Інактивація RPX1 у Arabidopsis надає стійкість до Plutella Xylostella через накопичення гомотерпену DMNT

Анотація

Лускокрилі шкідники Plutella xylostella спричиняють серйозні обмеження у вирощуванні Brassica. Тут ми повідомляємо про нову роль RPX1 (стійкість до P. xylostella) у стійкості Arabidopsis thaliana до цього шкідника. Мутант rpx1-1 відлякує личинки P. xylostella, і живлення мутантом rpx1-1 серйозно пошкоджує структуру перитрофічного матриксу в середній кишці личинок, тим самим негативно впливаючи на ріст личинок і окукливание. Ця резистентність є результатом накопичення захисних сполук, включаючи монотерпен (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатрієн (DMNT), завдяки активації ПЕНТАЦИКЛІЧНОЇ ТРИТЕРПЕН-СИНТАЗИ 1 (PEN1), яка кодує ключовий біосинтетичний фермент DMNT. Інвазія та поранення P. xylostella викликають деградацію білка RPX1, що може забезпечити швидку реакцію на інвазію комах. Інактивація RPX1 і надмірна експресія PEN1 не пов’язані з негативними компромісами для росту рослин, але мають набагато більшу продуктивність насіння, ніж дикого типу за присутності зараження P. xylostella. Це дослідження пропонує нову стратегію молекулярної селекції рослин проти P. xylostella.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

  КЛЮЧОВІ СЛОВА

стійкість до шкідників, вторинний метаболізм, викиди летких речовин

1|ВСТУП

Комахи-шкідники не тільки знижують урожайність, але й впливають на якість продукції рослинництва (Johnson & Züst, 2018; Wu et al., 2016; Zhao et al., 2016). Серед них діамантова міль Plutella xylostella є широко поширеним і шкідливим лускокрилим шкідником, який харчується хрестоцвітими культурами, такими як цвітна та білокачанна капуста, завдаючи величезних економічних збитків. В даний час у управлінні сільським господарством боротьба зі шкідниками за допомогою агрохімікатів (наприклад, пестицидів) була дуже успішною та активно застосовуваною, але цей підхід стає проблематичним через потенційне забруднення навколишнього середовища та загрозу здоров’ю людини (Shakeel et al., 2017). Альтернативним підходом до рослинництва є використання генетично модифікованих культур із підвищеною стійкістю до шкідників, наприклад, у рослинній експресії Bacillus thuringiensis (Jouzani та ін., 2017) або інших гетерологічних ентомотоксичних білків (Douglas, 2018). Значні зусилля були докладені для визначення нових підходів до боротьби з P. xylostella у сільському господарстві; однак кількість ефективних генів, природних пестицидів і стійкої зародкової плазми залишається обмеженою (Zhou & Jander, 2021). Через постійну гонку озброєнь з комахами-шкідниками рослини розвинули різноманітні здібності для боротьби з нападами комах. Відповідно, у відповідь на ураження шкідниками. Жасмонова кислота (JA), яку також називають «гормоном рани», відіграє центральну роль у різних реакціях на пошкодження, пов’язані з ранами, ініційованими зараженням комахами (Lortzing & Steppuhn, 2016). Все більше доказів свідчать про те, що JA функціонує синергетично та/або антагоністично з іншими фітогормонами, такими як саліцилова кислота (SA) та етилен (Costarelli та ін., 2020; Ma та ін., 2019). Крім прямого захисту, рослини, пошкоджені нападами комах, виділяють різні леткі сполуки, які приваблюють природних ворогів травоїдних тварин (Gols, 2014). З цих складних летких сумішей гомотерпенові сполуки (3E)-4,8-диметил-1,3,7-нонатрієн (DMNT) і (E, E) -4,8,12-триметил-1,3,7, Повідомлялося про наявність 11-тридекатетраєну (ТМТТ) у кількох видах рослин, таких як Arabidopsis (Lee та ін., 2010; Sohrabi та ін., 2015), рис (Li та ін., 2018), кукурудза (Gouinguené та ін., 2005). ; Richter та ін., 2016) і бавовни (Liu та ін., 2018). Кілька досліджень також показали, що DMNT діє як сигнальна молекула, яка індукує захист від травоїдних тварин під час спілкування між рослинами (Arimura та ін., 2000; Meents та ін., 2019). Наприклад, після пошкодження комахами, які жують, деякі види солодкої картоплі виділяють DMNT, що призводить до системної індукції інгібітора протеази розтягування в сусідніх рослинах солодкої картоплі та робить їх неперетравлюваними для комах (Meents et al., 2019). Подібні результати спостерігалися для чайних рослин (Jing та ін., 2020). Нещодавно ми виявили, що DMNT відіграє певну роль у знищенні личинок P. xylostella, руйнуючи бар’єр перитрофічного матриксу (PM) у середній кишці комах (Chen та ін., 2021).

У вищих рослинах шляхи біосинтезу DMNT і TMTT були добре охарактеризовані за допомогою зворотного генетичного та біохімічного аналізів. У кукурудзі DMNT і TMTT утворюються в результаті окисної деградації (E)-неролідолу та (E, E)-геранілліналоолу двома монооксигеназами P450, CYP92C5 і CYP92C6 (Richter et al., 2016). У бавовні два гени CYP (GhCYP82L1 і GhCYP82L2) відповідають за перетворення (E)-неролідолу в DMNT і (E, E)-геранілліналоолу в TMTT (Liu et al., 2018). У коренях арабідопсису DMNT каталізується з попередника C30 тритерпендіолу, каннабідіолу, монооксигеназою цитохрому P450, яка кодується специфічним для кореня геном CYP705A1 (Sohrabi et al., 2015). Дослідження з використанням дріжджів як модельного організму представило докази того, що каннабідіол виробляється з 2,3-оксидосквалену каннабідіолсинтазою PEN1 (Xiang та ін., 2006), і експресія якої синергічно пов’язана з CYP705A1 (Sohrabi та ін. ., 2015). Тим не менш, регуляція ключових генів у біосинтезі DMNT залишається в основному невідомою. Ген RPX1, описаний у цьому дослідженні, кодує новий кеп-зв’язуючий білок (CBP), який є членом сімейства генів фактора ініціації еукаріот 4E (eIF4E). У рослин сімейство eIF4E складається з eIF4E1, eIF4E2, eIF(iso)4E та nCBP, які відіграють важливу роль в ініціації кеп-залежної трансляції мРНК (Rhoads, 2009). Члени сімейства eIF4E є основними джерелами рецесивної стійкості до вірусу картоплі Y (PVY) — найбільш шкідливого патогену, що впливає на врожайність і якість картоплі, а використання технології CRISPR-Cas9, націленої на ген eIF4E1, розширює спектр стійкості Solanum tuberosum до вірусу картоплі Y. (Lucioli та ін., 2022). Подібним чином CRISPR/Cas9-опосередковане редагування ізоформ eIF4E маніоки nCBP-1 і nCBP-2 зменшує тяжкість і частоту симптомів, спричинених коричневою смугою хворобою маніоки (Gomez et al., 2019). Крім того, дослідження Arabidopsis демонструють, що дефіцит nCBP відіграє певну роль в обмеженні переміщення рослинних вірусів між клітинами (Keima et al., 2017). Тим не менш, про функцію nCBP у захисті рослиноїдних не повідомлялося. Тут ми використовуємо інтегративний підхід для функціональної характеристики гена Arabidopsis RPX1, який відіграє важливу роль у стійкості рослин до P. xylostella. Наші результати показують, що руйнування RPX1 призводить до диференціально експресованих генів (DEG) і накопичення сполук. Одним із генів з підвищеною регуляцією є PEN1, який є ключовим для біосинтезу DMNT. Зараження мутантом rpx1 і накопичення DMNT впливають на структуру ПМ P. xylostella і викликають дефекти розвитку личинок і смерть. Подальші докази демонструють, що інвазія та поранення P. xylostella викликають деградацію білка RPX1, що, у свою чергу, може призвести до стійкості рослин до комах.

2|МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1|Рослинна сировина та умови зростання

Насіння арабідопсису було замовлено в Ноттінгемському центрі арабідопсису (NASC, http://Arabidopsis.info/). Насіння поверхнево стерилізували, висівали на середовище Мурасіге та Скуга (MS) і стратифікували при температурі 5 градусів у ростовій камері за короткого світлового періоду (8 годин світла, 16 годин темряви) протягом 3 днів. Потім їх перенесли в теплицю при температурі 22 градуси на довгий світловий день (16 годин світла, 8 годин темряви) зі звичайним утриманням рослин.

