Гіпоксичні позаклітинні везикули, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин, полегшують нирковий фброз після ішемії–реперфузії, відновлюючи опосередковане CPT1A окислення жирних кислот

Анотація

1. Фон

Фіброз нирок є поширеним патологічним процесом хронічних захворювань нирок, спричинених багатьма факторами. Гіпоксична попередня обробка мезенхімальних стовбурових клітин може підвищити ефективність секретованих позаклітинних везикул (MSC-EV) при різних захворюваннях, але неясно, чи можуть вони краще покращити нирковий фіброз. Останні дослідження показали, що відновлення окислення жирних кислот (FAO) може зменшити фіброз нирок. У цьому дослідженні ми мали на меті перевірити, чи може попередня гіпоксична обробка позаклітинними везикулами MSC (Hypo-EVs) покращити FAO для відновлення ниркового фіброзу та дослідити основний механізм.

2. Методи

Hypo-EV були виділені з MSC, отриманих із плаценти людини, попередньо оброблених гіпоксією (hP-MSC), а Norm-EV були виділені з hP-MSC, культивованих у нормальних умовах. Ми використовували модель фіброзу нирок, індукованого ішемією-реперфузією (I/R) in vivo. Мишам вводили PBS, Hypo-EVs або Norm-EVs відразу після операції та на 1-й день після операції. Для оцінки пошкодження нирок оцінювали функцію нирок, патологію нирок і фіброз нирок. Для механістичного дослідження окислення жирних кислот (FAO), мітохондріальні морфологічні зміни, виробництво АТФ і мітохондріальні масові білки були виявлені in vivo. Потенціал мітохондріальної мембрани та виробництво активних форм кисню (АФК) досліджували in vitro.

3. Результати

Ми виявили, що Hypo-EV надають чудовий терапевтичний ефект на відновлення пошкодженої ниркової структури, відновлення функції нирок і зменшення фіброзу нирок. Тим часом Hypo-EV посилили мітохондріальну ФАО в нирках, відновивши експресію основного ферменту карнітинпальмітоілтрансферази 1А (CPT1A), що обмежує швидкість ФАО. Механічно поліпшення мітохондріального гомеостазу, що характеризується відновленням мітохондріальної структури, відновленням мітохондріальної маси та виробництва АТФ, пригніченням окисного стресу та підвищенням потенціалу мітохондріальної мембрани, частково пояснює вплив Hypo-EV на покращення мітохондріальної FAO і, таким чином, послаблення I/ R пошкодження.

4. Висновки

Hypo-EVs пригнічують нирковий фіброз шляхом відновлення CPT1A-опосередкованої мітохондріальної ФАО, що може бути досягнуто шляхом регуляції мітохондріального гомеостазу. Наші висновки забезпечують додаткову підтримку механізму для розробки безклітинної терапії фіброзу нирок.

5. Ключові слова

Мезенхімальні стовбурові клітини, гіпоксичні, позаклітинні везикули, мітохондріальні, окислення жирних кислот, фіброз нирок.

Натисніть тут, щоб придбати добавку Cistanche

вступ

Хронічна хвороба нирок (ХХН) – важке захворювання, яке загрожує здоров’ю людини, а також є важливою глобальною суспільною проблемою. Глобальна захворюваність, поширеність і смертність від ХХН є значними та зростають, і поширеність становить приблизно 10 відсотків серед дорослих у всьому світі [1, 2]. Ниркове ішемічно-реперфузійне (І/Р) пошкодження асоціюється з фіброзом нирок і прогресуючою ХХН [3, 4]. Фіброз нирок вважається поширеним патологічним процесом, який призводить до ХХН і термінальної стадії ниркової недостатності. Однак на даний момент не існує ефективних методів лікування, які б успішно запобігали або зменшували фіброз [5].

Повідомлялося, що позаклітинні везикули, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин (MSC-EV), відіграють регенеративну та антифіброзну роль у кількох доклінічних моделях ХХН [6–9]. Однак низький вихід MSC-EV є обмежуючим фактором для широкомасштабного виробництва безклітинної терапії [10]. Прекондиціонування гіпоксії стимулює паракринну активність МСК і збільшує функцію та виробництво EVs і вважається інженерним підходом для покращення терапевтичного потенціалу EVs [11, 12]. Нещодавнє дослідження показало, що MSC, попередньо кондиціоновані гіпоксією, є більш значущими, ніж неліковані MSC, у запобіганні ниркового фіброзу та запалення [13]. Однак роль EV, отриманих від гіпоксії, у фіброзі нирок, ще не встановлена.

