Експресія імунних генів і функціональні мережі в різних класах вовчакового нефриту Ⅰ

АНОТАЦІЯ

Мета Дослідити корисність платформи NanoString увисвітлення ниркиімунні стенограми для вовчакового нефриту (LN) класу III, IV і V з використанням ретроспективної когортифіксований формаліном парафінований(FFPE) тканина біопсії нирки.

Методи. Аналіз транскриптів імунних генів проводили за допомогою платформи NanoString nCounter на РНК з LN (n=55), хвороби тонкої базальної мембрани (TBM) (n=14) і мембранозної нефропатії (MN) (n{ {2}}) FFPEбіопсія ниркитканина. Зразки LN складалися з окремих біопсій класу III (n=11), IV (n=23) і V (n=21) без змішаних уражень. Диференціальна експресія генів була виконана за допомогою NanoString nSolver із візуалізацією графіків вулканів і теплових карт, згенерованих у R. Значні транскрипти були досліджені для ідентифікації функціональних мереж за допомогою термінів STRING і онтогенезу генів.

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ ТРАВ’ЯНИЙ СОСТАВ ЦИСТАНШИ ДЛЯ НИРОК

Результати Порівняно з TBM, ми ідентифікували 52 значно диференційовано експресованих гена, спільних для всіх трьох класів LN. Аналіз шляхів показав збагачення шляхів передачі сигналів інтерферону I типу (ІФН), комплементу та MHC II, причому більшість демонструє найвищу експресію в LN класу IV. Наші біопсії ЛН класу IV також показали значне посилення сигналізації NF-κB та імунологічне збагачення порівняно з біопсіями ЛН класу V. Транскрипти шляху IFN типу I відрізняли LN класу V від MN.

Висновок Наш транскриптомний аналіз усієї секції нирки дав уявлення про молекулярний профіль ЛН класу III, IV та V. Дані висвітлили важливі шляхи, спільні для всіх трьох класів, і шляхи, збагачені нашими біопсіями LN класу IV. Здатність виявити молекулярні шляхи в LN за допомогою FFPE цілих біопсійних зрізів може мати клінічну користь у виборі лікування для LN.

ВСТУП

Вовчаковий нефрит(LN) є важливим проявом системноїчервоний вовчак(СЧВ) і розвивається приблизно у 40% пацієнтів.1 Його поширеність залежить від віку (більше при СЧВ у дитинстві) та етнічного походження (вище у пацієнтів не європеоїдної раси) і обернено пов’язана з соціально-економічним статусом.2біопсія ниркиє важливою частиною лікування LN3 4, і було докладено значних зусиль, щоб пов’язати зміни, які спостерігаються в біопсії, з патогенезом, вибором лікування та прогнозом.1 Вирішальним для цього була розробка системи класифікації LN, яка включала стандартизовані визначення уражень біопсії, щоб зменшити варіабельність між звітами.

Консенсусна класифікація LN5 Міжнародного товариства нефрології/Товариства патології нирок (ISN/RPS) 2003 року описала шість класів: мінімальний мезангіальний LN (клас I); мезангіальний проліферативний ЛН (II клас); вогнищева ЛН (III клас); дифузний LN, який можна далі розділити на дифузний сегментарний (клас IV-S) і дифузний глобальний (клас IV-G) проліферативний LN; мембранозний ЛН (клас V) і прогресуючий склерозуючий ЛН (клас VI). Активні (А, наприклад, ендокапілярна гіперклітинність, фібриноїдний некроз, клітинні та мікроцелюлярні півмісяці) та хронічні (С, наприклад, гломерулярний склероз, фіброзні півмісяці) ураження клубочків також були визначені та позначені при описі класів III та IV. Наприклад, клас IV-G (A) описує дифузний глобальний проліферативний LN з активними ураженнями. Було запропоновано оновлення цієї класифікації6. Рекомендації включали виключення підрозділів класу IV-S та IV-G, оскільки вони не впливають на результат. У мета-аналізі поява будь-якоготермінальна стадія захворювання нирокабоподвоєння сироваткового креатинінуне відрізнялися між класами IV-S і IV-G.7 Було також запропоновано замінити активний і хронічний дескриптори на індекси активності та хронічності, отримані з системи оцінки активності вовчака NIH,8 таким чином уможливлюючи кількісну оцінку активності (а оцінка від 0 до 24) і хронічність (оцінка від 0 до 12).

