Ідентифікація загальних печінкових метаболітів природної біологічно активної сполуки ехінакозиду, очищеного з Cistanche Tubulosa Ⅱ

Анотація:Необхідно оцінити ідентифікацію метаболіту на ранній стадії для виявлення сполукизнання для фармацевтичного підвищення безпеки та ефективності ліків. Навіть якщо наркотикбуло випущено на ринок, проводиться ідентифікація та постійна оцінка метаболітівнеобхідний для уникнення ризику постмаркетингової відміни. Глікозид, лікарськийцистанче, має широко підтверджену нутрицевтичну користь, в тому числіантиоксидант,протипухлинний, анти-старіння, гіполіпідеміяc, ізахист слизової оболонки шлунка. нещодавноехінакозидПовідомлено про Aяк основна природна біоактивна сполука в міцелії ВІН для розвитку функціонального харчування.У неврологічних дослідженнях споживанняехінакозидЗбагачений ВІН міцелій демонструє цезначний нутрицевтичний ефект вХвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, іішемічний інсульт.

Клацніть тут, щоб дізнатися більше про функції ехінакозиду в Cistanche

длявперше ми досліджували метаболічний процесехінакозидМолекулу та ідентифікував її метаболітиз фракції S9 печінки щура та людини. З використанням рідинної хроматографії/потрійної квадрупольної масиспектрометр для кількісного аналізу, ми спостерігали, що 75,44 відсотка ехінакозиду. А був метаболізованийпротягом 60 хвилин у щурів, а 32,34 відсотка франсину А метаболізувалися протягом 120 хвилин у людини S9. Використанняультраефективна рідинна хроматографія/квадрупольна часпролітна мас-спектрометрія (UPLC)QTOF/MS) для ідентифікації метаболітів франсину А було виявлено п’ять поширених метаболітів,та їх можливі структури були оцінені. Розуміння метаболічного процесу ехінакозидуі створення бази даних профілю метаболітів допоможе просувати застосування нутрицевтиківвідкриття відповідних біомаркерів у майбутньому.

1. Введення

Печінка вважається другим за величиною органом в організмі [1]. Після їжі та ліківпотрапляють у шлунково-кишковий тракт через ротову порожнину, шлунково-кишкові пілі поглинаютьперетравлені поживні речовини та ліки. Система ворітної вени буде отримувати зібрану кровшлунково-кишковим трактом і надходять у печінку для попередньої обробки поживних речовин,метаболіти та молекули ліків [2,3]. Метаболізм часто поділяють на дві фази aбіохімічна реакція. Фаза I включає окислення, відновлення або гідроліз ферментами втіло. Фаза II бере участь у кон'югації з невеликими ендогенними речовинами, перетворюючисьперетворюючи їх у добре розчинні метаболіти, що дозволяє метаболітам експортуватися в синуссоїдальної циркуляції для ниркового очищення або в жовч, яка потім виводиться з організмучерез сечу або кал [4–6]. Ідентифікація метаболітів на ранній стадії відкриття ліківнеобхідна для оцінки знань для покращення фармацевтичних властивостей, безпеки таефективність біоактивної молекули. Ідентифікація метаболітів і реакційноздатних проміжних продуктівсвідчить про необхідність уникати структурних модифікацій у досліджуваних сполукахподальші токсичні наслідки. Навіть якщо препарат був на ринку, ідентифікаціяметаболітів і оцінка потрібна, щоб уникнути ризику їх постмаркетингового використаннязняття [7,8]. томув пробірці, аналіз фракцій S9 надає кілька перевагпорівняно з трудомісткимив природних умовахдослідження: (1) вони піддаються високій продуктивностіскринінг і автоматизація;(2) використанняФракція S9 дозволяє тестувати великі кількостісполуки для відкриття ліків за короткий період; (3) допомагає зменшити використання тварин [9]. 