2.2|Експерименти з вибором (перевагами) і без вибору та біотести

Яйця P. xylostella були придбані у Henan Jiyuan Baiyun Company (Cat: HJB004, розроблено в 2009 році, розмножені для наукових досліджень у контрольованому середовищі) та інкубовані в камері для вирощування, встановленій на 26 градусів, 16 годин світла/8 годин темряви. Для експериментів із вибором ми перенесли 3-тижневі рослини арабідопсису (вісім рослин дикого типу та мутантних рослин відповідно) у тестові резервуари, які були під’єднані до обох кінців скляної пробірки, а решта експериментальних етапів виконувалися, як описано раніше ( Чен та ін., 2021). Були використані личинки четвертої стадії, і 15 личинок були включені в кожну експериментальну повторність.

Для експерименту без вибору 3-тижневі рослини дикого типу та мутантні рослини були перенесені в окремі та напіввідкриті чашки Петрі, що містили таку саму кількість 15 личинок S-старок P. xylostella. Подальші кроки були виконані, як описано раніше (Chen та ін., 2021).

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

2.3|Скринінг резистентних мутантів Arabidopsis проти P. xylostella

Ми зібрали 179 інсерційних мутантів Т-ДНК Arabidopsis для скринінгу резистентності P. xylostalle. Мутанти вирощували на середовищі MS і пересаджували в горщики P7 (розмір: 7 × 7 см) в умовах тривалого росту (22 градуси, 16 годин світла/8 годин темряви). Щоб уникнути потенційного впливу навколишнього середовища, ми щодня переміщували та змінювали горщики. Для початкового скринінгу мутантів ми створили дві повторності, вирощуючи кожен мутант у двох горщиках, з рослинами Col-0 як контролем. Після 2 тижнів росту після трансплантації всі мутанти були піддані тесту переваги личинок P. xylostella третьої стадії, порівнюючи їх з Col-0, як описано вище. Мутанти, які показали відмінні від Col-0 переваги личинок, розглядалися як стійкі до кандидатів або чутливі мутанти та були відібрані для подальшої експериментальної перевірки та функціональних досліджень.

2.4|Побудова плазміди та трансформація гена

Для конструкції RPX1pro: RPX1 ділянку генома RPX1 з послідовністю 1,6 кб вгорі та послідовністю вниз по течії 1,6 кб було ампліфіковано методом ПЛР із геномної ДНК, виділеної з Col-0. Зібраний фрагмент ДНК клонували у вектор pGreenII-0179 і трансформували в мутант rpx1-1 за допомогою методу квіткового занурення (Clough & Bent, 1998). Для конструювання RPX1pro: RPX1-GFP, промотор RPX1 (1,6 кб), кодуюча область і 1 кб 3' нетрансльовані послідовності були ампліфіковані методом ПЛР з геномної ДНК Col-0. Фрагмент GFP ампліфікували з плазміди, що містить послідовності GFP. Ці фрагменти ДНК зібрали у вектор pGreenII-0179 за допомогою методу розрізання та лігування, а потім трансформували в мутант rpx1-1. Для конструкції 35Spro: RPX1-FLAG кодуючі послідовності RPX1 були ампліфіковані за допомогою ПЛР із зворотної транскрипції кДНК з мРНК Col-0. ПЛР-фрагмент клонували у вектор pCambia1300-FLAG за допомогою методу інфузії (Clontech) і трансформували в Col-0. 35Spro: PEN1, 35Spro: MRN1 (MARNERAL SYNTHASE 1) і 35Spro: THAS (THALIANA THALIANOL SYNTHASE 1): кодуючі послідовності цих генів були ампліфіковані методом ПЛР з кДНК Col-0 і ліговані у вектор pLGNL-35S. Штучна мікроРНК (amiR), націлена на PEN1, була розроблена, як описано раніше (Schwab et al., 2006), ампліфікована з використанням плазміди pRS300 як матриці та лігована в модифіковану версію вектора pCambia1300m. Усі послідовності праймерів наведено в Додатковій інформації: Таблиця S1.

2,5|Дослідження активності глутатіон-s-трансферази (GST) і цитохрому P450 (CYP450) у личинках P. xylostella

Після того, як личинки другого віку P. xylostella годували проростками Col-0 або rpx1-1 протягом 72 годин, їх збирали та подрібнювали до дрібного порошку в рідкому азоті. Аналізи проводили з використанням GST (Nanjing Jiancheng Biology Company, кат.: A004) і наборів для аналізу активності CYP450 (Beijing Huabaitai Biology Company, кат.: P450), відповідно до інструкцій виробника. Кожен аналіз мав три біологічні репліки, і кожна репліка включала 30 личинок P. xylostella.

2.6|Аналізи Smurf

Тритижневі сіянці Col-0 або rpx1-1 використовували для годування личинок P. xylostella другого віку. Аналіз проводили, як описано раніше, з незначними модифікаціями (Chen та ін., 2021). Було використано шість біологічних повторень, і кожна повторність містила 15 личинок P. xylostella.

2.7|Мікроскопічне спостереження будови ПМ личинок

Анатомічний аналіз структури личинкових ПМ та парафіновий аналіз поперечного зрізу личинкового кишечнику проводили, як описано раніше (Chen et al., 2021).

2.8|Аналіз експресії генів і секвенування транскриптомів (RNA-seq)

Сіянці Col-{{0}} і rpx1-1 вирощували в умовах тривалого росту (16 годин світла, 8 годин темряви) при 22 градусах. Двотижневі проростки Col-0 і rpx1-1 використовували для секвенування транскриптомів. Кожен зразок містив три біологічні повтори. Загальну РНК екстрагували за допомогою набору RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN, каталожний номер: DP441). Перші ланцюги кДНК були синтезовані шляхом зворотної транскрипції з використанням системи One-Step RT (Takara Bio) відповідно до інструкцій виробника. QRT-PCR проводили з використанням ген-специфічних праймерів, перелічених у Додатковій інформації: таблиця S1, на приладі Roche Light Cycler 480. Конструювання та секвенування бібліотек RNA-seq проводили за допомогою Biomarker (Пекін, Китай) на платформі Illumina HiSeq. Нарешті, ми використали edgeR для виконання диференціального аналізу експресії (було встановлено поріг значущої різниці:|log2foldchange|Більше або дорівнює 1, p < 0,05). Було проведено три біологічні репліки для Col-0 і rpx1-1, і диференційовано експресовані гени перераховані в наборі даних S1.

2.9|Аналіз екстракції та газової хроматографії та мас-спектрометрії (ГХ-МС) DMNT і DMNT-2H в Arabidopsis

Екстракцію та аналіз DMNT проводили, як описано раніше, з незначними модифікаціями (Sohrabi та ін., 2015). В аналізах 2 г 3-тижневих саджанців арабідопсису використовували для екстракції та вимірювання DMNT.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.10|Приготування та характеристика ДМНТ

DMNT був синтезований, як описано раніше, з незначними модифікаціями (HJ Huang & Yang, 2007). Коротко кажучи, у круглодонну колбу на 500 мл, оснащену магнітною мішалкою з тефлоновим покриттям, завантажили 1 г (6,48 ммоль) аллілового спирту та 50 мл дихлорметану. Розчин інтенсивно перемішували і обробляли 3,6 г активного діоксиду марганцю з наступним додаванням 1-2 г окислювача кожні 2-3 год до завершення реакції. Потім продукт використовували для отримання бажаної сполуки за допомогою реакції виттингу. Структуру та чистоту DMNT було підтверджено за допомогою 1 H ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і 13C ЯМР спектроскопії.

2.11|DMNT лікування P. xylostella

Дослідження проводили в чашках Петрі, покритих прозорою пластиковою плівкою з кількома отворами. DMNT розводили в парафіновій олії (Sigma-Aldrich) до бажаної дози (2,5 нмоль/л-25 мкмоль/л) і вводили в корм, як описано в тексті. Усі аналізи проводили в шести біологічних повторах, причому кожна повторність складалася з 15 личинок. Зростання личинок було зафіксовано за допомогою фотодокументації. Корм, якому вводили такий самий об’єм розчинника парафінового масла, використовувався як контроль.

