Нанозими, що чутливі до запалення, що імітують каталазу, полегшують гостре ураження нирок шляхом реверсії місцевого окисного стресу

Анотація

Фон: Theактивні форми кисню (АФК)і добре відомо, що запалення, критичний фактор пошкодження тканин, пов’язане з різними захворюваннями. Нирка чутлива до гіпоксії та вразлива до АФК. Таким чином, порочне коло міжокислювальний стресі нирковоїгіпоксія критично сприяєдо прогресуванняхронічні захворювання нирокі нарешті,термінальна стадія ниркової недостатності. Таким чином, доставка терапевтичних агентів до місця запалення, багатого на АФК, і вивільнення терапевтичних агентів є можливим рішенням.

Нові трави від захворювань нирок

Результати: ми розробили універсальну наноплатформу з довготривалою циркуляцією, чутливою до запалення та поглинанням АФК, шляхом стабільного завантаження стабілізованого додекантіолом Mn3O4 (dMn), що імітує 1-каталазу3O4) наночастинки всередині чутливих до АФК наномі‑клітин (PTC), що призводить до АФК-чутливого нанозиму (PTC-M). Гідрофобний dMn3O4наночастинки були завантажені всерединуМіцели PTC запобігають передчасному вивільненню під час кровообігу та діють як терапевтичний агент завдяки чутливості до АФКзвільнення навантаженого dMn3O4як тільки воно досягне місця запалення.

Ключові слова:Наночастинки Mn3O4, Нанозими, Запалення,Ішемія-реперфузія, нирка

Фон

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>в 1,5 рази від вихідного рівня протягом семи днів або зменшення об’єму сечі<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Ішемічно-реперфузійне пошкодження (IRI)це ураження органу, викликане тимчасовим зниженням або припиненням кровотоку з подальшою реперфузією, і може зустрічатися в різних клінічних ситуаціях, таких як шок, інфаркт міокарда, ішемічний інсульт, великі операції та трансплантація органів. ІРІ нирок є однією з основних причин ГПН, що призводить до швидкого зниження функції нирок. Нирки є органом, особливо сприйнятливим до ішемічних уражень, і пошкоджені клітини канальцевого епітелію в подальшому спричиняють порушення виведення продуктів розпаду та контролю водного, електролітного та кислотно-лужного балансу [6]. Відомо, що механізм ураження клітин ниркових канальців при ІРІ включає запалення, викликане активними формами кисню (АФК), що утворюються під час реперфузії [6–8]. Тому були спроби застосувати видалення АФК для лікування ІРІ. Однак його реальне клінічне застосування було обмеженим через побоювання щодо системних побічних ефектів, які включають реакції гіперчутливості [9]. Введення антиоксидантів, таких як едаравон, вже використовувалося для видалення АФК при ІРІ. Однак це супроводжувалося кількома побічними ефектами, і, отже, висунуто вимоги до нових та ефективних антиоксидантів, таких як нанозими (наноматеріали, що виявляють природну ферментоподібну активність) [9–13]. Яо та ін. виявили, що нан-частинки Mn3O4 володіють декількома активністю, що імітує ферменти, тобто активністю, що імітує супероксиддисмутазу та каталазу, а також активністю поглинання гідроксильних радикалів [11]. Було показано, що Mn3O4 володів сильнішою здатністю поглинати АФК, ніж інші ферменти, такі як V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 і Fe3O4, і був кращим, ніж у інших типів оксиду марганцю (MnOx (MnO2, MnO і Mn2O3).

Рис. 1 Схематичне зображення приготування та механізму дії PTC-M A Синтез PTC-M, B Механізм дії PTC-M (1) внутрішньовенна ін’єкція PTC-M (2) введений PTC-M циркулює в крові і накопичується в місці запалення (3) дестабілізація PTC-M через власну присутність АФК у місці запалення (4) вивільнення завантаженого dMn 3O4 у місці запалення (5) вивільнений dMn3O4 каталізує поглинання АФК, що призводить до (6) зменшення запалення, апоптозу та фіброзу (7) полегшення пошкодження нирок і (8) покращення функції нирок

