Введення консорціумів кишкових бактерій in vivo реплікує метаботипи A та B уролитину на моделі щурів, які не продукують уролітинⅠ
Dec 25, 2023
Протягом десятиліть споживання елагітанінів (ЕТ) і елагової кислоти (ЕА) асоціювалося з численними біологічними ефектами, включаючи антиоксидантну, протипухлинну, протизапальну, антибактеріальну дію та активність проти реплікації ВІЛ.1 Однак поглинання та біодоступність ЕТ і ЕА Попередні дослідження на людях показали, що екскреція EA та EA-O-глюкуроніду з сечею становить менше 1% споживання.2,3 Тим не менше, хоча ET та EA поглинання низьке, вони далі метаболізуються мікробіотою товстої кишки до уролитинів (Uros), які відповідають, принаймні частково, за сприятливий вплив продуктів, багатих на ET та (або) EA.1,4
По-перше, ЕА вивільняється шляхом гідролізу складноефірних зв’язків ЕТ ферментом, відомим як елагітаназа.5 ЕА піддається подальшій деградації, утворюючи похідні 6H-дибензо[b,d]піран-6-он, які називаються Uros. Цей каскад реакцій починається з розщеплення лактонного кільця ферментом лактоназою, у результаті чого утворюється лютеїнова кислота, яка потім декарбоксилюється до пентагідрокси-Uro (Uro-M5). Послідовне дегідроксилювання перетворює її на тетрагідрокси-Uros (Uro-D, Uro-E та Uro-M6) і тригідрокси-Uro (Uro-C, UroM7 і Uro-G), щоб нарешті отримати дигідрокси-Uro (Uro-A і ізоUro-A) і моногідрокси-Uro (Uro-B), останній зазвичай виявляється коли також утворюється ізоУро-А.1
Великі варіації метаболічних профілів Uro, виявлені у людей після споживання продуктів, багатих на ET, вказують на міжіндивідуальні відмінності в мікробіоті товстої кишки, відповідальної за деградацію ET.6–8 Численні можливі взаємодії між бактеріями товстої кишки та організмом-господарем можуть пояснити різні метаболічні долі харчових (полі )феноли.6,9 Ця двостороння взаємодія між кишковою мікробіотою та (полі)фенолами спонукала наукову спільноту кластеризувати популяцію на основі їхметаболічний фенотип (тип металу), щоб пояснити різницю в ефектах поліфенолів.10,11 Більш конкретно, відповідно до метаболізму ET і EA, індивідуумів можна розділити на урометаботипи (UM), пов’язані зі складом і функціональністю кишкового мікробіому.7,8,12
Три людини UM (UM-A, UM-B і UM-0), пов’язані з трьома різними профілями виробництва Uro, були описані в західних і східних популяціях.13–15 У зв’язку з цим особи метаботипу A (UM-A) виробляють кілька проміжних Uro, але лише уролітин A (Uro-A), основний абсорбований Uro в цьому UM, наприкінці катаболічного шляху мікробів. Особи метаботипу B (UM-B) виробляють деяку кількість проміжних урогів і три кінцевих уро, тобто уролітин B (Uro-B), уролітин A (IsoUro-A) і уро-A, які є основними абсорбованими уро в UM-B. Таким чином, проміжні Уро можуть діяти в основному в кишечнику, тоді як кінцеві можуть мати місцеві та системні ефекти.6 Навпаки, люди з типом металу 0 (UM-0) не можуть виробляти ці кінцеві Уро (лише Поки що виявлено попередник уролітин-М5, який не всмоктується в кишечнику).