2.12|Вимірювання вмісту ЖК та СК у проростках арабідопсису

Аналіз проводила Nanjing Convinced-test Technology Company. Двотижневі сіянці Col-{{0}} і rpx1-1 були заражені 15 личинками s-старочок P. xylostella, з неінфікованими сіянцями як контролем. Ми помістили дві личинки на кожну рослину групи зараження, щоб переконатися, що всі рослини були заражені. Через 24 години зразки рослин збирали та швидко заморожували в рідкому азоті для визначення JA та SA. Зразки подрібнювали до тонкого порошку в рідкому азоті та екстрагували екстракційним розчином ізопропанол-вода-соляна кислота з подальшим додаванням 8 мкл дейтерованої саліцилової кислоти (D-SA) і дигідрожасмонової кислоти (2HJA) (1 мкг). /мл кожного) як внутрішні стандарти. Потім додавали дихлорметан і розчин добре перемішували на ротаторі протягом 30 хв. Після того, як нижню органічну фазу було отримано центрифугуванням при 13,{{1{{20}}} об/хв протягом 5 хв, її продули азотом і повторно розчинили в метанолі (0 .1% мурашиної кислоти), а потім центрифугували при 13,000 g протягом 10 хв. Нарешті, супернатант фільтрували через мембрану органічного фільтра 0,22 мкм і аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії в поєднанні з мас-спектрометрією (HPLC-MS/MS). Усі етапи екстракції проводили при 4 градусах. Ідентичність JA і SA визначали на основі часу піку цільових речовин і співвідношення маси до заряду (m/z) відповідних іонів. Кількісне визначення JA та SA було встановлено за допомогою рівняння лінійної регресії, отриманого з кривих внутрішнього стандарту. Для отримання кривої внутрішнього стандарту готували стандартні розчини SA і JA з градієнтами 0,1, 0,2, 0,5, 2, 5, 20, 50 і 200 нг/мл, використовуючи метанол (0,1% мурашина кислота) як розчинник, і розчини внутрішнього стандарту з кінцевою концентрацією 20 нг/мл додавали до фактичної ділянки. Аномалії лінійності були видалені з рівнянь стандартних кривих. JA: y=0.853 x + 0.00152 (r=0.9958); SA: y=1.76 x + 0.0403 (r=0.9936).

2.13|Аналіз транспортування DMNT у Arabidopsis

DMNT розчиняли в DMSO і додавали до середовища MS без глюкози. Тритижневі рослини Arabidopsis переносили в пробірки, а їх коріння занурювали в середовище MS з DMNT або DMSO (контроль). Для запобігання контамінації пробірки покривали двома шарами парафільму, а в плівці робили невеликий отвір, через який коріння рослин поміщали в середовище MS для подальшого росту. Через 24 години коріння оброблених рослин видаляли, а листя використовували для живлення P. xylostella, а потім аналізували виживаність личинок і швидкість окукливания. Той самий експеримент повторювали з ростовим середовищем, що містило або 2H-мічений DMNT, або DMSO як контроль. Після 24 годин інкубації листя збирали та обробляли для аналізу ГХ-МС. Щоб виключити можливість випаровування DMNT із середовища DMNT до надземних частин і спричинити відстеження забруднення, контрольну групу було створено таким же чином, але коріння рослини засипали вологою ватою, а не занурювали в середовище DMNT. Через 24 години надземні частини збирали для подальшого біоаналізу або виявлення DMNT за допомогою ГХ-МС.

Переваги Cistanche tubulosa- зміцнити імунну систему

2.14|Екстракція білка та аналіз імуноблотінгу RPX1 у Arabidopsis після інвазії P. xylostella та лікування ран

Ми встановили два типи обробки трансгенних RPX1pro: RPX1-GFP і 35Spro: RPX1-FLAG саджанці арабідопсису: зараження та поранення P. xylostella. Для зараження личинками ми вирощували сіянці Arabidopsis протягом 2 тижнів і годували їх личинками другої стадії (помістили принаймні одну личинку на кожну сіянку), через 15-120 хвилин личинки видаляли, а заражені сіянці відбирали та збирали для подальші експерименти. Щоб імітувати поранення, ми використовували голку шприца на 1 мл, щоб створити отвір у кожному листі Arabidopsis. Через 15–120 хв росту сходи збирали.

Щоб визначити, чи можуть інфіковані P. xylostella рослини індукувати деградацію RPX1, ми інфікували Col-0 розсаду P. xylostella протягом 15−120 хв і перевірили його вплив на RPX1-GFP у трансгенних рослинах. Усі зразки подрібнювали в порошок у рідкому азоті, а потім однакові кількості інфікованих і неінфікованих Col-0 окремо змішували з такою ж кількістю тканин RPX1-GFP та інкубували в розчині при 4 градусах протягом 15 хвилин. Нарешті, суміш центрифугували, а супернатант піддавали імуноблоттингу. Для вестерн-блот-аналізу загальні білки екстрагували буфером для екстракції білків [50 ммоль/л Трис-HCl pH8,0, 2,5 ммоль/л EDTA pH8,0, 150 ммоль/л NaCl, 1/1000 IGPAL ( об’єм/об’єм), 10% гліцерину (об’єм/об’єм), 7% 2-меркаптоетанол (об’єм/об’єм), 1 ммоль/л PMSF і 1×коктейль інгібіторів протеїнази (Roche)]. Потім білковий екстракт використовували для розділення в PAGE та аналізу імуноблоттингу з антитілами проти GFP (Roche, розведення: 1/1000) і FLAG (Abcam, розведення: 1/2000). Зображення були отримані за допомогою системи хемілюмінесцентного аналізу Tanon 5200.

3|РЕЗУЛЬТАТИ

3.1|Мутант Arabidopsis rpx1 має покращену стійкість до P. xylostella

Щоб ідентифікувати гени, залучені до стійкості P. xylostella, ми зібрали 179 мутантів Arabidopsis і вирощували їх у контрольованій теплиці. Через два тижні після трансплантації ми провели тест на перевагу личинок P. xylostella третьої стадії у відповідь на кожен мутант і Col-0 дикого типу. У цьому скринінговому експерименті 15 мутантів показали різний вплив на перевагу личинок (дані не показані), і один з них був обраний для цього дослідження та позначений як rpx1-1 (стійкість до P. xylostella). RPX1 кодує новий кеп-зв’язуючий білок (nCBP) (Ruud та ін., 1998). Мутантом із вставкою Т-ДНК був SALK_131503, і експресія гена RPX1 була значно знижена порівняно з Col-0 дикого типу (Малюнок 1a, Додаткова інформація: Малюнок S1a, Додаткова інформація: Таблиця S1). При посадці поблизу рослини rpx1-1 продемонстрували значно нижчий рівень пошкодження личинками P.xylostella порівняно з рослинами дикого типу (додаткова інформація: малюнок S1b).

МАЛЮНОК 1. Інактивація RPX1 надає арабідопсису стійкість до Plutella xylostella. (a) Структура гена RPX1 (At5g18110). Помаранчеві рамки позначають екзони, а суцільні лінії представляють інтрони та нетрансльовані області. Вставка Т-ДНК у SALK_131503, названа rpx1-1, знаходиться на четвертому екзоні. (b) Личинки P. xylostella переважно рухаються до ліній комплементації Col-0 дикого типу та RPX1 (RPX1pro:RPX1/rpx1-1, RPX1com), порівняно з rpx1-1. (c) Порівняння Col- 0, rpx1-1 і RPX1com листя, заражені P. xylostella. (d) Личинки P. xylostella були серйозно уражені rpx1-1, порівняно з тими на дикому типі Col-0 і лініях RPX1com, щодо росту, розміру та кольору личинок. (e, f) Личинки P. xylostella, яких годували rpx1-1, демонструють вищу смертність (e) і нижчий рівень окукливання (f) порівняно з лініями Col-0 і RPX1com дикого типу. (g, h) Личинки P. xylostella, яких годували рослинами rpx1-1, мали підвищену активність глутатіон-S-трансферази (GST, g) і цитохрому P450 (CYP450, h), тоді як у личинок, яких годували RPX1com, активності не відрізнялися від цих на Кол-0. У (b, e–h) дані представлені як середнє значення ± sem. Різні літери в кожній обробці вказують на суттєву різницю (односторонній дисперсійний аналіз, n=3 для b, g, h, n {{ 36}} для e, f).

Щоб визначити механізм, що лежить в основі резистентності rpx1-1 до інвазії P. xylostella, ми провели тести переваги та відсутності вибору. У експериментах із перевагою личинки P. xylostella поміщали в центр скляної пробірки на однаковій відстані від проростків Col‐0 та rpx1‐1 через 10–6{{11} } min, значно більше личинок зібралося на стороні Col‐0, ніж на стороні rpx1‐1 (рис. 1b). У експериментах без вибору ми годували сіянці Col-0 і rpx1-1 окремо для личинок P. xylostella і спостерігали, що Col-0 втратив більше тканин листя, ніж мутант rpx1-1 (рис. 1c). Щоб підтвердити, що RPX1 був причинним геном для спостережуваної стійкості, ми ввели комплементаційну конструкцію RPX1 у мутант rpx1-1. Ці лінії комплементації RPX1 (RPX1pro: RPX1/rpx1-1, RPX1com) були сприйнятливі до інвазії P. xylostella, як визначено тестами переваги та відсутності вибору (рис. 1b,c), які припускають, що RPX1 бере участь у стійкості Arabidopsis до P. xylostella.