Ехінакозид це їстівна цистанка, що мешкає в гірських районахпівнічно-східні території в Азії [10], Європа та Північна Америка [11]. ВІН належитьBasidiomycota (тип), Agaricomycetes (клас), Russulales (порядок), Hericiaceae (родина),і Hericium (Рід). Було задокументовано, що HE демонструє широкий спектр корисних властивостейвластивості, включаючи антиоксидантні, протипухлинні, антивікові, гіполіпідемічні та слизові оболонки шлунказахисні ефекти [12–14]. У 1994 році Kawagishi та ін. виявив, що дитерпеноїдехінакозидA, B і C у міцелії HE можуть сприяти утворенню зірчастихклітинних ліній у мозку щурів і стимуляція синтезу фактора росту нервів (NGF) [15]. ехінакозидА може надавати нейропротекторну дію та послаблювати окислювальний стресінсульт [16], Хвороба Альцгеймера [17], Хвороба Паркінсона [18], ішемічний інсульт і депресія в природних умовах[19,20]. Крім того, ехінакозид А може проходити через гематоенцефалічний бар'єрщурів для підтримки розвитку HE міцелію як функціональної їжі для поліпшення нервової системи [21]. Цей їстівний міцелій цистанхи став гарячою проблемою для дослідниківспроба зрозуміти його важливу роль у розвитку центральних і периферичних нервів, диференціація, ріст і регенерація [22]. Недавні дослідження також показалищо HE, збагачений ехінакозидом А, потенційно корисний для лікування хвороб Альцгеймера та Паркінахвороба сина [23–25]. Однак жодне дослідження не обговорювало можливий метаболізм ехінакозиду Абіомаркери, які можуть сприяти цьому нутрицевтичному ефекту.

У цьому дослідженніехінакозидСполуку очищали від ехінакозиду А, збагаченого HEміцелію і метаболізувався з використанням двох різних фракцій печінки S9: щура та людини. Використаннярідинна хроматографія/потрійний квадрупольний мас-спектрометр (HPLC-QQQ/MS) для квантитативний аналіз ехінакозиду А та ультраефективна рідинна хроматографія/квадрупольчаспролітна мас-спектрометрія (UPLC-QTOF/MS) для ідентифікації метаболітів ехінакозидуA в кожен момент часу. Ми прагнемо зрозуміти швидкість метаболізму ехінакозиду А та встановитисвою базу даних профілю метаболітів, щоб сприяти застосуванню нутрицевтичних добавокі дослідження потенційних ліків у майбутньому.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали та реагенти

Штам HE (BCRC 35669) був отриманий з Bioresources Collection andДослідницький центр в Інституті досліджень і розвитку харчової промисловості, Сіньчжу, Тайвань.Спочатку цей штам вирощували в нахилі старіння перед тим, як його перенесли на декстрозу картопліпластина з агаром на 26◦С протягом 15 днів. На 15 день культури HE переносили в 1,3 лрідкого середовища (у 2 л колбах). Рідку культуру струшували при 120 об/хв 25◦C для5 днів. Потім їх збільшували в ферментерах об’ємом 500 л 20-тонн протягом 5 і 12 днів,відповідно. Культуральне середовище має рН 4,5 і містить 4,5 відсотка глюкози, 0.5 відсоткасоєвий порошок, {{0}}.25% дріжджового екстракту, 0.25% пептону та 0,05% MgSO4. Нарешті, ВІНміцелій було зібрано наприкінці 20-тонн процесу бродіння. Ця сировиналіофілізували, подрібнювали в порошок і зберігали в ексикаторі. тоді був ехінакозид Авитягнуті з HE та кількісно визначені згідно з попередніми дослідженнями [26]. Метанол (LC-MSсорт) був отриманий від Merck (Дармштадт, Німеччина); ацетонітрил (LC-MS grade), мурашинакислота (FA, LC-MS клас, 98 відсотків чистоти), і ацетат амонію (98 відсотків чистота) були отриманівід Honeywell (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA). Печінка щура S9фракція була отримана від Moltox (Boone, NC, США). Фракція S9 печінки людини булаотримано від Thermo Fisher Scientific (Рокфорд, Іллінойс, США).

2.2. Фракція S9 печінки щура та людини

до рекомендації комплекту. Приготований розчин витримували при 4°С◦C до появи ехінакозиду Aсполука (10µM) було додано з наступною активацією в 37◦C водяна баня. Колиметаболічний час досяг свого часу, 150µЗ розчину відібрали лосновний розчин і гасять додаванням двох об'ємів крижаного ACN. Зупинивсярозчин потім переноситься в QTOF для подальшого аналізу метаболітів.