Патологічний механізм ниркового фіброзу розглядався в багатьох останніх дослідженнях [14–16], зокрема в області метаболічної регуляції [17]. Добре відомо, що проксимальні тубулярні клітини (ПТК) є найбільш енергоспоживаючими клітинами в нирці та відіграють центральну роль у прогресуванні тубулоінтерстиціального фіброзу [18, 19]. Основним джерелом енергії ПТК є окислення жирних кислот (FAO) [19, 20]. Результати загальногеномних досліджень транскриптомів показали, що експресія пов’язаних з ФАО ключових метаболічних ферментів і регуляторів транскрипції була помітно знижена в моделях людей і мишей з тубулоінтерстиціальним фіброзом [20]. Крім того, відновлення метаболізму жирних кислот може захистити мишей від тубулоінтерстиціального фіброзу [17, 20]. Нещодавнє дослідження підтвердило, що надмірна експресія ключового лімітуючого ферменту карнітин-пальмітоіл-трансферази 1A (CPT1A) може посилити FAO в епітеліальних клітинах ниркових канальців, зменшити експресію медіаторів запалення та призвести до значного полегшення фіброзу в трьох експериментальних моделях [21]. ]. Таким чином, ФАО-цільова терапія може бути потенційно ефективною терапевтичною стратегією для зменшення фіброзу.

Мітохондрії відіграють незамінну роль у регулюванні ФАО. Попереднє дослідження показало, що астрагалозид IV може посилити ФАО, регулюючи активність мітохондрій під час старіння [22]. Руйнування мітохондріального гомеостазу відіграє важливу роль у ранньому пошкодженні ниркової хвороби, аномальному відновленні після пошкодження та патогенезі ХХН [23, 24]. У фізіологічних і патологічних умовах різні механізми координуються для підтримки мітохондріального гомеостазу, включаючи антиоксидантний захист, відновлення мітохондріальної ДНК, злиття та поділ мітохондрій, мітохондріальну аутофагію та мітохондріальний біогенез [25]. Декілька досліджень показали, що MSC-EV можуть послабити пошкодження мітохондрій шляхом стабілізації мітохондріальної ДНК [26], інгібування мітохондріального поділу та стимулювання антиоксидантного захисту мітохондрій і виробництва аденозинтрифосфату (АТФ) у моделях гострого ураження нирок (ГНН) [27, 28] . Попередні дослідження показали, що лікування Hypo-EVs мало кращий вплив на стимулювання ангіогенезу, проліферації та міграції, а також пригнічення запалення та апоптозу, ніж лікування Norm-EVs [29–31]. Тим не менш, дослідники остаточно не визначили, чи залежать терапевтичні результати застосування Hypo-EV при фіброзі від мітохондріального гомеостазу.

Цілі цього дослідження полягали в тому, щоб (1) дослідити, чи має гіпоксична попередня обробка позаклітинних везикул, отриманих з МСК (Hypo-EV), кращий антифіброзний ефект; (2) визначити, чи Hypo-EV полегшують фіброз, індукований ішемією, реперфузією, посилюючи CPT1A-опосередковану FAO; (3) перевірити, чи пов’язаний захисний ефект Hypo-EV на FAO з регуляцією мітохондріального гомеостазу.

Порошок цистанчі

методи

1. Культура клітин і прекондиціонування гіпоксії

MSC, отримані з плаценти людини (hP-MSC), були надані Інститутом фондів Китайської академії медичних наук і культивовані в середовищі Dulbecco Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, Gibco) з 10 відсотками фетальної сироватки великої рогатої худоби (FBS, Corning) з додаванням 100 ОД/мл пеніцилін-стрептоміцину (Gibco) і підтримуваної при 37 градусах у зволоженій атмосфері 5 відсотків CO2. Після того, як hP-MSC досягли 60–70 відсотків конфлюентності, культуральне середовище було замінено FBS з виснаженим екзосомами (SBI, 50A-1) і культивовано при 37 градусах, 5 відсотках CO2, 21 відсотку O2 або при 1 % O2, 94 % N2 і 5 % CO2 протягом додаткових 48 годин. Потім було зібрано середовище для виділення EVs, і EVs, зібрані під час попередньої обробки гіпоксією MSC (1 відсоток O2), були названі Hypo-EVs, а нормальні MSC (21 відсоток O2) назвали Norm-EVs. Для подальших експериментів використовували лише hP-MSC з пасажів 6–10.