3.2|На ріст личинок P. xylostella негативно впливає мутація rpx1-1

Щоб дослідити фізіологічну реакцію P. xylostella на годування мутантами rpx1-1, ми перевірили розвиток личинок після годування 3-тижневими рослинами ліній Col-0, rpx1-1 і RPX1com. Личинки, яких годували рослинами rpx1-1, показали серйозні порушення розвитку з точки зору розміру тіла. Колір тіла личинок також відрізнявся від кольору личинок, яких годували рослинами Col‐0. Однак ми не спостерігали таких змін у личинок, яких годували розсадою RPX1com (рис. 1d). Подальший фенотиповий аналіз показав, що личинки P. xylostella, яких годували rpx1-1, мали помітно вищу смертність і нижчі показники окукливания, ніж ті, яких годували Col-0 або RPX1com (рис. 1e,f). Крім того, личинки, яких годували rpx1-1, демонстрували вищу ферментативну активність GST і CYP450, які є біомаркерами пошкодження органів або тканин (Cheng et al., 2018; Mikstacki et al., 2015), ніж личинки на Col-0 і RPX1com (рис. 1g,h), що свідчить про те, що тканина личинки може бути пошкоджена під час живлення rpx1-1.

3.3|Середня кишка личинок P. xylostella пошкоджена після живлення рослинами rpx1-1

Ми спостерігали, що личинки, яких годували rpx1-1, споживали менше рослинних тканин і виробляли набагато менше фекалій, ніж ті, яких годували Col-0 дикого типу; отже, ми припустили, що це може вплинути на травлення личинок, яких годували rpx1-1. Щоб перевірити, чи стався витік у кишечнику личинок, яких годували rpx1-1, ми провели «тест Smurf». Личинки, яких годували лініями Col-0 та RPX1com дикого типу, випорожнювали барвник, і барвник візуально не залишався в тілі личинок, тоді як личинки, яких годували rpx1-1, зберігали значну кількість барвника в тілі личинок. середня кишка та навколишні тканини, а личинки стали синіми (рис. 2а). Кількісний аналіз синіх («Смурф») і нормальних («без Смурфа») личинок показав, що згодовування рослин rpx1-1 призвело до більш ніж утричі особин, які виявляли «Смурфа» порівняно з тими, яких годували диким типом Col-{{ 14}} або RPX1com (рис. 2b). Ці результати свідчать про те, що годування rpx1-1 може спричинити ураження та більшу проникність у середній кишці личинок.

3.4|Перитрофічний матрикс P. xylostella пошкоджується живленням проростків rpx1-1

Далі ми розібрали та виділили перитрофічний матрикс (PM) з личинок, яких годували проростками Col-{{0}}, rpx1-1 і RPX1com для структурного аналізу під стереомікроскопом. Порівняно з інтактним і товстим PM личинок, яких годували Col-0 і RPX1com, личинки, яких годували rpx1-1, демонстрували характеристики пошкодження та були тонкими, пухкими та переривчастими (рис. 2c–f). Для подальшого підтвердження характеристик пошкодження PM, ми отримали поперечні зрізи зразків личинок. Результати фарбування гематоксилін-еозином (HE) показали, що PM личинок, яких годували Col-0, був товстим і неушкодженим, і що існував ектоперитрофічний простір (ES) між PM і клітинами епідермісу середньої кишки (рис. 2g). Навпаки, PM у середній кишці личинок, яких годували rpx1-1, був серйозно порушений, і кишковий вміст був близько до кишкової стінки (ні, рис. 2h). Коли личинок годували проростками RPX1com, їх PM та ES суттєво не змінювалися (рис. 2i,j). Ці результати підтверджують, що нокдаун RPX1 завдає шкоди PM личинок P. xylostella.

3,5|Накопичення вмісту DMNT в rpx1-1 надає стійкість до личинок P. xylostella

Щоб дослідити, чи нокдаун RPX1 змінює форму метаболітів Arabidopsis і призводить до резистентності до личинок P. xylostella, ми порівняли леткі органічні сполуки (ЛОС), що виділяються з рослин rpx1-1 і Col-0 дикого типу. Чотири ЛОС (гексанол, 3-етил-5-метил, октанс, 2,6-диметил, нонан, 2,6-диметил і DMNT) накопичувалися по-різному між rpx1-1 і Col-0 (рис. 3a). Для подальшого аналізу молекулярного механізму rpx1-1 у резистентності P. xylostella ми провели аналіз РНК-seq. Порівняно з Col-0, мутант rpx1-1 демонстрував 211 диференціально експресованих генів (DEG) (Додаткова інформація: набір даних S1). Аналіз збагачення KEGG показав, що ці DEG належать до більш ніж 20 різних метаболічних шляхів, включаючи біосинтез сесквітерпеноїдів і тритерпеноїдів, метаболізм альфа-ліноленової кислоти та шляхи метаболізму тирозину (Малюнок 3b, Додаткова інформація: Таблиця S2). Примітно, що найбільш значно збагаченим шляхом був біосинтез сесквітерпеноїдів і тритерпеноїдів, який складався з трьох DEG: At4g15340, At5g42600 і At5g48010 (рис. 3b, додаткова інформація: рис. S2a–c). Повідомлялося, що at4g15340 кодує PEN1, оксидоскваленциклазу, яка перетворює 2,3-оксидосквален в арабідіол і призводить до синтезу біоактивного DMNT через CYP705A1 (Field & Osbourn, 2008; Sohrabi et al., 2015). At5g42600 кодує мінеральну синтазу 1 (MRN1), яка є ключовим компонентом у біосинтезі мінералів. At5g48010 кодує таліанолсинтазу (THAS), фермент, який бере участь у біосинтезі таліанолу. Повідомлялося, що марнерал і таліанол беруть участь у підтримці розвитку рослин (Field & Osbourn, 2008; Go et al., 2012) (Додаткова інформація: малюнок S3). Ми вивчали потенційну роль MRN1 і THAS у стійкості до комах, досліджуючи перевагу, смертність і рівень окукливания P. xylostella, годуючи їх трансгенними саджанцями Arabidopsis з надмірною експресією MRN1 (35Spro: MRN1) і THAS (35Spro: THAS) (підтримка Інформація: малюнок S4a,b). Не було виявлено суттєвої різниці між двома трансгенами та Col-0 дикого типу (додаткова інформація: малюнок S4c–n), що свідчить про те, що стійкість rpx1-1 до комах навряд чи залежить від цих двох генів.

МАЛЮНОК 2. Інактивація RPX1 пошкоджує структуру перитрофічного матриксу (ПМ) у середній кишці личинок. (a) Репрезентативні зображення личинок, яких годували лініями Col-0, rpx1-1 і RPX1com, які демонструють утримання барвника, про що свідчить їх блакитний вигляд, як персонаж мультфільму Смурф. (b) Кількісна оцінка результатів показана в (a). Дані представлені як середнє ± sem; різні букви вказують на суттєву різницю (односторонній дисперсійний аналіз, n=6). (c–f) Ультраструктура ПМ личинок, яких годували лініями Col‐0 (c), rpx1‐1 (d) і RPX1com (e, f). Зауважте, що PM личинок, яких годували Col-0 і RPX1com, пухкий і неушкоджений, але PM личинок, яких годували rpx1-1, тонкий, делікатний і непостійний у деяких регіонах. (g–j) Поперечний зріз і фарбування гематоксиліном-еозином показують пошкодження ПМ від личинок, яких годували лініями Col-0 (g), rpx1-1 (h) або RPX1com (i, j). [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

Збагачення біосинтезу терпеноїдів в аналізі KEGG (рис. 3b) і диференціальне накопичення DMNT, виявлене в rpx1-1 (рис. 3a), припускають, що DMNT може бути однією зі сполук, залучених до стійкості рослин до P. xylostella. Подібно до попередніх повідомлень, у яких DMNT майже не було виявлено за допомогою аналізу ГХ-МС у Кол-0 (Лю та ін., 2018; Сохрабі та ін., 2015), ми могли виявити сліди DMNT у неінфікованих Col-0 (рис. 4a,b). Навпаки, рівні DMNT були високо збагачені (~8 нг/г) у rpx1-1, а лінії RPX1com показали дуже низькі рівні DMNT, подібні до таких у рослинах Col-0 (рис. 4). Крім того, після інвазії P. xylostella рівні DMNT зросли (~20 нг/г) у rpx1-1, що було вище, ніж у лініях Col-0 і RPX1com (рис. 4). . Ми синтезували DMNT in vitro за допомогою модифікованого методу (Chen та ін., 2021). Згідно з попередніми спостереженнями (Chen et al., 2021), DMNT пригнічував ріст P. xylostella, про що свідчать показники переваги (2,5 мкмоль/л) і відсутності вибору (0,25–25 мкмоль/л) ( Додаткова інформація: малюнок S5a,b). Крім того, результати фарбування HE показали, що PM контрольних личинок був товстим і неушкодженим (Додаткова інформація: малюнок S5c), тоді як PM личинок, оброблених 2,5 мкмоль/л DMNT протягом 48 годин, був тонким і непостійним у деяких регіонах (Додаткова інформація: Малюнок S5d). У сукупності наші результати свідчать про те, що мутація rpx1-1 спричиняє накопичення DMNT, що сприяє знищенню личинок P. xylostella в Arabidopsis. JA та SA є вторинними метаболітами рослин, які тісно пов’язані з біотичним стресом. Щоб визначити, чи сприяють ці речовини стійкості rpx1-1 до комах, ми перевірили рівні JA і SA Col-0 і rpx1-1 до і після зараження P. xylostella. У необроблених умовах не було істотної різниці в рівнях JA і SA між рослинами rpx1-1 і Col-0 (додаткова інформація: малюнок S6), і рівні обох гормонів значно підвищилися через 24 години після зараження P. xylostella . Примітно, що після зараження вміст SA був значно нижчим у rpx1-1 порівняно з Col-0, тоді як вміст JA був набагато вищим у rpx1-1, ніж у Col-0 (додаткова інформація: малюнок S6).