Клас LN має вирішальне значення для інформування керівництва.3 Імуносупресія рекомендована при активному LN класу III та IV, але не при LN класу II. На рішення почати імуносупресію при LN класу V впливає ступінь протеїнурії та її відповідь на ренін-ангіотензин-альдостеронову блокаду. Нездатність контролювати протеїнурію через 12 місяців після лікування пов’язана з прогресуванням до хронічної хвороби нирок9–11, тому метою лікування є зменшення протеїнурії з метою досягнення повної клінічної відповіді (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Сам по собі клас LN є менш надійним у інформуванні про результати, оскількифактори ризику розвитку хронічної хвороби нироквключатиклінічні особливостіі тому, що вони включають гістологічні особливості, які не охоплені визначеннями класу LN. Вони включають ступінь інтерстиціального фіброзу та тубулярної атрофії (IFTA) і специфічні гломерулярні ураження, такі як фібриноїдний некроз і фіброзні півмісяці.12 Кількісна оцінка вибраних і чітко визначених окремих уражень нирок може дати інформацію про прогноз. Це очевидно при нефропатії IgA, де оцінка мезангіальної клітинності, ендокапілярної гіперклітинності, сегментарного склерозу, тубулярної атрофії, інтерстиціального фіброзу та півмісяців для формування шкали MEST-C, як було показано, допомагає прогнозувати ризик.13–15 Запропоновані зміни до ISN Консенсусна класифікація LN /RPS 2003 може усунути ці недоліки6, але все ще базується на використанні морфології. Отже, існує потреба вивчити молекулярні шляхи в біопсії ЛН і зрозуміти, як вони пов’язані з класами ЛН16 17 та результатами лікування.18 19 З точки зору клінічної користі, транскриптомний аналіз біопсії нирки є найбільшим просунутий у діагностиці опосередкованого антитілами відторгнення нирки, де збільшення експресії транскриптів генів у біоптаті тканини було додано до валідованих морфологічних критеріїв20. Для визначення користі використання транскриптомних даних для покращення клінічної придатності нирок біопсії при СЧВ ми використали технологію NanoString для вивчення експресії 750 імунних і пов’язаних із запаленням транскриптів у фіксованих формаліном і залитих парафіном (FFPE) зрізах із 55 біопсій LN, 14 біопсій із хворобою тонкої базальної мембрани (TBM) та 9 біопсій із мембранозна нефропатія (МН).

МЕТОДИ

Зразки: Тканина біопсії нирки FFPE була отримана з архівних зразків LN, TBM і MN, надлишкових для клінічного використання, і де була доступна адекватна тканина для аналізу. Біопсії вовчака зі змішаними ураженнями або значними рубцями були виключені. TBM використовувався як контроль захворювання через відсутність нормальної біопсії нирок. Клінічні параметри були зібрані з медичних записів ретроспективно. Матриця оцінки інтерферону (IFN) була отримана, як повідомлялося раніше.21 Повну відповідь визначали як співвідношення білка/креатиніну в сечі (uPCR)<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% через 1 рік після біопсії. Часткова відповідь була визначена як uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

екстракція РНК

Шість цілих зрізів тканини товщиною 10 мкм було отримано за допомогою мікротому з кожного блоку FFPE після видалення двох зрізів 4 мкм. Щоб запобігти перехресному забрудненню, обладнання очищали за допомогою RNase Away між зразками, і для кожного зразка використовували нове лезо. Виділення РНК із цілої тканини проводили в той же день за допомогою набору RNeasy FFPE Kit (Qiagen, #73504), а концентрацію РНК оцінювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США; онлайн-додаткові дані S1).

Транскриптомний аналіз

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >подвійні (середнє +2 SD) зондів негативного контролю. Підрахунки були нормалізовані до середнього геометричного 10 генів домашнього господарства (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB і ZC3H14), відібраних у міру їх експресії в усіх типах зразків. Нормалізовані підрахунки для всіх зразків наведено в додаткових онлайнових даних S2.

Статистичний аналіз

Диференціальну експресію генів (DGE) проводили за допомогою швидкого/приблизного алгоритму розв’язувача розширеного аналізу (V.4), який використовує спрощену негативну біноміальну модель для всіх зондів, за винятком випадків, коли алгоритм не збігається та використовується метод лінійної регресії. LN, MN або клас LN (III, IV та V) використовувалися як незалежні змінні, а TBM як наша контрольна група. Порогову кількість було встановлено на рівні 100, а частоту спостережень у зразках встановлено на рівні 8%; Значення P було скориговано за допомогою методу Бенджаміні-Хохберга з порогом помилкового виявлення для встановленого на 0.05. Графіки вулканів створювали за допомогою пакета Enhanced Volcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) у R.22. Візуалізацію функціональної мережі білкових асоціацій проводили за допомогою бази даних STRING (https:// string-db.org/) , використовуючи повну мережу STRING. Краї мережі були визначені достовірністю, а для взаємодій було встановлено найвищий показник достовірності взаємодії (більше або дорівнює 0,9). Відключені вузли в мережах не відображалися. Значні диференційовано експресовані гени оцінювали для збагачення термінів генної онтології (GO) (біологічні процеси, молекулярні функції, клітинний компонент), шляхів реакції та кластерів локальної мережі STRING. Мережі візуальної взаємодії були згенеровані з функціональними збагаченнями в термінах GO (біологічні процеси) та аналізі STRING. Площа пропорційної діаграми Венна перекриття диференціально експресованих генів між підкласами LN була створена за допомогою BioVenn (www.biovenn. nl).23 Дані з розширеного програмного забезпечення аналізу було зчитано в статистичне середовище R, а візуалізація даних була виконана за допомогою коробкових графіків, аналізу головних компонентів, графіки вулканів і теплові карти. Теплові карти були створені з використанням Z-балів нормалізованих підрахунків і pheatmap у R. Кластери були проаналізовані за допомогою точного критерію Фішера. Для порівняння кількох груп використовували дисперсійний аналіз за допомогою тесту множинних порівнянь Сідака. Дані аналізували за допомогою GraphPad Prism (V.8.0).

Заява про залучення пацієнтів і громадськості (PPI).

Це дослідження було частиною консорціуму MASTERPLANS, і пацієнти-колеги брали участь у кожному напрямі роботи, включаючи це дослідження. PPI підготував глосарій термінів, щоб забезпечити подальшу взаємодію з ширшою спільнотою пацієнтів, а результати досліджень були включені в дні огляду непрофесіоналів. Рецензії публікацій непрофесіоналів розміщені на веб-сайті MASTERPLANS (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ДЛЯ НИРОК