Синергічні лікарські комбінації на основі In Silico з рослинних лікарських засобів: приклад використання Cistanche Tubulosa-Ⅱ

Модуль нейрозахисту

Нейропротекція — це механізми та стратегії, які використовуються для захисту від пошкодження або дегенерації нейронів у ЦНС після гострих розладів (наприклад, інсульту або пошкодження/травми нервової системи) або в результаті хронічних нейродегенеративних захворювань (наприклад, хвороби Паркінсона, Альцгеймера, розсіяного склерозу). Мета нейропротекції полягає в тому, щоб обмежити нейрональну дисфункцію/смерть після пошкодження ЦНС і намагатися підтримувати найвищий рівень

можлива цілісність клітинних взаємодій у мозку, що призводить до непорушеної нервової функції. Як видно з рис. 4, деякі мішені на шляху серотонінергічного синапсу беруть участь у функції нейропротекції. Наприклад, вироблення простагландинів через PTGS1 і PTGS2 (також відомі як ЦОГ-1 і ЦОГ-2) є важливим посередником у викликанні протизапальних і нових пророзчинних механізмів56. Нещодавнє дослідження показало, що експресія гена ADCY5, ферменту, який каталізує генерацію цАМР57, знижується за рахунок метилювання промотора в ЦОГ-2-індукованих лініях клітин HCC людини58. Базуючись на наведеному вище аналізі, ми припускаємо, що накопичення ЦОГ-2 може впливати на секрецію sAPP, розщеплення APP, що розщеплюється -секретазою, яка модулюється цАМФ і додатково здійснює нейропротекторний ефект59,60. Наші результати показують, що нейропротекція відіграє важливу роль у лікуванні нейрозапалення.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ХВОРОБИ ПАРКІНСОНА ФУНКЦІЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Експериментальна перевірка

Життєздатність клітин мікроглії BV2, оброблених сполуками

Клітини мікроглії BV2 (8×104 клітини/мл) подають у концентрації від 37,5 до 300 мкМ на мілілітр культурального середовища без сироватки чотирьох сполук протягом 24 годин. Ми вважаємо життєздатність клітин контрольної групи, культивованої за відсутності сироватки з менш ніж 0,1% ДМСО, як 100% (рис. 5(a–d)). Не спостерігається значної клітинної цитотоксичності при призначених дозах груп.

Перевірка синергії ліків і потенційного протизапального ефекту in vitro

Для подальшої оцінки отриманих результатів in silico чотири сполуки, що охоплюють три синергетичні пари, а саме ізоактеозид, 2'-ацетилактеозид, ехінакозид і вербаскозид, вибираються для вивчення їхніх лікарських синергічних ефектів і потенційного протизапального ефекту з використанням клітин BV2, оброблених LPS. Зокрема, ми проводимо Вестерн-блот аналіз експресії білка iNOS і ЦОГ-2, щоб підтвердити синергізм і протизапальну дію прогнозованих комбінацій препаратів.

Як показано на рис. 5(e–g), наведено рівні білків iNOS і COX-2 на панелі протестованих клітинних ліній BV2. Ми спостерігаємо, що при лікуванні ізоактеозидом або 2'-ацетилактеозидом експресія білка iNOS і ЦОГ-2 у клітинах BV2 значно знижувалася при різних рівнях доз. Однак лікування комбінацією ізоактеозиду та 2′-ацетилактеозиду індукує значне збільшення факторів запалення iNOS та ЦОГ-2 (рис. 5(e)). Рисунок 5(f) ілюструє целікування ехінакозидом або вербаскозидом, як один агент, спричиняє зниження експресії iNOS і COX-2. Крім того, як і очікувалося, лікування ехінакозидом у комбінації з вербаскозидом у концентрації 150 мкМ призвело до більш вираженого зниження

рівні експресії білка (iNOS і COX-2), що вказує на синергетичну протизапальну дію цієї комбінації препаратів. Подібним чином, як показано на рис. 5(g), комбінація ехінакозиду та 2'-ацетилактеозиду демонструє значний синергічний ефект на інгібування ЦОГ-2 у концентрації 75 мкМ або 300 мкМ. Однак для iNOS у дозі 300 мкМ комбінація являє собою помітне пригнічення білка. На відміну від цього, ми виявили, що немає очевидного ефекту інгібування як iNOS, так і ЦОГ-2 щодо комбінації ізоактеозиду та 2′-ацетилактеозиду або ехінакозиду та вербаскозиду в концентрації 75 мкМ (додатковий малюнок 2), крім того, лікування з іншими парами демонструє набагато слабший ефект порівняно з окремими агентами в дозуванні 150 або 300 мкМ, що можна побачити на рис. 5 (e–g).