2. Культивування та лікування клітин

Клітини проксимального тубулярного епітелію нирок людини (HK-2, ATCC, США) культивували в DMEM/F12 з 10% FBS і доповнювали 100 ОД/мл пеніцилін-стрептоміцину. Клітини підтримували при 37 градусах у зволоженій атмосфері, що містить 5 відсотків CO2. Ми використовували два підходи для імітації ХХН in vitro. Модель клітинної гіпоксії/реоксигенації (H/R) проводили, як повідомлялося раніше [32]. Коротко, клітини HK-2 піддавали дії гіпоксичного стану (37 градусів, 1 відсоток O2, 94 відсотки N2 і 5 відсотків CO2) протягом 12 годин у середовищі без вмісту глюкози та сироватки, щоб викликати гіпоксичне пошкодження. Згодом середовище було замінено, і клітини були поміщені в нормальні умови (21 відсоток O2) для реоксигенації на 24 години. Контрольну групу культивували в нормальних умовах (21 відсоток O2) відповідно до плану експерименту. Інший метод полягав у інкубації клітин HK-2 з трансформуючим фактором росту бета-1 (TGF- 1) у кінцевій концентрації 10 нг/мл протягом 48 годин, як повідомлялося раніше [13]. Під час реоксигенації або стимуляції TGF- 1- до клітин додавали Norm-EV або Hypo-EV (100 мкг/мл живильного середовища).

3. Ізоляція та ідентифікація MSC‑EV

EV, отримані з MSC, були виділені за допомогою методу диференціального ультрацентрифугування. Коротко, культуральне середовище центрифугували при 4 градусах таким чином: 500×g протягом 10 хвилин, при 2,000×g протягом 20 хвилин і 10,000×g протягом 30 хв. Середовище фільтрували через фільтр 0.22-мкм перед ультрацентрифугуванням при 100000×g протягом 2 годин. Нарешті, гранули EV ресуспендували в PBS і ультрацентрифугували протягом додаткових 2 годин, щоб видалити забруднені білки, а потім очищені EV збирали в PBS і зберігали при -80 градусах для подальшого використання. Концентрацію білка в Norm-EVs і Hypo-EVs досліджували за допомогою аналізу білка біцинхонінової кислоти (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Типова сферична двошарова мембранна структура EV спостерігалася за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ). Вестерн-блоттинг використовувався для перевірки якості EV, а розподіл розмірів EV досліджувався методом динамічного розсіювання світла (DLS).

Цистанка трубчаста

4. Досліди на тваринах

Самці мишей C57BL/6 SPF (віком 7–9 тижнів) були надані Sibeifu Experimental Animal Science and Technology (Пекін, Китай) і отримували адаптивне годування протягом 4 днів у тваринницькому центрі китайської PLA General Hospital перед експериментом. Мишей випадковим чином розділили на чотири групи: контроль, фосфатно-сольовий буфер (PBS), групи Norm-EVs і Hypo-EVs. Мишей груп PBS, Norm-EVs і Hypo-EVs піддавали ішемії-реперфузії нирок, як описано раніше [33, 34]. Коротко, мишей анестезували пентобарбіталом (50 мг/кг) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції. Дорсальне волосся над ниркою миші очищали, а потім оголювали двосторонні судини ниркової ніжки. Для індукування ішемії нирки ліву ниркову артерію перетискали нетравматичним судинним затискачем на 30 хв і одночасно видаляли праву нирку. Після цього реперфузію ініціювали відпусканням затискача. Нирки спостерігали протягом 5 хв, щоб переконатися в реперфузії після зняття затискача. Температура операційного столу та кімнати під час операції підтримувалася на рівні 37 градусів. У моделях лікування 100 мкг Norm-EVs або Hypo-EVs у 0,15 мл розчинника PBS вводили шляхом ін’єкції в хвостову вену одразу після операції та на 1-й день (D) після операції в групах Norm-EVs та Hypo-EVs відповідно. Такий самий об’єм PBS вводили шляхом ін’єкції в хвостову вену в групі PBS. Мишей вбивали на 2, 7 і 14 днях після операції (рис. 1а).

5. Інтерналізація MSC‑EV

Перевірити, чи можуть EV бути інтерналізовані пошкодженими нирками. Для позначення EV проводили флуоресцентне фарбування Dil (Yeasen). Te Norm-EV або Hypo-EV (200 мкг), які були розчинені в 100 мкл PBS, інкубували з 4 мкМ Dil при 37 градусах протягом 1 години. Потім незв'язані барвники видаляли за допомогою екзосомної спинової колонки (Invitrogen). Di/Norm-EVs і Dil/Hypo-EVs були суспендовані в PBS для подальшого використання. Dil/Norm-EVs або Dil/HypoEVs (100 мкг) внутрішньовенно вводили мишам моделі ішемічно-реперфузійного ушкодження (I/R) через хвостову вену одразу після операції та на D 1 після операції, як зазначено вище. У дні 1, 3, 5 і 7 мишей відразу знімали за допомогою програми Living Image Software 4.4 (PerkinElmer). Більше того, нирки збирали та спостерігали за допомогою системи оптичної візуалізації на D 7. Усі сигнали біолюмінесцентної візуалізації (BLI) вимірювали за середнім значенням яскравості областей інтересу (ROI).