МАЛЮНОК 3 Порівняння летких сполук і експресії генів, диференційовано збагаченої між Col-0 і rpx1-1. (a) Диференційно збагачені леткі сполуки в Col-0 і rpx1-1 були виявлені методом газової хромато-мас-спектрометрії (GC-MS). Дані представлені як середнє ± sem; зірочки вказують на суттєву різницю (*p < 0.05, **p < 0.01, двобічний непарний t-критерій). (b) Транскриптомний аналіз Col-0 і rpx1-1. Аналіз KEGG збагачення шляху генами з різною експресією між Col-0 і мутантом rpx1-1. Один збагачений шлях (червона стрілка) пов’язаний із біосинтезом сесквітерпеноїдів і тритерпеноїдів і складається з трьох генів, як показано на малюнку. [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

3.6|RPX1 регулює накопичення DMNT в залежності від PEN1

Щоб дослідити внесок PEN1 у регульоване rpx1-1 накопичення DMNT, ми створили конструкцію, що містить штучну мікроРНК (PEN1amiR), і трансформували її в мутанти rpx1-1. Ми також згенерували конструкцію надекспресії PEN1, яку було перетворено на Col-0 (35pro: PEN1/Col-{{10}}). Аналіз експресії генів показав, що PEN1 був збитий (у 4-7 разів) у PEN1amiR/rpx1-1 порівняно з rpx1-1, і був надмірно експресований (приблизно в 2,5 рази) у 35Spro: PEN1 порівняно з Col-0 (Малюнок 5а). У цих трансгенних лініях експресія RPX1 не зазнавала впливу нокдауну або надмірної експресії PEN1 (рис. 5b). При інвазії P. xylostella протягом 6-24 годин експресія PEN1 була значно підвищена в Col-0 і rpx1-1, і значно більша експресія PEN1 була досягнута в rpx1-1 через 24 години інвазії (рис. 5c). . Далі ми виміряли вміст DMNT у Col-0, rpx1-1, PEN1amiR/rpx1-1 і 35Spro: PEN1/Col-{{50}}. Без інвазії P. xylostella rpx1-1 виробляв вищі рівні DMNT, ніж Col-0 (рис. 5d,e,f,k,l), а коли PEN1 був збитий штучною мікроРНК у rpx1-1 (PEN1amiR /rpx1-1), рівні DMNT були знижені, демонструючи набагато нижчий рівень, ніж у rpx1-1 (рис. 5d, g, h, m, n). Після інвазії личинок рівні DMNT у проростках Col-0 та rpx1-1 були значно підвищені, але в проростках PEN1amiR/rpx1-1 рівень DMNT не міг бути індукований і був набагато нижчим, ніж у rpx1-1 (рис. 5d, g,h,m,n), що свідчить про те, що PEN1 може відігравати важливу роль у регульованому RPX1 біосинтезі DMNT, як показано в додатковій інформації: малюнок S3. Відповідно до цього, DMNT накопичувався в значній мірі в сіянцях 35Spro: PEN1/Col-0 (Рис. 5d, i,j,o,p).

МАЛЮНОК 4 Втрата RPX1 збільшує накопичення диметил-1,3,7-нонатрієну (DMNT). (a) газова хромато-мас-спектрометрія (ГХ-МС) аналіз DMNT у лініях Col-0, rpx1-1 і RPX1com (RPX1pro:RPX1/rpx1-1). Стандарт DMNT показано внизу. (b) Загальна іонна хроматографія (TIC) DMNT, отриманого з Col-0, rpx1-1 і RPX1com. (c) Вміст DMNT збільшується в мутанті rpx1-1, але повертається до рівнів дикого типу в трансгенних рослинах RPX1com. Дані представлені як середнє ± sem; різні літери вказують на суттєву різницю (односторонній дисперсійний аналіз, n=3). [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

3.7|PEN1 сприяє знищенню P. xylostella в rpx1-1

Враховуючи спостереження, що нокдаун PEN1 може послабити накопичення DMNT, викликане інактивацією RPX1 (рис. 5), ми провели біологічні аналізи нокдауну PEN1 і трансгенного Arabidopsis з надмірною експресією, щоб продемонструвати його біологічну роль. Ми виявили, що личинки P. xylostella не віддають перевагу рослинам amiR-PEN1/rpx1-1 порівняно з Col-0 (додаткова інформація: малюнок S7). Тим часом, личинки P. xylostella, яких годували PEN1-amiR/rpx1-1, показали значно нижчу смертність і вищі показники окукливания, ніж rpx1-1, тоді як личинки, яких годували 35Spro: PEN1/Col-0, показали вищу смертність і нижчу окукливание. порівняно з тими, хто отримував Col-0 (рис. 6a,b). У відповідності з цими результатами подальші експерименти зі «Смурфом» і трансекцією показали, що PEN1-amiR/rpx1-1 мав нормальний і неушкоджений кишечник і PM порівняно з личинками, яких годували rpx1-1 (рис. 6c, d, g, h), і надмірна експресія PEN1 спричинила серйозне пошкодження середньої кишки та PM личинок P. xylostella (рис. 6c, d, i, j). Ці результати свідчать про те, що нокдаун PEN1 може пригнічувати негативний вплив на ріст личинок, спричинений інактивацією RPX1, таким чином відіграючи важливу роль у токсичному впливі, викликаному rpx1-1-, на личинки P. xylostella.

3.8|DMNT транспортує від коренів до надземних частин Arabidopsis 

Повідомляється, що PEN1 в основному експресується в коренях Arabidopsis (AC Huang et al., 2019; Sohrabi et al., 2015) (Додаткова інформація: малюнок S8a), що відрізняється від результатів, які показали надземні частини rpx1-1. токсичність для P. xylostella залежно від PEN1 (рис. 6). Тому ми сформулювали альтернативну гіпотезу: рослини синтезують DMNT переважно в коренях і транспортують його в надземні частини, де він сприяє стійкості до комах. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми провели два аналізи транспортування DMNT. У першому аналізі (рис. 7а) ми інкубували коріння 3-3-тижневих саджанців арабідопсису в рідкому середовищі для росту рослин, що містить 2,5 мкмоль/л DMNT, використовуючи ДМСО як контроль. Після 24-годинного культивування ми вирізали листя Arabidopsis і пропонували їх личинкам P. xylostella. Порівняно з контролем DMSO, листя рослин, оброблених DMNT, спричиняло значно вищу смертність личинок і нижчу швидкість окукливания, ніж контроль (рис. 7b,c). У другому експерименті, спрямованому на подальше незалежне підтвердження транспорту DMNT, ми помітили DMNT 2 H і додали DMNT‐ 2 H до рідкого середовища росту рослин. Після 24 годин інкубації DMNT-2H було значно збагачене в листках (рис. 7d–i). Щоб виключити можливість того, що DMNT може випаровуватися з рідкого середовища росту в повітря та забруднювати надземні частини рослин, ми встановили паралельний контроль, який проводився так само, як на малюнку 7а, за винятком того, що коріння арабідопсису не занурювали в рідину. середовище росту. Результати показали, що DMNT‐ 2 H не було виявлено в надземних частинах рослин (Додаткова інформація: малюнок S8b,c). Таким чином, ми припускаємо, що DMNT переміщується від коренів, де він виробляється, до листя Arabidopsis, де він викликає загибель шкідників.