Підсумовуючи, дослідження in vitro надає додаткову інформацію для скринінгу комбінацій препаратів із потенційно протизапальною дією та демонструє надійність стратегії скринінгу in silico.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЛІКУВАННЯ НЕЙРОЗАПАЛЕННЯ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обговорення

Нейрозапалення причетне до більшості неврологічних, психіатричних захворювань і захворювань, пов’язаних із розвитком нервової системи, і є не лише наслідком, але й може бути тригером патології. Однак поточні методи лікування нейрозапальних захворювань є здебільшого монотерапією, обмеженою добре відомими побічними ефектами, як ми знаємо, інгібітори ЦОГ-2 можуть призвести до серцево-судинних дефектів у відповідь на тривале лікування, а лікування, націлене на TNF, може спричинити інфекцію через імуносупресія. Комбінаторні терапевтичні підходи можуть бути обов’язковими для покращення лікування складних захворювань із такими перевагами: надійність протидії мережі та компенсація обходу, підвищена клінічна ефективність при збереженні мінімальної токсичності для людини та зменшене дозування кожної сполуки63. Однак дослідження синергічних комбінацій лікарських засобів серед сполук, отриманих із лікарських рослин на основі системної фармакології, обмежене можливою основною причиною великої кількості сполук.

У роботі ми спочатку отримуємо 63 потенційні біоактивні сполуки зтрава цистанки трубчастої, що відповідає критеріям (DL більше або дорівнює 0.18) для подальшого аналізу за допомогою передбачення, яке є необхідним для відсіювання більш перспективних молекул із бажаними властивостями. Після відображення 133 мішеней 63 потенційних біологічно активних сполук у базі даних ми отримуємо 43 мішені, пов’язані з нейрозапаленням, а потім кластеризований аналіз GOBP прогнозованих мішеней може сприяти лікуванню нейрозапалення. Аналітичний результат мережі CT показав середній ступінь на з'єднання 11,209 і 7,651 на ціль, відповідно, і 38 з них коригували більше ніж 7 цілей (більше, ніж середній ступінь). Наприклад, ехінакозид (mol41), передбачений з 7 мішенями, вербаскозид (mol33), з 9 мішенями, або Tableside B (mol57), з 8 мішенями, можуть відігравати ключову роль у нейрозахисті згідно зі збільшенням кількості літератури.

Ми досягаємо прямих терапевтичних цілей, таких як APP, MAPT (також відомий як Tau), PPARG70, MMP9, MMP2 і HTR2A (також відомий як 5-HT2A), GRIN2B (субодиниця 2B типу NMDA іонотропного рецептора глутамату) і GRIA1 (субодиниця 1 типу AMPA іонотропного рецептора глутамату) або потенційні мішені нижче за течією, такі як PTGS274 або NOS275, які пов’язані з нейрозапаленням або різними захворюваннями нервової системи.

Аналіз мережі Compound-Target-Pathway відображає 12 сполук із 10 найкращих пар ліків за допомогою алгоритму PEA, пов’язаних із 43 потенційними мішенями та шляхами, пов’язаними з нейрозапаленням, наприклад, сигнальний шлях кальцію, взаємодія нейроактивного ліганду та рецептора або сигнальний шлях TNF і так далі. У системі ці передбачувані сполуки можуть діяти не лише на білки вхідних, але й низхідних шляхів, пов’язаних, зокрема, з нейрозапаленням і запальними біомаркерами. Крім того, надається додаткова інформація для скринінгу комбінацій препаратів з потенційно протизапальною дією, а надійність стратегії скринінгу in silico перевіряється шляхом експериментальної перевірки. Шлях нейрозапалення складається з шляху хвороби Альцгеймера, сигнального шляху кальцію, сигнального шляху GnRH, сигнального шляху VEGF і серотонінергічного синапсу. Аналітичні результати чітко пояснили нам, що модулі загибелі клітин, запалення та нейропротекції є прикладами для розшифровки механізмуCistanche tubulosa для лікування нейрозапалення.

Нейрозапалення супроводжує різні нейродегенеративні захворювання, які можуть бути не тільки наслідком, але й тригером патології, тому протизапальна терапія вважається перспективним підходом до лікування. На наше розчарування, незважаючи на те, що ми усвідомили обмеження монотерапії, оцінка та основні механізми комбінованої терапії все ще залишаються основними проблемами при розробці нової альтернативної стратегії. Таким чином, ця робота може запропонувати нові терапевтичні можливості для нейрозапалення та може відкрити новий шлях для відкриття комбінацій ліків з натуральних продуктів.

