анджеліко, М.; Пікколо, П.; Носотті, Л.; Моррон, А.; Longhi, C.; Карбон, М.; Baiocchi, L. Лікування гепатиту D інтерфероном-альфа викликає загострення туберкульозу в іммігранта. Ж. Інфікувати. 2007, 54, e223–e226. [CrossRef] [PubMed]

40. Джакоміні, Е.; Ремолі, М.Е.; Гафа, В.; Пардіні, М.; Фатторіні, Л.; Coccia, EM IFN- покращує імуногенність BCG, впливаючи на дозрівання DC. Я. Левок. Biol. 2008, 85, 462–468. [CrossRef] [PubMed]

41. Рівас-Сантьяго, CE; Guerrero, GG IFN- Посилення Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Güerin-Vaccine Сприяє клітинній відповіді Th1 типу та захисту від інфекції M. tuberculosis. BioMed Res. Міжн. 2017, 2017, 6760. [CrossRef]

42. Герреро, Г.Г.; Rangel-Moreno, J.; Іслас-Трухільо, С.; Rojas-Espinosa, O. Послідовне внутрішньом’язове підсилення IFN-альфа захищає мишей, вакцинованих БЦЖ Mycobacterium bovis, від інфекції M. lepraemurium. BioMed Med. рез. Міжн. 2015, 2015, 414027.

43. Макнаб, Ф.; Майєр-Барбер, К.; Шер, А.; Вак, А.; O'Garra, A. Інтерферон типу I при інфекційних захворюваннях. Нац. Rev. Immunol. 2015, 15, 67–103. [CrossRef]

44. О'Ші, Дж. Дж.; Вісконті, Р. ІФН типу I та регуляція відповідей TH1: загадки вирішені та з’явилися. Нац. Immunol. 2000, 1, 17–19. [CrossRef]

45. González-Navajas, JM; Лі, Дж.; Девід, М.; Raz, E. Імуномодулюючі функції інтерферонів I типу. Нац. Rev. Immunol. 2012, 12, 125–135. [CrossRef]

46. ​​Ле Бон, А.; Жорсткий інтерферон DF типу I як стимул для перехресного праймінгу. Cytokine Growth Fact Rev. 2008, 19, 33–40. [CrossRef]

47. Браччі, Л.; Каніні, І.; Пузеллі, С.; Сестилі, П.; Вендітті, М.; Спада, М.; Донателлі, І.; Беларделлі, Ф.; Proietti, E. IFN типу I є потужним ад’ювантом слизової оболонки для селективної інтраназальної вакцинації проти вірусу грипу у мишей і впливає на захоплення антигену на рівні слизової оболонки. Vaccine 2005, 23, 2994–3004. [CrossRef]

48. Диван, Р.Б.; Атмар, Р.Л.; Кейт, TR; Quarles, JM; Кейтель, штат Вашингтон; Арден, NH; Уеллс, Дж.; Ніньо, Д.; Wyde, PR Контрастні ефекти інтерферону типу I як ад'юванта слизової оболонки для вакцини проти грипу у мишей і людей. Вакцина 2009, 27, 5344–5348. [CrossRef] [PubMed]

49. Дентон, А.Е.; Innocentin, S.; Карр, EJ; Бредфорд, БМ; Лафурс, Ф.; Мабботт, НА; Морбе, У.; Людевіг, Б.; Наречений, молодший; Good-Jacobson, KL; та ін. Інтерферон типу I індукує CXCL13 для підтримки формування ектопічного зародкового центру. J. Exp. Мед. 2019, 216, 621–637. [CrossRef]

50. Толедо, PTG; Батіста-Сільва, LR; Медейрос, RCA; Лара, Ф.А.; Moraes, MO Інтерферони типу I, аутофагія та метаболізм господаря при проказі. Фронт. Immunol. 2018, 23, 806–817. [CrossRef]

51. Чжан В.; Чжан, Ю.; Чжен, Х.; Пан, Ю.; Лю, Х.; Ду, П.; Ван, Л.; Лю, Дж.; Чжу, Б.; Жаг, Г.; та ін. Секвенування геному та аналіз вакцинних штамів БЦЖ. PLoS ONE 2013, 8, e071243. [CrossRef]

52. Век-Родрігес К.; Сільва-Міранда, М.; Арсе-Паредес, П.; Рохас-Еспіноза, О. Вплив реактивних посередників кисню на життєздатність та інфекційність Mycobacterium lepraemurium. Міжн. J. Exp. патол. 2007, 88, 137–145. [CrossRef]