МАЛЮНОК 5 PEN1 відіграє важливу роль у накопиченні диметил-1,3,7-нонатрієну (DMNT) у rpx1-1. (a) Аналіз експресії PEN1 у Col-0, rpx1-1, нокдаун PEN1 у фоновому режимі rpx1-1 (PEN1-amiR/rpx1-1) і надмірна експресія PEN1 (35Spro:PEN1/Col-{{2{{ 22}}}}) рядків. (b) Експресія RPX1 у Col-{{30}}, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 і 35Spro:PEN1/Col-0. (c) Експресія PEN1 індукується інвазією Plutella xylostella в Col-0 і rpx1-1. (d) Порівняння накопичення DMNT між Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 і 35Spro:PEN1/Col-0. (e–j) газова хромато-мас-спектрометрія (GC-MS) аналіз летких речовин, що виділяються з Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) і 35Spro: рядки PEN1/ Col-0 (i, j). (k–p) TIC DMNT, отриманий із ліній Col‐0 (k), rpx1‐1 (l), PEN1‐amiR/rpx1‐1 (m, n) і 35Spro: PEN1/Col‐0 (o, p) , що відповідає даним у (e–j). У (a–d) дані представлені як середнє ± sem; різні літери вказують на суттєву різницю (односторонній дисперсійний аналіз, n=3). [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

3.9|RPX1 руйнується інвазією P. xylostella та лікуванням ран

Ми показали, що експресія PEN1 посилюється в rpx1-1 і саджанцях Arabidopsis, заражених личинками P. xylostella (рис. 5a,c), що підвищує ймовірність того, що RPX1 також може реагувати на зараження личинками. Щоб підтвердити цей прогноз, ми дослідили потенційну реакцію RPX1 на інвазію P. xylostella. Аналіз експресії генів показав, що RPX1 експресувався в різних тканинах (Додаткова інформація: Малюнок S9a), але не мав значної реакції на інвазію личинок протягом 6–24 годин (Додаткова інформація: Малюнок S9b). Тому ми перевірили рівні білка RPX1 у трансгенних рослинах RPX1pro: RPX1-GFP шляхом імуноблоттингу. Результати показали, що без зараження личинками RPX1-GFP був стабільним протягом 0-12{{40}} хв; навпаки, після інвазії личинками протягом 15 хвилин RPX1-GFP почав деградувати; через 120 хвилин білок RPX1-GFP безперервно знижувався приблизно до 6% початкової точки часу (Малюнок 8a, Додаткова інформація: Малюнок S10a). Як контроль, у саджанців Arabidopsis, що містять трансген GFP, GFP був відносно стабільним після зараження личинками (рис. 8b). Щоб виключити можливий вплив мітки GFP на стабільність RPX1, ми створили трансгенні рослини RPX1 з міткою FLAG (35Spro: RPX1-FLAG) для проведення експериментів з інвазією личинок, які показали послідовні результати того, що RPX1-FLAG також може бути деградовано личинками зараження, подібне до RPX1-GFP (рис. 8c). Зараження комахами часто спричиняє поранення рослин, а фізичні пошкодження можуть частково імітувати процес живлення рослиноїдних комах. Щоб продемонструвати, чи може поранення спричинити деградацію RPX1, ми використали голку для створення отворів у листі рослин, щоб імітувати поранення, і виявили, що RPX1-GFP деградував після 30 хв лікування (Малюнок 8d, Додаткова інформація: Малюнок S10b). Щоб краще зрозуміти причину деградації RPX1 під час зараження P. xylostella, ми інкубували тканини трансгенних рослин RPX1-GFP разом у розчині протягом 15 хвилин із тканинами Col-0, які були заражені P. xylostella протягом 15–120 хвилин. , або тканини Col-0 без інвазії. Аналіз імуноблотингу показав, що рівень RPX1-GFP у зразках, інкубованих із попередньо інфікованим Col-0, був набагато нижчим, ніж у зразках із неінфікованим Col-0 (рис. 8e), що свідчить про те, що інвазія P. xylostella викликала деякі фактори чи сигнали в Col-0 що може призвести до деградації RPX1.

3.10|Мутація rpx1-1 дає перевагу в розвитку та розмноженні рослин

Загальною рисою захисних реакцій травоїдних тварин є компроміс між стійкістю до шкідників і ростом і розмноженням рослин (Li et al., 2018). Щоб визначити, чи підлягає генотип у локусі RPX1 таким компромісам, ми порівняли виробництво насіння в мутантах Col-{{10}} і rpx1-1. За відсутності зараження P. xylostella урожайність насіння з рослини була подібною між двома генотипами (додаткова інформація: малюнок S11). Навпаки, вплив 3-тижневих рослин rpx1-1 і Col-0 на зараження 15 s-старочок P. xylostella лише протягом 72 годин призвело до зниження кінцевого врожаю насіння Col-0 у три рази, тоді як урожайність насіння в rpx1-1 істотно не вплинула. Крім того, урожай насіння RPX1com був подібним до Col-0, але набагато нижчим, ніж у rpx1-1, що свідчить про те, що інактивація RPX1 дає перевагу у виробництві насіння після зараження личинками (додаткова інформація: малюнок S11). Ми також оцінили виробництво насіння в 35Spro: трансгенному Arabidopsis PEN1 і спостерігали, що надмірна експресія PEN1 дала вищий урожай насіння як в умовах зараження личинками, так і в умовах без зараження (додаткова інформація: малюнок S11). Ці результати свідчать про те, що мутація rpx1-1 і більш висока експресія PEN1 надають стійкість до P. xylostella за відсутності типово пов’язаного компромісу зростання, підкреслюючи потенціал RPX1 і PEN1 у програмах молекулярної селекції, спрямованих на покращення виробництва сільськогосподарських культур.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

4|ДИСКУСІЯ

Шкідники різко знижують агрономічні врожаї та якість, що робить захист рослин пріоритетом і довгостроковою метою для фермерів і селекціонерів. У цьому дослідженні ми ідентифікували мутант Arabidopsis rpx1-1, який продемонстрував високу стійкість до P. xylostella, важливого лускокрилого шкідника сільськогосподарських культур. Наш аналіз показав, що мутація rpx1-1 призвела до вищих рівнів транскрипту PEN1, накопичення DMNT і покращила стійкість рослин до шкідників. Ми також показали, що білок RPX1 може бути деградований зараженням личинками та лікуванням ран.

МАЛЮНОК 6 PEN1 сприяє підвищенню стійкості rpx1-1 до Plutella xylostella. (a, b) Трансген PEN1-amiR значно знижує резистентність rpx1-1 до інвазії P. xylostella, тоді як 35Spro: PEN1 підсилює ефект резистентності, як продемонстровано показниками смертності (a) та рівня окукливания (b) личинок P. xylostella . (c) Репрезентативні зображення личинок, яких годували Col-0, rpx1-1, PEN1-amiR/rpx1-1 і 35Spro: саджанці PEN1 демонструють утримання барвника, про що свідчить їх блакитний вигляд, як у мультфільмі про Смурфа характер. (d) Результати кількісного визначення зображень, показаних у (c). (e–j) Поперечний зріз і фарбування гематоксиліном-еозином показують пошкодження ПМ від личинок, яких годували Col-0 (e), rpx1-1 (f), PEN1-amiR/rpx1-1 (g, h) і 35Spro: проростки PEN1 (i, j). Дані представлені як середнє ± sem; різні букви в кожній обробці вказують на суттєву різницю в (a, b, d) (односторонній дисперсійний аналіз, n=6). [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

У тестах без вибору мутант rpx1-1 продемонстрував значну стійкість до інвазії P. xylostella (рис. 1c). І навпаки, личинки P. xylostella, яких годували рослинами rpx1-1, показали серйозні негативні порушення розвитку (рис. 1d,e). Ці фенотипи пов’язані з інактивацією RPX1, оскільки лінії комплементації RPX1 (RPX1com) такі ж сприйнятливі, як Col-0 дикого типу (рис. 1c–e), що підтверджує висновок, що RPX1 бере участь у стійкості шкідників. Окрім знищення личинок, мутант rpx1-1 також мав довготривалий вплив на розвиток личинок, включаючи окукливання (рис. 1f), що призводило до зниження розмноження шкідника.