Результати

Синтез і характеристика наночастинок dMn3O4 і полімерних кон'югатів

НЧ Te dMn3O4 синтезовано методом співосадження та стабілізовано тіоловими групами 1-додекантіолу (рис. 2А). Аналіз електроемісійної просвічуючої електронної мікроскопії (FE-TEM) продемонстрував, що НЧ dMn3O4 мали середній розмір менше 2{{10}} нм (18.0±0,6 нм) (рис. 2B) ). Додатковий файл 1: на малюнках S1A і S1B показано зображення та схематичне зображення отриманого dMn3O4. Дані енергетичної дисперсійної рентгенівської спектроскопії (EDS) показали наявність Mn з Mn3O4 та сірки та вуглецю з SH-C12 (рис. 2C і додатковий файл 1: рис. S1C). Результати аналізу рентгенівської фотонної спектроскопії (XPS) показали спектр XPS Mn 2p, який складався з двох піків, розташованих при 641,42 еВ і 653,23 еВ, і ці піки були віднесені до Mn 2p3/2 і Mn 2p1/2 відповідно (рис. 2D і додатковий файл 1: рисунок S2). Енергетичний розрив між цими двома піками становив 11,81 еВ, що добре узгоджується з даними літератури для Mn3O4. У рентгенограмі порошкової дифракції (XRD) НЧ dMn3O4, як показано на рис. 2E, усі виміряні дифракційні піки добре збігаються зі стандартною картиною гаусманніту Mn3O4 [ICDD: #001–1127], підтверджуючи їх високу кристалічність. природи. Реагуючий на АФК кон’югат PTC був отриманий за допомогою поетапних хімічних реакцій, у яких тіокетальний (TK) лінкер із кінцевою карбоксилатною групою був визначений за розміром першим. Потім карбоксильну групу лінкера TK кон’югували з аміногрупою метокси-PEG-аміну (PEG-AM) за допомогою реакції EDC/NHS для утворення PEG-TK. Нарешті, інша карбоксильна група PEG-TK знову була кон’югована з аміногрупою стеараміну за допомогою реакції EDC/NHS [15]. Кон'югат PC, що не реагує на АФК, був отриманий шляхом кон'югування стеаринової кислоти з PEG-AM. Склад PTC і PC аналізували за допомогою спектроскопії 1 H ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (додатковий файл 1: малюнок S3). Спектри ЯМР показали характерні піки при δ 0,83 і 1,23 м.д., що відповідають метильним і метиленовим протонам C18. Пік при δ 3,6 відповідав O–CH2–CH2- PEG. Ступінь заміщення (DS %) C18 у PTC і PC був розрахований як 78% і 46% відповідно

Отримання та характеристика ферменту PTC‑M

Te ROS-чутливі наноміцели (PTC) були завантажені dMn3O4, в результаті чого утворився PTC-M. Співвідношення подачі dMn3O4 (20%) PTC було використано для приготування PTC-M. Гідродинамічний діаметр, дзета-потенціал і зображення FE-TEM підготовлених PTC і PTC-M показані на рис. 3A та додатковому файлі 1: рис. S4A. Зображення PTC методом FE-TEM продемонстрували сферичні наноміцели з однаковими розмірами частинок. Гідродинамічний діаметр PTC-M трохи збільшився після завантаження dMn3O4 через упаковку dMn3O4 у гідрофобному просторі, тоді як дзета-потенціал залишався негативним в обох наноміцелах через екранування PEG. Зображення FE-TEM PTC і PTC-M показали рівномірно розподілені частинки. Вміст навантаження та ефективність інкапсуляції були розраховані за допомогою мас-спектрометричного аналізу та були розраховані як 10±3% та 17±6% відповідно. Присутність dMn3O4 була помітна на FE-TEM зображеннях PTC-M (рис. 3A), що було додатково підтверджено аналізом EDS PTC-M, показуючи Mn з Mn3O4, сірку та вуглець з SH-C12 та вуглець , азоту та кисню з PEG (додатковий файл 1: малюнок S5). Термогравіметричний (TGA) аналіз був виконаний, і за розрахунками вміст dMn3O4 становив 12% (додатковий файл 1: малюнок S6B). АФК-нечутливі міцели, завантажені dMn3O4 (PC-M), також були приготовлені як контролі тим же методом.