53. Кім, Ш.; Коен, Б.; Новик, Д.; Рубінштейн, М. Рецептори інтерферону типу I у ссавців складаються з двох субодиниць: IFN-R1 та IFN-R2. Gene 1997, 196, 279–286. [CrossRef]

54 Луо Ю.; Чень, X.; Хан, Р.А.; О'Доннелл, М. Рекомбінантна паличка Кальметта-Герена (БЦЖ), що експресує людський інтерферон-альфа 2В, демонструє підвищену імуногенність. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123, 264–270. [CrossRef] [PubMed]

55. Сонце, Е.; Ніан, X.; Лю, К.; Фан, X.; Han, R. Конструювання рекомбінантного людського IFN -2b BCG та його протипухлинний вплив на клітини раку сечового міхура in vitro. Жене. мол. рез. 2015, 14, 3436–3449. [CrossRef] [PubMed]

56. Прабхакаран, К.; Харріс, EB; Kirchheimer, WF Зв'язування 14C-міченої допи Mycobacterium leprae in vitro. Міжн. Ж. Лепр. Інші Mycobact. дис. 1976, 44, 58–64.

57. Дрейпер, П. Очищення Mycobacterium leprae. У матеріалах Додатку 4 доповіді п’ятої зустрічі Наукової робочої групи з імунології прокази (IMMLEP), Женева, Швейцарія, 24–26 червня 1980 р.; Всесвітня організація охорони здоров'я: Женева, Швейцарія, 1980 р.

58 Ішіропулос Х.; Нельсон, Дж.; Дюран, Д.; Аль-Мехді, А. Реакції оксиду азоту та пероксинітриту з органічними молекулами та пероксидазою заліза хрону: втручання у визначення пероксиду водню. Вільний радикал. Biol. Мед. 1996, 20, 373–381. [CrossRef]

59. Шен, Т.; Ернандес-Пандо, Р.; Негессе, Ю.; Лікасса, Р.; Сундквіст, Т.; Бріттон, С. Експресія індуцибельної синтази оксиду азоту та нітротирозину в прикордонних ураженнях прокази. бр. J. Dermatol. 2001, 145, 809–815. [CrossRef]

60. Сільва-Міранда, М.; WeK-Родрігес, К.; Мартінес, CE; Рохас-Еспіноза, О. Експресія циклооксигенази-2, альфа-1-кислого глікопротеїну та індуцибельної синтази оксиду азоту в розвиваються ураженнях мишачої прокази. Міжн. J. Exp. шлях. 2006, 87, 485–494. [CrossRef]

61. Ернандес-Пандо, Р.; Шен, Т.; Orozco, EH; Серафін, Т.; Естрада-Гарсія, І. Експресія індуцибельної синтази оксиду азоту та нітротирозину під час еволюції експериментального туберкульозу легень. Exp. Токсичний. патол. 2001, 53, 257–265. [CrossRef]

62. Ізкуе, А.; Кумбс, JL; Powrie, F. Регуляторні лімфоцити та кишкове запалення. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 313–338. [CrossRef]

63. Сакагучі, С.; Міяра, М.; Костянтино, CM; Hafler, DA FOXP3 плюс регуляторні Т-клітини в імунній системі людини. Нац. Rev. Immunol. 2010, 10, 490–500. [CrossRef]

64. Плоткін С. А. Кореляти захисту, індукованого вакцинацією. Clin. Вакцина Імунол. 2010, 17, 1055–1065. [CrossRef] [PubMed]

65 Ву Х.; Чен, Ю.; Лю, Х.; Сюй, Л.-Л.; Теушер, П.; Ван, С.; Лу, С.; Дент, А. Л. Фолікулярні регуляторні Т-клітини пригнічують вироблення цитокінів фолікулярними хелперними Т-клітинами та оптимізують відповіді IgG у мишей. Євро. J. Immunol. 2016, 46, 1152–1161. [CrossRef] [PubMed]

66. Джеянатан, М.; Дам'янович, Д.; Шалер, CR; Лай, Р.; Ворцман, М.; Інь, К.; Зганяч, А.; Ліхті, Д.; Xing, Z. Differentially imprinted innate immunity by mucosal boost vaccination визначає протитуберкульозні результати імунного захисту, незалежно від T-клітинного імунітету. Мукозальний імунол. 2013, 6, 612–625. [CrossRef] [PubMed]