Матеріали та методи

Колекція сполук

Загалом 66 хімічних інгредієнтів Cistanche tubulosa зібрано вручну з TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/)76, включаючи 26 фенілетаноїдних глікозидів, 22 іридоїди, 4 лігнани, 7 монотерпенових глікозидів, 2 азотисті речовини, 3 бензол-акрилоїл цукрів, 1 стерин, 1 кетол. Враховуючи цеглікозиди в Cistanche tubulosaзазвичай гідролізуються для вивільнення аглікону, який потім поглинається слизовою оболонкою кишечника, тому ми беремо до уваги молекули без гліколю, які позначені як _qt. Це призвело до утворення 103 сполук. Ці молекули представлені в додатковій таблиці S1.

Оцінка подібності препарату

Щоб отримати потенційні біологічно активні сполуки з Cistanche tubulosa, ми оцінюємо лікарську схожість цих інгредієнтів шляхом розрахунку подібності Танімото між рослинними сполуками та середніми молекулярними властивостями всіх хімічних речовин у базі даних Drugbank. Крім того, модель прогнозування DL була успішно застосована в багатьох дослідженнях для вибору біоактивних сполук. У роботі індекс DL більше або дорівнює 0.18 кандидатів визначається як порогове значення, щоб краще відповідати наступному аналізу.

Цільове прогнозування препарату

Визначення цільових показників ефективності для провідних сполук залишається ключовим кроком до прогресування сполук у розробці ліків. Тут використовуються два власні інструменти: SysDT і WES, щоб отримати інформацію про молекулярну ціль для вилову ліків. SysDT — це індивідуальна модель, яка виконується з поєднанням хімічної, геномної та фармакологічної інформації на основі двох потужних математичних інструментів: Random Forest (RF) і Support Vector Machine (SVM) для ефективного вирішення проблеми ідентифікації цілі. Отримана модель послужила цінною платформою для прогнозування взаємодії лікарський засіб-мішень із загальною точністю 97,3%, активованою точністю передбачення 87,7% та інгібованою точністю передбачення 99,8%. Щоб охопити більш перспективні компоненти, у цьому дослідженні критерії фільтрації визначаються як значення РЧ більше або дорівнює 0.7 або SVM більше або дорівнює 0.8.

Зважена ансамблева схожість (WES) — це нова потужна обчислювальна модель для точного визначення прямих мішеней препарату щодо фактичних біоактивних інгредієнтів. Як новий інструмент, отримана модель добре працює у прогнозуванні зв’язування із середньою чутливістю 85% (SEN) та незв’язуючих шаблонів із 71% (SPE) із середніми площами під робочими кривими приймача (ROC, AUC) 85,2% і середня відповідність 77,5%. Отримані цілі надалі відображаються в Uniprot, щоб згодом нормалізувати їхні назви та організми. Тут ми лише обираємо цілі Homo sapiens для подальшого аналізу. Можливі мішені вибраних сполук відображаються в базі даних CTD, щоб отримати пов’язані з ними захворювання, і ми остаточно відсіюємо потенційні мішені, пов’язані з нейрозапаленням.

Збагачення та аналіз GO для цілей

Щоб дослідити біологічні процеси, задіяні в отриманих мішенях, ми зіставляємо мішені з DAVID, і в цьому розділі вибираємо терміни зі значенням P менше ніж 0.05.

Аналіз комбінації ліків

У нашій попередній роботі системна фармакологічна структура була використана для прогнозування комбінацій лікарських засобів на новій розробленій моделі, яка називається ймовірнісним ансамблевим підходом (PEA) для аналізу клінічної ефективності та побічних ефектів комбінацій лікарських засобів. Зокрема, була розроблена байєсовська мережа, яка інтегрується з алгоритмом подібності, щоб моделювати комбінації складових молекулярних і фармакологічних ефектів. Потім була представлена ​​комбінована оцінка, яка охоплювала клінічну ефективність і побічні ефекти для прогнозованих пар. Коротко, це показує, що PEA може передбачити ефективність пар із високою специфічністю та чутливістю (AUC=0.90) у нашій роботі. У цій роботі ми вибираємо десятку найкращих комбінацій лікарських засобів на основі їхніх синергічних ймовірностей, які представляють можливість індукції синергії між двома сполуками.