Щоб підтвердити роль зв’язку TK у дестабілізації PTC-M, що реагує на АФК, і вивільненні dMn3O4, PTC-M піддавали впливу АФК шляхом додавання H2O2. В якості контролю ми використовували ROS-нечутливий PC-M. І PTC-M, і PC-M демонстрували сферичну морфологію з щільно упакованим dMn3O4 у наноміцелах, але після обробки H2O2 супра-збірка PTC-M була спотворена, після чого вивільнявся dMn3O4, який потім був агреговані, як показано на зображеннях FE-TEM, тоді як PC-M показав стабільні структури навіть після впливу H2O2 (рис. 3B і додатковий файл 1: рис. S4B). Сприйнятливість PTC-M до АФК була додатково підтверджена шляхом порівняння змін гідродинамічного діаметра та дзета-потенціалу з PC-M, як показано в додатковому файлі 1: малюнок S7. Гідродинамічний діаметр і дзета-потенціал АФК-нечутливого PC-M не показали помітної різниці після додавання H2O2. Однак чутливий до АФК PTC-M продемонстрував зменшені гідродинамічні розміри, ймовірно, через видалення PEG екранування через поломку TK, що призвело до дестабілізації структури. Після додавання H2O2 дзета-потенціал змінився з негативного на позитивний, що могло бути пов’язано з видаленням PEG і впливом пари. Ми далі вивчали зміну розміру, перевіряючи стабільність у часі шляхом відстеження гідродинамічних діаметрів у присутності або відсутності H2O2 (рис. 3C). Після додавання H2O2 гідродинамічні діаметри значно зменшилися протягом 10 с без подальших змін протягом часу до шести днів, тоді як один PTC-M показав стабільні розміри під час експерименту, що свідчить про хорошу колоїдну стабільність PTC-M. Ми також перевірили стабільність у 10% FBS і спостерігали, що PTC-M показав хорошу стабільність протягом 4 днів (додатковий файл 1: малюнок S9). Гідрокси динамічні діаметри та зміну дзета-потенціалу також підтверджено за допомогою АФК-чутливих і нечутливих порожніх наноміцел (PTC і PC) (додатковий файл 1: малюнок S8). Усі ці порівняльні дослідження в присутності або відсутності АФК продемонстрували стабільність і чутливість до АФК підготовлених наномолей або кінцевого ферменту dMn3O4 PTC-M.

Рис. 2 Синтез і характеристика dMn3O4. Схематична ілюстрація синтезу dMn 3O4, B зображення FE-TEM, C EDS-аналіз, D XPS-спектр та E XRD-структури dMn3O4 NPs

Ми додатково перевірили властивість елімінації H2O2 кінцевого ферменту PTC-M через навантаження dMn3O4 NP. Це було перевірено з використанням терефталевої кислоти (TA) як зонда ф’ючерсних центів. ТА прореагувала з H2O2 з утворенням 2-гідрокситерфталевої кислоти з флуоресцентним піком при 425 нм. dMn3O4 перетворює H2O2 на воду та кисень і, отже, інтенсивність флуоресценції зменшується, підтверджуючи активність каталази, як показано на рис. 3D. Te PTC-M продемонстрував сильне зниження інтенсивності флуоресценції порівняно з PTC порожньої міцели в присутності H2O2 з часом. Каталазоподібна активність PTC-M також залежала від концентрації, як показано в додатковому файлі 1: рис. S10. Здатність PTC-M до виробництва кисню була додатково підтверджена за допомогою O2-специфічного флуоресцентного зонда Ru(DDP) у присутності H2O2. Флуоресценція в десяти містах Ru(DDP) зменшується в присутності O2, що свідчить про ефективне виробництво O2. Як показано на рис. 3E, інтенсивність флуоресценції Ru(DDP) зменшувалася в присутності H2O2 у групі PTC-M, тоді як присутність H2O2 у групі, яка отримувала лише PTC, показала невелике зниження флуоресценції (рис. 3F), підтверджуючи активність каталази, що призводить до виробництва кисню в PTC-M. Нарешті, ми підтвердили здатність PTC-M видаляти H2O2 за допомогою вимірювача виявлення кисню. Як показано на рис. 3G, виробництво кисню за допомогою PTC-M було збільшено протягом початкового часу з подальшим повільним збільшенням, тоді як порожні міцели PTC не показали виробництва кисню. Диспропорційність H2O2 спостерігалася шляхом утворення бульбашок кисню в групі PTC-M, як показано в додатковому файлі 1: малюнок S11A. Було також помічено, що PTC-M демонструє більшу продукцію кисню порівняно з dMn3O4 окремо, ймовірно, через щільне упакування dMn3O4 у PTC-M, що робить його більш доступним для реакції порівняно з вільним dMn3O4 (Додатковий файл 1: рис. S11B). Незважаючи на те, що наноміцели розпушилися внаслідок обробки H2O2, як показано на FE-TEM, dMn3O4 все ще міг бути присутнім усередині PTC-M, що призвело до високої активності каталази порівняно з вільним dMn3O4. Усі ці результати разом підтвердили найкращу активність PTC-M, що імітує каталазу.