67. Джеянатан, М.; Шао, З.; Ю, X.; Харкнесс, Р.; Цзян, Р.; Лі, Дж.; Сін, З.; Zhu, T. AdHu5Ag85A Посилення імунізації слизової оболонки дихальних шляхів підвищує захист від легеневого туберкульозу у приматів, які не є людиною, обробленими БЦЖ. PLoS ONE 2015, 10, e0135009. [CrossRef]

68. Афхамі, С.; Драмонд, Вірджинія; Д'Агосітніо, MR; Джеянатан, М.; Гіллграсс, А.; Xing, Z. Просування стратегій імунотерапевтичних вакцин проти легеневого туберкульозу. Фронт. Immunol. 2020, 11, 557809. [CrossRef]

69. Торрадо, Е.; Робінсон, RT; Купер, А. М. Клітинна відповідь на мікобактерії: баланс захисту та патології. Trends Immunol. 2011, 32, 66–72. [CrossRef]

70. Сюй, X.; Гао, В.; Ченг, С.; Інь, Д.; Лі, Ф.; Ву, Ю.; Сонце, Д.; Чжоу, С.; Ван, Д.; Чжан, Ю.; та ін. Протизапальні та імуномодулюючі механізми аторвастатину в мишачій моделі черепно-мозкової травми. J. Neuroinflamm. 2017, 14, 167–182. [CrossRef]

71. Азім, В.; Маукон, Б.Р.; Аппель, С.; Мегрете, А.О.; Kalland, KH Подвійні про- та протизапальні властивості дендритних клітин, отриманих з моноцитів. Фронт. Immunol. 2020, 11, 438–453. [CrossRef]

72. Султана, С.; Бішай, Б. Нейтралізація TNFR-1 і TNFR-2 модулює септичний артрит, індукований S. aureus, регулюючи рівні прозапальних і протизапальних цитокінів під час прогресування захворювання. Immunol. Lett. 2018, 196, 33–51. [CrossRef]

73. Порнографія, Д.; Гілліган, М.М.; Хуанг, С.; Гартунг, А.; Кортес-Пух, І.; Сіме, П. Дж.; Фіппс, Р.П.; Серхан, CHN; Hammock, BD Ліквідація запалення: подвійний підхід до запобігання цитокіновим штормам у COVID-19 Cancer Metastasis Rev. 2020, 39, 337–340. [CrossRef]

74. Лонгі М.П.; Trumpfheller, C.; Ідояга, Дж.; Кескі, М.; Матос, І.; Клюгер, К.; Салазар, AM; Колонна, М.; Стейнман, Р. М. Дендритним клітинам потрібна системна відповідь на інтерферон типу I для дозрівання та індукції імунітету CD4 плюс Th1 з полі IC як ад’ювантом. J. Exp. Мед. 2009, 206, 1589–1602. [CrossRef]

75. Хадер, С.А.; Гуглані, Л.; Rangel-Moreno, J.; Гопал, Р.; Юнечко, БАФ; Фонтан, ЖЖ; Мартіно, К.; Перл, JE; Тайе, М.; Лін, Ю.-Й.; та ін. IL-23 необхідний для тривалого контролю над Mycobacterium tuberculosis і утворенням В-клітинних фолікулів в інфікованих легенях. J. Immunol. 2011, 187, 5402–5407. [CrossRef] [PubMed]

76. Choreño-Parra, JA; Бобба, С.; Rangel-Moreno, J.; Ахмед, М.; Мехра, С.; Роза, Б.; Мартін, Дж.; Мітрева, М.; Каушал, Д.; Суніга, Дж.; та ін. Інфекція Mycobacterium tuberculosis HN878 індукує людські В-клітинні фолікули у мишей. Ж. Інфікувати. дис. 2020, 221, 1636–1646. [CrossRef] [PubMed]

77. Шмідт, Е. Г.; Харібхай, Д.; Вільямс, Дж. Б.; Аггарвал, П.; Цзя, С.; Шарбоньє, Л.М.; Ян, К.; Лорьє, Р.; Тернер, А.; Зігельбауер, Дж.; та ін. IL-10, що виробляється клітинами iTreg, контролює коліт і патогенну екс. Treg клітини під час імунотерапії. J. Immunol. 2012, 189, 5628–5648. [CrossRef]

78. Рубцово Ю.П.; Расмуссен, Дж. П.; Чі, Ю.; Фонтенот, Дж.; Кастеллі, І.; Є, X.; Тройтінг, П.; Сієве, І.; Роерс, А.; Хендерсон, WRJ; та ін. Регуляторний Т-клітинний інтерлейкін-10 обмежує запалення на межах навколишнього середовища. Імунітет 2018, 28, 546–558. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com