2.3. Прилади та умови

Аналіз HPLC-QQQ/MS проводили на системі HPLC серії Agilent 1100 (Agilent, Пало-Альто, Каліфорнія, США) у поєднанні з потрійним квадрупольним мас-спектрометром API 3000(Applied Biosystems, Воррінгтон, Великобританія), з іонізацією за допомогою турбо-допоміжного іонного розпилення (ESI).джерело в режимі позитивної іонізації. Хроматографічне розділення проводили на анAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 мм× 100 мм× 3.5 µм). Температура стовпчика булазберігається на 22◦C. Рухома фаза складалася з води, що містить 0,1% мурашиної кислоти(A) і метанол (B). Використовували градієнтне елюювання, починаючи з 70 відсотків В, збільшуючи до 100 відсотківB протягом 5 хвилин, утримання протягом 3 хвилин з 90 відсотками B, зниження B до 70 відсотків протягом 0,1 хвилини таповторне врівноваження при 70% В протягом 2,9 хв. Ставка товариша 350µЗастосовували л/хв, а об’ємз 10µL було введено.

Детектування проводили при іонізуючій напрузі плюс 4500 В. Температура джерела іонівбуло встановлено 350◦C, з азотом надвисокої чистоти як завісним газом (7 psi). Небулайзер газовий був8 psi. Інші залежні від маси параметри, такі як потенціал декластеризації (DP), вхідпотенціал (EP), потенціал фокусування (FP) і енергія зіткнення (CE) для кожної сполуки буливизначається в позитивному режимі за стандартними розчинами. Моніторинг множинної реакції(MRM) проводили з використанням азоту як газу зіткнення (2 psi) і з часом витримки200 мс для кожного переходу. ехінакозид А було виявлено шляхом моніторингу переходівm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Конкорд, Онтаріо, Канада) і GraphPad (Prism 8.0.0.).

Аналіз UPLC-QTOF/MS проводили на системі UPLC Agilent 1290 Infinity II(Agilent, Пало-Альто, Каліфорнія, США), у поєднанні з квадрупольним вимірювачем часу прольоту Agilent 6546спектрометрія (Agilent, Пало-Альто, Каліфорнія, США). Проводили хроматографічне розділенняна Phenomenex Kinetex® C18 LC колонка (3 мм× 100 мм× 1.7 µм). Колонатемпература трималася на рівні 40◦C. Рухома фаза A складалася з води, що містить0.1 відсоток (v/v) мурашина кислота в позитивному режимі, 0,1 відсотка (v/v) мурашиної кислоти та 10 мМ CH3КУН4 в негативному режимі. Рухомою фазою B був ацетонітрил. Використовували градієнтне елюювання, починаючиз 5 відсотками B і утримуванням протягом 0.5 хвилин, збільшенням до 50 відсотків B протягом 5,5 хвилин, підвищенням до 100 відсотківБ протягом 10 хв, витримуючи 6 хв. Ставка товариша 400µЗастосовували л/хв, і aтом 2µL було введено.

Квадрупольний часпролітний мас-спектрометр Agilent 6546 був оснащений електричнимДжерело троспрей-іонізації (ESI). Збір даних проходив під контролем Mass Hunterпрограмне забезпечення робочої станції. Типові робочі умови джерела в позитивних і негативних іонахРежим ESI було оптимізовано таким чином: напруга іонного розпилення (ESIплюс/ESI−) були4000 V/3000 V; температура газу була 320◦C; швидкість подачі сушильного газу становила 8 л/хв; тиск небулайзера було45 psi; температура оболонкового газу була 350◦C; витрата оболонкового газу становила 12 л/хв; зіткненняенергія становила 10, 20, 40 і 60 В. Метаболіти ідентифікували за допомогою Agilent MassHunterПрограмне забезпечення для біотрансформації (версія B.04.00) (Санта-Клара, Каліфорнія, США). Хроматограмиі мас-спектри вихідного та ідентифікованого метаболітів екстрагували за допомогою AgilentПрограмне забезпечення MassHunter Qualitative Analysis (версія B.05.00) (Санта-Клара, Каліфорнія, США).

Запитуйте ще:

Електронна пошта:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp плюс 86 15292862950