Відмінності в уропрофілях спостерігалися між UM і вздовж товстого кишечника, показуючи переважне утворення сечі в дистальному відділі ободової кишки.16–19 Примітно, що відсоток UM-0 у здорових добровольців Іспанії та Китаю становить приблизно 10% і може бути навіть вищим у населення США.13-15 Бактерії родів Gordonibacter і Ellagibacter були ідентифіковані як здатні метаболізувати ЕА в деякі Uros.20-23Однак було виявлено, що деякі проміжні продукти (наприклад, Uro-D, Uro-E, Uro- M7 та Uro-G) і остаточний Uros (Uro-A та Uro-B) не виробляються в чистих культурах цих бактерій, що означає потребу в інших бактеріях для завершення набору Uros, який налаштовує як UM-A, так і UM-B . Нещодавно було ідентифіковано кишковобактеріальні консорціуми, які беруть участь у метаболізмі ЕА для отримання метаботипів, що продукують сечовиділення (UM-A та UM-B) in vitro.24
Бактеріальні консорціуми, що містять Gordonibacter плюс Enterocloster і Ellagibacter плюс Enterocloster, продукували in vitro уролитини, пов’язані з UM-A і UM-B, відповідно.25 Проте здатність цих бактеріальних консорціумів відтворювати профілі Uro людини, пов’язані з UM-A і UM-B in vivo досі невідомо. Крім того, безпека споживання цих бактерій, що виробляють уроцид, як нових пробіотиків, все ще залишається невизначеною, оскільки вони раніше не тестувалися на тваринах або людях. У цьому дослідженні вищезазначені бактеріальні консорціуми оцінювали на їх здатність колонізувати кишечник щурів, які не продукують сечогін (UM-0-подібних) і перетворювати їх у продуценти сероподібної залози, що імітують UM-A та UM-B відповідно. Також була оцінена безпека цих бактеріальних консорціумів. Крім того, було розроблено дві нові процедури на основі кількісної ПЛР у реальному часі (qPCR) для виявлення та кількісного визначення Ellagibacter і Enterocloster у зразках фекалій.
Матеріали та методи
Хімічні речовини та реактиви
Уроси були хімічно синтезовані та очищені компанією VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Мурсія, Іспанія). EA був придбаний у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Фосфатний буферний розчин (PBS) був отриманий від FisherScientific (США), тоді як метанол, етанол і мурашина кислота були отримані від Panreac Química (Барселона, Іспанія). Розчинники для рідинної хромато-мас-спектрометрії (LC-MS) були придбані у JT Baker (Девентер, Нідерланди). Вода Ultrapure Millipore (Бедфорд, Массачусетс, США) використовувалася протягом усього дослідження. Усі хімікати та реактиви були аналітичного класу.
Підготовка бактеріальних консорціумів
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T і Enterocloster bolted CEBASS4A9, усі вони виділені та ідентифіковані в нашій лабораторії (CEBAS-CSIC, Іспанія), були анаеробно культивовані в 5 мл Wilkins - Пробірки з анаеробним середовищем Чалгрена (WAM, Oxoid) при 37 градусах протягом 48 годин в анаеробній камері Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Брідженд, Південний Уельс, Великобританія) і ресуспендують у PBS з додаванням 10% гліцерину та 0,05% L-цистеїну гідрохлориду (PanReac). Кіміка, Барселона, Іспанія). Після анаеробної інкубації були підготовлені консорціуми.24,25 Коротко кажучи, «бактеріальний консорціум А» містив G. штами urolithinfaciens і E. bolteae; «бактеріальний консорціумB» містив культури E. isourolithinifaciens і E. bolteae; і «контрольний коктейль» містив стерильний PBS з 10% гліцерину та 0,05% L-цистеїну гідрохлориду. Перед введенням усі коктейлі розподіляли на аліквоти по 3,5 мл і зберігали при -80 градусах.
Тварини, дієти та дизайн експерименту
Протокол експерименту (посилання 624/2020) був схвалений місцевим урядом, Комітетом з біоетики Іспанської національної дослідницької ради (Мадрид, Іспанія) та Комітетом з етики експериментів на тваринах Університету Мурсії (Іспанія). Експерименти проводилися відповідно до рекомендацій Європейського Союзу щодо експериментів на тваринах (Директива 2010/63/ЄС Європейського парламенту та Ради щодо захисту тварин, які використовуються в наукових цілях). Щури Wistar (n=18; 9 самок і 9 самців) вагою 240 ± 31 г були отримані від Envigo (Барселона, Іспанія). Ця модель щурів була обрана на основі її нездатності виробляти Uros, що спостерігалася в наших попередніх дослідженнях, у яких тестувалися зразки фекалій від різних моделей щурів. Три групи (A, B і C) були сформовані випадковим розподілом по 6 тварин (3 самки та 3 самці щурів). ) на групу (рис. 1).