Побудова та аналіз мережі/шляху

Щоб дослідити взаємозв’язки між активними інгредієнтами та запальними захворюваннями, Cytoscape 2.8.1, популярний пакет біоінформатики для візуалізації біологічної мережі та інтеграції даних, створює мережу сполуки-мішені (CT) і мережу сполуки-мішені (CTP). Кількісні властивості мережі аналізуються за допомогою двох наступних плагінів Network Analyzer і CentiScaPe 1.2. У графічній мережі вузли вказують на сполуки, мішені або шляхи, тоді як краї кодують взаємодію лікарський засіб-мішень. Для подальшого вивчення біологічних ефектів того, як клітинні мішені діють шляхом модулювання багатьох метаболічних шляхів, об’єднаний «шлях» збирається з останньої інформації про нейрозапальну патологію. По-перше, використовуючи їх відображення в базі даних KEGG, досягнуті цільові профілі агрегуються в кілька шляхів. Після відмови від непрямих ділянок, відносно синтезований шлях інтегрується вручну з урахуванням патологічних і клінічних даних.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ХВОРОБИ ПАРКІНСОНА PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Експериментальна перевірка

Підготовка зразків

Ехінакозид, вербаскозид, ізоактеозид і 2'-ацетилактеозидзакуповуються у Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Нанкін, Цзянсу, Китай). Тестові зразки розчиняють у диметилсульфоксиді (ДМСО) (Sigma, США), щоб отримати 100 мМ, як основний розчин, а потім зберігають при 4 градусах. Кінцеві розведення ДМСО, доданого до культурального середовища, ніколи не перевищували 0,1%, що гарантувало відсутність впливу на життєздатність клітин.

Культура клітин

Клітини мікроглії миші BV2 спочатку розроблені Шанхайським клітинним банком Китайської академії наук і культивуються в 25 або 75 см2 середовищах Ігла, модифікованому Дульбекко (DMEM/25 мМ HEPES) (Gibco BRL, США) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS). (Gibco BRL, США), пеніцилін G (100 одиниць/мл) і стрептоміцин (100 мг/мл) у зволоженому інкубаторі з 5% CO2/95% O2 при 37 градусах.

Аналіз життєздатності клітин

Клітини мікроглії BV2 висівають у 96-лунковий планшет зі щільністю 1 × 105 клітин/мл, після інкубації протягом 18 годин клітини обробляють 100 мкл свіжого середовища з різними зазначеними концентраціями досліджуваних зразків або без них. додаткові 24 год. Аналіз CCK-8 (BestBio, Шанхай, Китай) є зручним і надійним методом визначення життєздатності клітин. Щоб усунути фон тестових зразків, ми відкидаємо все культуральне середовище, після чого додаємо 100 мкл/лунку свіжого середовища, що містить 10% розчин CCK-8. Значення OD при 450 нм зчитуються на рідері мікропланшетів (Molecular Devices, Каліфорнія, США) після 3 годин інкубації при 37 градусах і 5% CO2.

Вестерн-блот аналіз

Клітинний білок екстрагують із клітинних ліній за допомогою Qproteome™ Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Німеччина) після зазначених процедур згідно з протоколом виробника. Набір Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, США) використовується для кількісного визначення білка. Еквівалентні кількості білка (50мкг) денатурують кип’ятінням при 100 градусах протягом 10 хвилин з буфером для завантаження зразка 2*laemmli (Bio-Rad, США) плюс 5% -меркаптоетанол у співвідношенні 1:1 і завантажували на кожну доріжку на 12% SDS-PAGE (поліакриламідні мінігелі додецилсульфату натрію), електропереносили на 0,45 мкм мембрани з полівініліденфуориду (PDVF) (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США) протягом 150 хвилин при 200 мА. Згодом мембрани блокують у 3% бичачому сироватковому альбуміні (BSA) при кімнатній температурі та інкубують з первинними антитілами iNOS і COX-2 (Abcam) при 4 градусах протягом ночі. Після трьох ретельних промивань у Трис-буферизованому фізіологічному розчині-Твін (TBST) протягом 5 хвилин кожна мембрана досліджується вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону (HRP) (розведення 1:10000; Abcam) протягом 1,5 години при кімнатній температурі. Потім імунореактивні смуги візуалізують за допомогою набору для виявлення хемілюмінесценції ECL (Bio-Rad Laboratories, Річмонд, Каліфорнія, США) після двічі промивання в TBST і один раз в TBS, щоразу протягом 5 хвилин. Денситометричні значення нормалізують з використанням -актину як внутрішнього контролю навантаження.

Статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± стандартна помилка, і Вестерн-блот аналіз повторюють у трьох незалежних експериментах з однаковим результатом. Односторонній дисперсійний аналіз використовується для порівняння відмінностей середніх для трьох або більше груп, статистична значущість аналізується за допомогою t-критерію Стьюдента між двома групами.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ХВОРОБ ПАРКІНСОНА ТА ХВОРОБИ АЛЬЦГЕЙМЕРА PHGS75% ECH 30% ACT 12%