МАЛЮНОК 7. Диметил-1,3,7-нонатрієн (DMNT) транспортується від коренів Arabidopsis до листя. (a) Ілюстрація аналізу транспортування DMNT з використанням саджанців Arabidopsis. DMNT розчиняли в рідкому середовищі Мурасіге та Скуга. Після 24-годинного культивування коріння вирізали, а листя використовували для годування личинок Plutella xylostella для оцінки смертності та частоти окукливания. (b, c) DMNT, транспортований від коренів до листя, призводить до вищої смертності (b) і нижчого рівня окукливания (c) личинок P. xylostella. (d–f) 2H-мічений DMNT (DMNT-2H) транспортується від кореня до листя. DMNT-2H розчиняли в рідкому середовищі MS, як у (a) протягом 24 годин, а потім листя збирали для аналізу GC-MS (e). ДМСО використовували як контроль (d). Для довідки показано стандарт DMNT‐ 2 H (f). (g–i) TIC DMNT‐ 2 H, отриманий під час аналізів транспортування, показаних у (d–f). Дані представлені як середнє значення ± sem, у (b, c) n=6, p-значення показані поруч зі стовпцями гістограми, щоб вказати на суттєву різницю (двобічний непарний t-критерій). Зауважте, що більше контролів для аналізів транспортування включено в додаткову інформацію: малюнок S8. [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

Крім того, тести на перевагу показали, що мутанти дикого типу Col-{{0}} і rpx1-1 можуть виділяти різні леткі сполуки; одним із них є DMNT, який ефективно відлякує шкідників (рис. 1b, 3a, додаткова інформація: рис. S5a). На основі наведених вище результатів ми припускаємо, що накопичення DMNT в rpx1-1 є однією з причин отруєння комахами. Повідомлялося, що сигнальні шляхи JA та SA беруть участь у резистентності комах (Costarelli та ін., 2020; Lortzing & Steppuhn, 2016). У цьому дослідженні після 24 годин годування комахами вміст JA і SA у мутантів Col-0 і rpx1-1 збільшився, а збільшення вмісту SA в rpx1-1 було значно нижчим, ніж у Col-0, тоді як збільшення вмісту JA було набагато вищим (Додаткова інформація: малюнок S6), що свідчить про те, що JA та SA також можуть відігравати важливу роль у стійкості rpx1-1 до P. xylostella. Тому ми припускаємо, що як прямі, так і непрямі ефекти rpx1-1 сприяють підвищенню стійкості Arabidopsis проти комах.

МАЛЮНОК 8 Деградація білка RPX1 індукується зараженням Plutella xylostella та лікуванням ран. (a) RPX1-GFP з RPX1pro: трансгенні рослини RPX1-GFP деградують під час інвазії P. xylostella протягом 15−120 хв. (b) Як контроль для (a), сам GFP з 35Spro: трансгенні рослини GFP не демонструють деградації після зараження личинками. (c) RPX1-flag з 35Spro: RPX1-flag трансгенні рослини деградують після інвазії личинок. (d) RPX1-GFP з RPX1pro: Трансгенні рослини RPX1-GFP деградують через 15-120 хвилин обробки ран. (e) RPX1-GFP від ​​RPX1pro: трансгенні рослини RPX1-GFP деградують, коли тканини інкубують у розчині з тканинами рослин Col-0, які були заражені P. xylostella протягом 15–120 хв. Значення під смугами імуноблотінгу показують відносну кількість білка, кількісно визначену за допомогою ImageJ. Усі ці експерименти повторювали принаймні три рази, і показано репрезентативні результати. Більше експериментальних даних із незалежними трансгенними лініями наведено в додатковій інформації: малюнок S10. [Кольорову фігуру можна переглянути на wileyonlinelibrary.com]

Ми надаємо кілька доказів того, як PEN{{0}}опосередковане накопичення DMNT сприяє функціям RPX1 у стійкості рослин до P. xylostella. PEN1, ключовий ген, що належить до шляху біосинтезу сесквітерпеноїдів і тритерпеноїдів, був ідентифікований за допомогою аналізу KEGG даних РНК-seq від мутанта rpx1-1 (рис. 3b), що забезпечує зв’язок між RPX1, PEN1 і DMNT (Sohrabi et al. , 2015). На підтримку DMNT як однієї з причинних сполук, які вбивають личинки шкідників, DMNT накопичувався вище в rpx1-1 мутантах, ніж у Col-0 (рис. 3a), але рівень у лініях RPX1com був змінений на Col-0 ( Малюнок 4a–c). Крім того, хімічно синтезований DMNT може відштовхувати та вбивати личинки P. xylostella (додаткова інформація: малюнок S5a,b), що відповідає результатам rpx1-1 (малюнок 1b,e). Крім того, трансгенні рослини з надлишковою експресією PEN1 виробляли більш ніж у чотири рази DMNT у Col-0 і надавали подібну стійкість до P. xylostella, як і rpx1-1 (рис. 5d, i,j,o,p і 6).

Важливо, що зниження рівнів транскрипту PEN1 в rpx1-1 блокує біосинтез DMNT (рис. 5d, g, h, m, n) і пом’якшує ефект знищення личинок P. xylostella, які чутливі до інвазії P. xylostella (рис. 6a, b). ). Ці комбіновані результати показують, що мутація PEN1 може пригнічувати функцію інактивації RPX1 у стійкості до шкідників. Поразка RPX1 спричиняє більшу кількість PEN1 (рис. 5а), однак, як саме RPX1 регулює PEN1 і опосередковує біосинтез DMNT, потребує подальших досліджень. Оскільки RPX1 передбачається як новий кеп-зв’язуючий білок, що належить до родини eIF4E (Rhoads, 2009; Ruud та ін., 1998), можливо, що RPX1 може впливати на PEN1, впливаючи на стабільність його мРНК або ефективність трансляції білка, що буде важливим тема майбутнього вивчення. Крім того, слід зазначити, що рівні DMNT все ще можуть бути індуковані до вищого рівня інвазією P. xylostella у мутанта rpx1-1 (рис. 5d), що свідчить про те, що можуть існувати деякі інші шляхи регулювання накопичення DMNT незалежно від RPX1. DMNT було виявлено в широкому спектрі видів рослин, таких як Arabidopsis (Sohrabi et al., 2015), бавовна (Liu et al., 2018) і кукурудза (Richter et al., 2016). Крім того, він надає непрямий захист від травоїдних шкідників, залучаючи хижаків, дозволяючи рослинам усунути загрози від шкідників (Kappers та ін., 2005; Лі та ін., 2010; Лі та ін., 2018). Нещодавно ми повідомляли, що він може відлякувати та вбивати личинки P. xylostella, пошкоджуючи PM у середній кишці личинок (Chen та ін., 2021). Тут ми виявили, що структура PM може бути серйозно пошкоджена, коли личинки годували rpx1-1 або PEN1, які надлишково експресують розсаду (рис. 2c–j та 6i,j). Ці результати узгоджуються з результатами експериментів з обробки DMNT, які ми описали раніше (Chen et al., 2021), знову підтверджуючи припущення про те, що накопичення DMNT в rpx1-1 може бути одним із факторів, що сприяють відштовхуванню та загибелі шкідників. RPX1 належить до родини генів eIF4E (Rhoads, 2009) і бере участь у міжклітинному русі вірусів рослин (Keima et al., 2017). Проте, чи пов’язане накопичення DMNT із стійкістю до вірусів у рослинах, залишається неясним. PEN1 специфічно експресується в коренях Arabidopsis, де він каталізує біосинтез DMNT (Sohrabi et al., 2015).

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Послідовно в цьому дослідженні ми виявили високу експресію PEN1 в коренях і дуже низьку експресію в листі (додаткова інформація: малюнок S8a). Ми помітили, що листя мутанта rpx1-1 були токсичними для личинок P. xylostella (рис. 1), що свідчить про те, що накопичення DMNT і пов’язану з цим стійкість до шкідників у листі не можна просто пояснити мінімальною експресією PEN1 у цих тканинах. Значно, ми виявили, що DMNT може транспортуватися від коренів рослин до надземних частин, як показано за допомогою аналізів транспортування DMNT та аналізу ГХ-МС екстрактів листя рослин, інкубованих з DMNT-2H на їхніх коренях (рис. 7). Як ця сполука транспортується в рослинах, незрозуміло, і це може бути темою для подальшого дослідження. Рослини мають здатність переносити напади комах і боротися з ними різними способами. Тут, виконуючи імуноблот-аналіз трансгенних рослин RPX1pro: RPX1-GFP і 35Spro: RPX1-FLAG, ми виявили, що після інвазії P. xylostella білок RPX1 може швидко деградувати (Малюнок 8a,c, Додаткова інформація: Малюнок S10a), тоді як , на рівні експресії мРНК RPX1 залишився незмінним (додаткова інформація: малюнок S9b). Наразі те, як білок RPX1 деградує, залишається незрозумілим, але наші дані передусім свідчать про те, що механізм деградації білка може бути залучений до сигнальних шляхів поранення (Малюнок 8d, Додаткова інформація: Малюнок S10b).

Крім того, Col-0, попередньо заражений P. xylostella, індукував деградацію RPX1-GFP у різних рослинах (рис. 8e), що свідчить про те, що зараження P. xylostella може спричинити накопичення сигналів у рослинах, які, у свою чергу, можуть призвести до Деградація RPX1. У майбутньому буде цікаво з’ясувати ідентичність сигналів. Ця характеристика деградації RPX1 важлива для рослин, що може призвести до накопичення DMNT і забезпечити швидку реакцію на пошкодження шкідниками (додаткова інформація: малюнок S3). Підвищена стійкість рослин до шкідників часто відбувається за рахунок фітнесу. Спостереження про те, що мутація rpx1-1 призводить до підвищення стійкості (рис. 1) і вищого виробництва насіння (додаткова інформація: рис. S11) у арабідопсису без значних компромісів, пропонує багатообіцяючий шлях для створення інженерних культур з вищою стійкістю до шкідників. Наприклад, редагування геному за допомогою CRISPR-Cas9 є потужним інструментом для покращення врожаю (Yang et al., 2017), який дозволяє вводити мутації в RPX1 і потенційно розширює його застосування до різних культур.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Арімура, Г., Одзава, Р., Шімода, Т., Нішіока, Т., Боланд, В. і Такабаясі, Дж. (2000) Летючі речовини, індуковані травоїдними, викликають захисні гени в листі бобів Ліми. Природа, 406, 512–515.