Кожну групу щурів містили у двох різних клітках, розділених за статтю, у кімнаті з контрольованою температурою (22 ± 2 градуси) з відносною вологістю 55 ± 10% і контрольованим циклом світло-темрява (12 годин). Щури отримували стандартну дієту (Teklad, Барселона, Іспанія), яка містила (%/100 г свіжої ваги) 14,3% білків (кукурудзяна клейковина), 48% вуглеводів (пшенична промішка, мелена пшениця, мелена кукурудза) і 4% жиру (соєва олія). ), 2,9 ккал/г енергетична щільність і 4,1% сирої клітковини, доповненої порошком ЕА чистотою більше або дорівнює 95% (3,6 мг на 100 г їжі). ЕА змішували гомогенно з меленим стандартним кормом, повторно гранулювали та ліофілізували. Раціон, збагачений ЕА, зберігався подалі від вологи та світла. Доза ЕА, наданащурів у раціоні було приблизно 0.72 мг на щура на день (дієта EA1×), еквівалентна доза для людини 41 мг на день−1.26 Усі групи годували дієтою EA 1× та водопровідною водою ad libitum протягом усього експерименту ( 5 тижнів). Оскільки ЕА, виявлений у пробах фекалій, був низьким протягом першого тижня, у наступні дні було додано додаткову кількість ЕА. На 3-му тижні додаткову дозу 1,5 мг ЕА на щура на день, розчинену у воді, вводили тваринам перорально через зонд (загальна дієта=ЕА 3×), яку давали лише протягом 1 тижня. Нарешті, на 4-му тижні ≈5 г волоських горіхів на щура на день (інше джерело ЕА) додавали до раціону ЕА 1× і зберігали до кінця дослідження, щоб оцінити вплив ЕА, що містить харчову матрицю, на здатність бактерій виробляти Урос. Щодня вимірювали вагу, споживання їжі та води. Кишкові бактеріальні консорціуми вводили перорально через зонд. Група A отримала 500 мкл бактеріального коктейлю A, група B отримала 500 мкл бактеріального коктейлю B, а група C (контроль) отримала 500 мкл PBS. Пероральний зонд проводили кожні 2 дні протягом перших двох тижнів і щодня протягом наступних 2 тижнів. Протягом останнього тижня (з 28 по 32 день) тварини продовжували дотримуватися тієї самої дієти з додаванням ЕА та волоських горіхів, але без перорального введення бактерій. Наприкінці дослідження тварин умертвляли за допомогою камери CO2.
Процедури відбору проб
Зразки фекалій були зібрані під час дослідження для аналізу сечі за допомогою UPLC-ESI-QTOF-MS/MS та кишкової мікробіоти за допомогою секвенування гена 16S рРНК та кПЦР. Кров відбирали в різні моменти часу (початковий рівень, 28 день і кінець дослідження) для гематологічного та біохімічного аналізів сироватки. Зразки крові були отримані з хвостової вени (≈500 мкл) і зібрані в пробірки з гепарином на вихідному рівні та в дні 28 і 32 (рис. 1). Розділення плазми було виконано негайно центрифугуванням при 3000 g протягом 10 хвилин при 4 градусах і заморожено при - 80 градусів до подальшого визначення серобіохімічних змінних. Печінку, нирки та селезінку збирали, зважували та досліджували, щоб виявити будь-які морфологічні відмінності під час умертвіння.
Дизайн та оптимізація праймерів і зонда для кількісного визначення Ellagibacter і Enterocloster за допомогою КПЦР
Послідовності генів 16S рРНК Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T і E. bolted CEBAS S4A9 були отримані з бази даних GenBank (база даних EMBL). Послідовності були узгоджені з філогенетично близькими бактеріальними поколіннями за допомогою програмного забезпечення Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 11) і перевірені на наявність областей консервативних і змінних послідовностей для розробки праймерів і зонда для виявлення та кількісного визначення Ellagibacter і Enterocloster (Таблиця 1). Праймер і зонд були розроблені та перевірені за допомогою інструментів Primer Questand Oligo Analyzer відповідно (Integrated DNATechnologies, Inc., Бельгія). Зонд TaqMan був позначений на 5'- і 3'-кінцях 6-карбокси-флуоресцеїновою групою (6FAM) і гаситель ожини (BBQ) відповідно. КПЦР проводили за допомогою системи виявлення ABI 7500sequence. Кінцеві концентрації кожного праймера та зонда становили 300 і 375 нМ для Ellagibacter і 200 і 500 нМ для Enterocloster. Для ампліфікації ДНК Ellagibacter andЕнтероклостер відповідно. Профіль підвищення для ампліфікації Ellagibactera складав 1 цикл при 95 градусах протягом 5 хвилин, потім 45 циклів при 95 градусах протягом 15 секунд, 50 градусах протягом 40 секунд і 72 градусах протягом 31 секунди. Нарешті, був доданий 1 цикл при 72 градусах протягом 5 хвилин . Профіль підвищення для ампліфікації Enterocloster становив 1 цикл при 95 градусах протягом 5 хвилин, потім 40 циклів 95 градусів протягом 15 секунд, 65 градусів протягом 40 секунд і 72 градуси протягом 31 секунди. Нарешті додано 1 цикл при 72 градусах протягом 5 хвилин.