Життєздатність клітин in vitro та поглинання клітинами

Щоб підтвердити поглинання клітинами та сприйнятливість до АФК внутрішньоклітинно розподілених АФК-чутливих ПТК і схему вивільнення корисного навантаження, ми порівняли ПТК з ПК в умовах in vitro. Спочатку ми перевірили життєздатність клітин підготовлених PTC, PC, PTC-M і PC-M у клітинах HK-2 за допомогою аналізу WST-1 (додатковий файл 1: малюнок S12). Порожні міцели зазнали незначної загибелі клітин, але після завантаження dMn3O4- життєздатність клітин знизилася, але ця зміна не була статистично значущою. Оскільки порожні міцели не були цитотоксичними, незначна зміна життєздатності клітин могла бути пов’язана з адсорбованим на поверхні dMn3O4. Значення IC50 для PTC-M і PC-M було визначено як 130,41 і 247,17 мкг/мл відповідно (рис. 4A). Для подальшого вивчення внутрішньоклітинного поглинання та розподілу наноміцел IR780 використовувався як модель препарату та підготував IR780 наноміцели PTC, PTC-IR780 для візуалізації інтенсивності флуоресценції IR780 за допомогою веселої мікроскопії присутності (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific , США) (рис. 4B). Як контрольна група ми також проаналізували поглинання нечутливого до АФК PC-IR780. Порівняно з PC-IR780, PTC-IR780 продемонстрував більше поглинання в клітинах HK-2 (додатковий файл 1: малюнок S13). Точна причина посиленого поглинання PTC-IR780 в умовах без АФК не зрозуміла, однак це може бути тому, що PTC може проявляти незначну чутливість до нормального рівня АФК в умовах клітинної культури, що призводить до деекранування PEG, що залишає поверхню заряд злегка позитивний. PC-IR780 продемонстрував подібну картину поглинання незалежно від АФК, спричинених лікуванням H2O2 або станів АФК, спричинених гіпоксією, через нечутливість, тоді як PTC-IR780 продемонстрував іншу картину розподілу всередині клітин, що могло бути наслідком посиленого вивільнення IR780 всередині клітин. Попередні дані про життєздатність клітин (додатковий файл 1: малюнок S11), які демонструють підвищену загибель клітин у PTC-M, були також пов’язані з покращеним поглинанням клітинами PTC порівняно з PC. Йодид IR780 є високогідрофобним барвником, який може виявляти високу спорідненість до клітинної мембрани та демонструє дуже яскравий сигнал незалежно від впливу АФК. Поглинання клітинами було додатково проаналізовано шляхом перевірки середньої інтенсивності флуоресценції (MFI) за допомогою аналізу флуоресцентно-активованого сортування клітин (FACS) (рис. 4C), який підтвердив дані, отримані за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Як показано, MFI був найвищим у групі PTC IR780, чутливої ​​до АФК, порівняно з іншими групами, що підтверджує посилене вивільнення IR780 у клітинах. Далі ми кількісно порівняли MFI від різних груп (рис. 4D), які підтвердили дані мікроскопії, які свідчать про те, що PC-IR780 не демонструє жодної суттєвої різниці в поглинанні клітинами навіть за умов, індукованих ROS, тоді як PTC IR780 показав значне збільшення клітинного поглинання. поглинання при лікуванні в умовах, індукованих АФК. Поглинання PTC клітинами також визначали шляхом перевірки залишкового Mn у клітинах після обробки PTC-M. Як показано на рис. 4E, PTC-M продемонстрував залежне від концентрації поглинання в клітинах HK-2. Таким чином, ці результати підсумовують посилену інтерналізацію наноміцел і прискорене вивільнення всередині клітин, ймовірно, через опосередковане АФК розбирання наноміцел.

Ми провели дослідження in vitro на клітинах HK-2, щоб глибше вивчити вплив PTC-M на умови окисного стресу на клітинному рівні. Клітини HK-2 стимулювали H2O2, представником АФК (рис. 5A). H2O2 посилював експресію гемоксигенази (HO)-1, яка була покращена спільною обробкою PTC-M (рис. 5A). Тест 2′,7′-дихлордигідрофуресцеїну діацетату (DCF DA) проводили для перевірки характеру внутрішньоклітинних змін АФК. Клітини Te HK-2, стимульовані H2O2, показали високу інтенсивність флуоресценції, але після спільної обробки PTC-M інтенсивність флуоресценції була знижена (рис. 5B). Співвідношення Te BAX/BCL-2 було збільшено за допомогою обробки H2O2, яке також було відновлено за допомогою спільного лікування PTC-M, що вказує на захист від апоптозу (рис. 5C). Клітини HK-2, оброблені H2O2, продемонстрували значне прогресуюче збільшення фарбування анексином V+/PI−, якому запобігло PTC-M (рис. 5D). Індуковане H2O2-фосфорилювання ERK, JNK і p38 також пригнічувалося шляхом спільної обробки з PTC-M, хоча значного зниження фосфорильованого P38 не спостерігалося (рис. 5C). Ці дані свідчать про те, що PTC-M пригнічує індуковані ROS апоптотичні процеси в епітеліальних клітинах ниркових канальців.