Chen, C., Chen, H., Huang, S., Jiang, T., Wang, C., Tao, Z. та ін. (2021) Летючий DMNT безпосередньо захищає рослини від Plutella xylostella, руйнуючи перитрофічний матричний бар’єр у середній кишці комах. eLife, 10, e63938.

Ченг, X., Ху, Дж., Лі, Дж., Чен, Дж., Ван, Х., Мао, Т. та ін. (2018) Пошкодження шовкових залоз і транскрипційна реакція на пов’язані з детоксикаційними ферментами гени Bombyx mori під впливом фоксиму. Chemosphere, 209, 964–971.

Clough, SJ & Bent, AF (1998) Квіткове занурення: спрощений метод Agrobacterium-опосередкованої трансформації Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 16, 735–743.

Costarelli, A., Blanchet, C., Ederli, L., Salerno, G., Piersanti, S., Rebora, M. та ін. (2020) Саліцилова кислота, індукована годуванням травоїдних тварин, протидіє опосередкованому жасмоновою кислотою захисту рослин від нападу комах. Сигналізація та поведінка рослин, 15, e1704517.

Дуглас, А.Е. (2018) Стратегії підвищення стійкості культур до комах-шкідників. Річний огляд біології рослин, 69, 637–660.

Feng, Y. & Zhang, A. (2017) Квітковий аромат, метилбензоат, є ефективним зеленим пестицидом. Наукові звіти, 7, 42168.

Філд, Б. та Осборн, А.Е. (2008) Незалежне від метаболічної диверсифікації складання кластерів оперон-подібних генів у різних рослинах. Наука, 320, 543–547.

Го, YS, Лі, SB, Кім, HJ, Кім, J., Парк, HY, Кім, JK та ін. (2012) Ідентифікація мінеральної синтази, яка є критичною для росту та розвитку Arabidopsis. The Plant Journal, 72, 791–804.

Голс, Р. (2014) Прямий і непрямий хімічний захист від комах у мультитрофічній структурі. Рослина, клітина та навколишнє середовище, 37, 1741–1752.

Гомес М.А., Лін З.Д., Молл Т., Чаухан Р.Д., Хайден Л., Реннінгер К. та ін. (2019) Одночасне редагування ізоформ eIF4E маніоки nCBP-1 і nCBP-2, опосередковане CRISPR/Cas9, зменшує тяжкість симптомів та захворюваність на хворобу коричневої смуги маніоки. Журнал біотехнології рослин, 17, 421–434.

Gouinguené, S., Pickett, JA, Wadhams, LJ, Birkett, MA & Turlings, TCJ (2005) Електрофізіологічні реакції вусиків трьох паразитичних ос на спричинені гусеницями леткі речовини кукурудзи (Zea mays), бавовни (Gossypium herbaceum) і вігни (Vigna unguiculata). Журнал хімічної екології, 31, 1023–1038.

Хендрік, В., Роберт, КЕМ, Ахерн, КР, Чжоу, С., Мачадо, Р.А.Р., Мааг, Д. та ін. (2016) Біосинтез 8-O-метильованих бензоксазиноїдних захисних сполук у кукурудзі. The Plant Cell, 28, 1682-1700.

Huang, AC, Jiang, T., Liu, YX, Bai, YC, Reed, J., Qu, B. та ін. (2019) Спеціалізована метаболічна мережа вибірково модулює кореневу мікробіоту Arabidopsis. Наука, 364, eaau6389.

Huang, HJ & Yang, WB (2007) Синтез моеноцинолу та його аналогів з використанням BT-сульфону в олефінуванні Julia-Kocienski. Tetrahedron Letters, 48, 1429–1433.

Jing, T., Du, W., Gao, T., Wu, Y., Zhang, N., Zhao, M. та ін. (2020) DMNT, індукований травоїдними, каталізований CYP82D47, відіграє важливу роль у індукції JA-залежної резистентності рослиноїдних сусідніх рослин чаю. Рослина, клітина та навколишнє середовище, 44, 1178–1191.

Джонсон, С. Н. та Зюст, Т. (2018) Зміна клімату та комахи-шкідники: опір не марний? Тенденції рослинництва, 23, 367–369.

Jouzani, GS, Valijanian, E. & Sharafi, R. (2017) Bacillus thuringiensis: успішний інсектицид із новими екологічними характеристиками та новинами. Прикладна мікробіологія та біотехнологія, 101, 2691–2711.

Kappers, IF, Aharoni, A., van Herpen, TWJM, Luckerhoff, LLP, Dicke, M. & Bouwmeester, HJ (2005) Генна інженерія терпеноїдного метаболізму приваблює охоронців до Arabidopsis. Наука, 309, 2070–2072.

Кейма, Т., Хагівара-Комода, Ю., Хашимото, М., Нерія, Ю., Коінума, Х., Івабучі, Н. та ін. (2017) Дефіцит ізоформи eIF4E nCBP обмежує міжклітинний рух рослинного вірусу, що кодує білки потрійного генного блоку в Arabidopsis thaliana. Наукові звіти, 7, 39678.

Lee, S., Badieyan, S., Bevan, DR, Herde, M., Gatz, C. & Tholl, D. (2010) Індуковані травоїдними та квітковими монотерпенові леткі речовини біосинтезуються одним ферментом P450 (CYP82G1) в Arabidopsis . Праці Національної академії наук, 107, 21205–21210.

Лі, Б., Фьорстер, К., Роберт, КЕМ, Зюст, Т., Ху, Л., Мачадо, РАР та ін. (2018) Конвергентна еволюція метаболічного перемикання між резистентністю попелиць і гусениць у зернових. Наукові досягнення, 4, eaat6797.

Лю, Д., Хуан, X., Цзин, В., Ан, X., Чжан, К., Чжан, Х. та ін. (2018) Ідентифікація та функціональний аналіз двох ферментів P450 Gossypium hirsutum, які беруть участь у біосинтезі DMNT і TMTT. Журнал біотехнології рослин, 16, 581–590.

Lortzing, T. & Steppuhn, A. (2016) Передача сигналів жасмонату в рослинах формує екологію взаємодії рослин і комах. Сучасна думка в науці про комах, 14, 32–39.

Лу, Х., Ло, Т., Фу, Х., Ван, Л., Тан, Ю., Хуан, Дж. та ін. (2018) Стійкість рису до комах-шкідників, опосередкована пригніченням біосинтезу серотоніну. Природні рослини, 4, 338–344.

Lucioli, A., Tavazza, R., Baima, S., Fatyol, K., Burgyan, J. & Tavazza, M. (2022) Націлювання CRISPR-Cas9 на ген eIF4E1 розширює спектр стійкості Solanum до вірусу картоплі Y tuberosum L. cv. desirée. Frontiers in Microbiology, 13, 873930.

Ma, F., Yang, X., Shi, Z. & Miao, X. (2019) Нові перехресні реакції між реакцією шляху етилену та жасмонової кислоти на комаху, що смоктає пірсинг у рисі. Новий фітолог, 225, 474–487.

Міентс А.К., Чен С.П., Райхельт М., Лу Х.Х., Бартрам С., Йе К.В. та ін. (2019) Летючий DMNT системно індукує жасмонат-незалежний прямий захист від травоїдних тварин у листі рослин солодкої картоплі (Ipomoea batatas). Наукові звіти, 9, 17431.

Mikstacki, A., Zakerska-Banaszak, O., Skrzypczak-Zielinska, M., Tamowicz, B., Szalata, M. & Slomski, R. (2015) Глутатіон-S-трансфераза як показник токсичності в загальній анестезії: генетика та біохімічна функція. Журнал клінічної анестезії, 27, 73–79.

Роадс, RE (2009) eIF4E: нові члени сім’ї, нові партнери, нові ролі. Журнал біологічної хімії, 284, 16711–16715.

Ріхтер А., Шафф К., Чжан З., Ліпка А.Е., Тіан Ф., Келлнер Т.Г. та ін. (2016) Характеристика біосинтетичних шляхів виробництва летких гомотерпенів DMNT і TMTT у Zea mays. Рослинна клітина, 28, 2651–2665.

Рууд, К.А., Кулоу, К., Госс, Ді-Джей і Браунінг, К.С. (1998) Ідентифікація та характеристика нового кеп-зв’язуючого білка з Arabidopsis thaliana. Журнал біологічної хімії, 273, 10325–10330.