Екстракція ДНК фекалій і мікробний аналіз кишечника
Екстракцію ДНК із зразків фекалій проводили за допомогою набору для очищення тканинної ДНК NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника з деякими модифікаціями. ДНК кількісно визначали за допомогою флуориметрії (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Великобританія), а чистоту вимірювали за коефіцієнтом поглинання при довжині хвилі 260/280 нм (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Великобританія). ). Склад кишкової мікробіоти визначали шляхом секвенування варіабельних областей V3 і V4 гена 16S рРНК відповідно до протоколів Illumina (Illumina Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США) із довжиною зчитування 2 × 300 п.н. , Illumina Inc.). Метагеномне секвенування проводили на платформі MiSeq-Illumina (служба секвенування FISABIO, Іспанія). Обробку даних, видалення химерної послідовності, вирівнювання послідовності та кластеризацію послідовності гена 16S рРНК виконували, як описано в інших місцях, для отримання таксономічної класифікації.8,27 Ампліфікація ДНК Gordonibacter була досягнута в системі ABI 7500 qPCR, як описано раніше.19,28 Enterocloster і Ellagibacter- специфічні праймери та зонди, розроблені в цьому дослідженні, використовували відповідно до протоколу кПЦР, описаного вище. Для кількісного визначення використовували стандартні криві геномної ДНК Gordonibacter, Enterocloster і Ellagibacter. Усі зразки фекалій аналізували в трьох повторах.
Екстракція, виявлення та кількісне визначення уролітинов у пробах фекалій
Зразки фекалій ({{0}}.2–0.5 г) екстрагували в пропорції 1:10 розчином MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), підкислюють 0.1% HCl і гомогенізують шляхом перемішування на вортексі протягом 2 хвилин і струшування при 1500 об/хв при кімнатній температурі протягом 10 хвилин у блоковому нагрівачі. Суспензію центрифугували при 14 000g при 4 градусах протягом 10 хвилин, а супернатант фільтрували через мембранний фільтр PVDF 0,22 мкм (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс) і розбавляли 3× MeOH (0,1% мурашиної кислоти). ) перед ін’єкцією в систему UPLC-ESI-QTOF-MS. Систему UPLC (Agilent 1290Infinity), поєднану з квадрупольною системою часопрольоту (QTOF) LC/MS (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Вальдбронн, Німеччина), використовували для аналізу фекальних метаболітів за допомогою методу градієнтного елюювання, як описано раніше .29,30 Коротко, розділення було проведено в колонці зі зворотною фазою Poroshell 120 EC-C18, використовуючи воду та ацетонітрил, обидва підкислені 0,1% мурашиною кислотою, як рухомі фази. Швидкість потоку становила 0,4 мл/хв, а об’єм ін’єкції становив 5 мкл. Для обробки даних використовували програмне забезпечення MassHunter Qualitative Analysis (версія B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Німеччина). Усі метаболіти були ідентифіковані шляхом прямого порівняння зі стандартами та підтверджені їхньою молекулярною масою. Калібрувальні криві були отримані для EA та різних Uros з хорошою лінійністю (R2 > 0,99).
Гематологія та клінічна хімія
Гематологічні параметри визначали в гепаринізованій крові за допомогою автоматизованого гематологічного аналізатора зі спеціальним програмним забезпеченням для зразків крові щурів (AVDIA 120, Siemens, Мюнхен, Німеччина). Аналізованими змінними були середній корпускулярний об’єм (MCV), середній корпускулярний гемоглобін (MCH), середня корпускулярна концентрація гемоглобіну (MCHC), розподіл еритроцитів (RDW), середній об’єм тромбоцитів (MPV), тромбоцитарний крит (PCT), ширина розподілу тромбоцитів (PDW). , середній тромбоцитарний компонент (MPC), середня маса тромбоцитів (MPM), кількість тромбоцитів (PLT), вміст гемоглобіну в ретикулоцитах (CHr) і середній корпускулярний об’єм ретикулоцитів (MCVr). Біохімічні параметри плазми, кальцій (Ca) і фосфор (P) аналізували за допомогою хімічного та токсикологічного аналізатора Olympus AU400 (Beckman Coulter, Каліфорнія, США). Біохімічними змінними були загальні білки (PROT), альбумін (ALBU), глобулін (GLOB), креатинін (CREA), глюкоза (GLUC), холестерин (CHOL), тригліцериди (TRIGL), лужна фосфатаза (ALP), гамма-глутамілтранспептидаза ( ГГТ), аспартатамінотрансферази (АСТ) і аланінамінотрансферази (АЛТ). Нарешті, рівні тироксину (Т4) аналізували за допомогою системи імунологічного аналізу IMMULITE® 1000 (Siemens).
Статистичний аналіз
Дані виражено як середнє ± стандартне відхилення (SD). Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS версії 27.0 (SPSS Inc., Чикаго, штат Іллінойс, США), і різниці з p < 0.05 вважалися статистично значущими. Нормальність даних оцінювали за допомогою тесту Шапіро–Вілка. Порівняння між різними групами лікування проводили за допомогою повторного виміряного дисперсійного аналізу (RM ANOVA) з тестом T3 post hoc Тьюкі або Даннетта, залежно від того, чи відповідають дані нормальному чи ненормальному розподілу відповідно. Відмінності між чоловіками та жінками досліджували за допомогою парного t-критерію Стьюдента або знакового рангового тесту Вілкоксона, коли дані були нормально чи ненормально розподілені відповідно. Лінійний дискримінантний аналіз хі-квадрат (LEfSe) використовувався для виявлення відмінних ознак бактерій між групами. Кореляцію Пірсона використовували для аналізу можливих зв’язків між змінними в даних з нормальним розподілом, тоді як кореляцію Спірмена застосовували в даних з ненормальним розподілом. Діаграми даних були виконані за допомогою Sigma Plot 14.5 (Systat Software, Сан-Хосе, Каліфорнія, США).
Натуральний трав'яний препарат для полегшення запору - цистанш
Цистанка — рід паразитичних рослин, що належить до сімейства Orobanchaceae. Ці рослини відомі своїми лікувальними властивостями і використовувалися в традиційній китайській медицині (ТКМ) протягом століть. Види Cistanche переважно зустрічаються в посушливих і пустельних регіонах Китаю, Монголії та інших частинах Центральної Азії. Рослини цистанхеї характеризуються м’ясистими жовтуватими стеблами та високо цінуються за потенційну користь для здоров’я. У ТКМ вважається, що цистанхе має тонізуючі властивості і зазвичай використовується для живлення нирок, підвищення життєвих сил і підтримки сексуальної функції. Він також використовується для вирішення проблем старіння, втоми та загального самопочуття. Хоча цистанхе має довгу історію використання в традиційній медицині, наукові дослідження щодо його ефективності та безпеки тривають і обмежені. Однак він містить різні біоактивні сполуки, такі як фенілетаноїдні глікозиди, іридоїди, лігнани та полісахариди, які можуть сприяти його лікувальним ефектам.
Wecistanche'sцистанх порошок, цистанх таблетки, цистанх капсули,та інші продукти розроблені з використаннямпустеляцистанчеяк сировину, все це добре впливає на полегшення запорів. Конкретний механізм полягає в наступному: вважається, що цистанша має потенційні переваги для полегшення запорів на основі традиційного використання та певних сполук, які вона містить. Хоча наукові дослідження щодо впливу цистанхи на запор обмежені, вважається, що він має кілька механізмів, які можуть сприяти його потенціалу для полегшення запорів. Проносний ефект:Цистанхездавна використовувався в традиційній китайській медицині як засіб від запорів. Вважається, що він має легкий проносний ефект, який може сприяти випорожненню кишечника та викликати запор. Цей ефект можна віднести до різних сполук, знайдених у цистанці, таких як фенілетаноїдні глікозиди та полісахариди. Зволоження кишечника: виходячи з традиційного використання, вважається, що Cistanche має зволожуючі властивості, особливо спрямовані на кишечник. Стимулювання зволоження та змащення кишечника може допомогти пом’якшити інструменти та полегшити проходження, тим самим полегшуючи запор. Протизапальний ефект: Запор іноді може бути пов’язаний із запаленням травного тракту. Цистанхе містить певні сполуки, включаючи фенілетаноїдні глікозиди та лігнани, які, як вважають, мають протизапальні властивості. Зменшуючи запалення в кишечнику, це може допомогти покращити регулярність дефекації та полегшити запор.