6. Трансмісійний електронний мікроскоп (ТЕМ)

Загалом 1 мм3 ниркової тканини фіксували в 2,5% глутаровому альдегіді (рН 7,4) при 4° протягом 24 годин. Потім тканину фіксували 1% осмієвою кислотою протягом 2–3 год, зневоднювали ацетоном і етанолом і заливали епоксидною смолою. Після цього на ультрамікротомі готували ультратонкі зрізи товщиною 60 нм, які потім фарбували 3-відсотковим уранілацетатом і цитратом свинцю. Нарешті, розріз спостерігали під ТЕМ (Японія).

7. Аналіз функції нирок

Зразок крові збирали з хвостової вени на D 3, і рівні азоту сечовини крові (BUN) у мишей перевіряли за допомогою відповідного набору (біологічний аналіз).

8. Гістопатологічна оцінка нирок

Тканини нирок фіксували в 10% формаліні протягом 48 годин, заливали в парафін, нарізали товщиною 3 мкм, фарбували реагентами для фарбування Массона за стандартним протоколом і спостерігали за допомогою мікроскопа (Olympus, Токіо, Японія). Відсоток площі відкладення колагену розраховували за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Було щонайменше 10 випадкових полів, які не перекривалися, на кожну тварину для оцінки.

9. Імуногістохімія

Залиті парафіном ниркові зрізи попередньо обробляли за допомогою термічного вилучення антигену з натрій-цитратним буфером (рН 6, розчин для вилучення епітопу 1) протягом 20 хвилин з подальшою інкубацією з первинними антитілами протягом ночі при 4°C. Потім зрізи інкубували з біотинільованим вторинним антитілом, і 3,3'-діамінобензидин (DAB) використовували як хромоген. Потім зрізи контрастно фарбували гематоксиліном і спостерігали за допомогою оптичного мікроскопа. Використані первинні антитіла були такими: CPT1A (ab128568, Abcam) і Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Імунофлюоресценція

Клітини або тканини пермеабілізували 0.2% Triton X-100 протягом 5 хвилин, блокували овечою сироваткою протягом 30 хвилин та інкубували з актином гладких м’язів (-SMA, 1:200, 55135, Proteintech) або антитіло до колагену I (1:100, ab270993, Abcam) протягом 16–18 годин при 4 градусах з подальшою інкубацією з Cy3-кон’югованим вторинним антитілом (червоним) при кімнатній температурі протягом 1 години. Ядра контрастно фарбували DAPI. Флуоресцентне фарбування зрізів тканини було зображено за допомогою конфокальної флуоресцентної мікроскопії.

11. Вестерн-блот аналіз

Нирки, клітини або гранули EVs лізували в буфері для лізису радіоімунного аналізу преципітації (RIPA), що містить фенілметилсульфонілфторид (PMSF), і суспензію супернатанту, отриману після центрифугування, вимірювали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Thermo Fisher Scientific). Зразки білка такої ж якості (20 мкг/доріжку) додавали до 10- або 12-відсоткового додецилсульфату натрію-поліакриламідного гелю (SDS-PAGE), а потім переносили з SDS-PAGE гелів на мембрани. Мембрану блокували протягом 2 годин при кімнатній температурі 1X розчином казеїну, а потім інкубували з первинними антитілами при 4 градусах проти таких білків: -SMA (ab7817, Abcam), віментин (ab92547, Abcam), гліцеральдегід 3- фосфатдегідрогеназа (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), актин (20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), сукцинатдегідрогеназний комплекс залізо сірка субодиниця B (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), субодиниця цитохром-с-оксидази IV (COXIV, ab202554, Abcam) і ATPB (17247-1-AP, Proteintech). Потім мембрану інкубували з відповідним вторинним антитілом протягом 1,5 годин при кімнатній температурі та тричі промивали. Зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

12. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (RT-qPCR)

Спочатку РНК екстрагували з лізованих клітин або ниркової тканини за допомогою реагенту Trizol (Invitrogen), а потім РНК синтезували до кДНК згідно з інструкціями виробника за допомогою набору ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Кількісну полімеразну ланцюгову реакцію в режимі реального часу проводили за допомогою SYBR Select Master Mix (Life Technologies) і системи виявлення RT-qPCR (ABI). Синтезовано праймери для наступних генів: PPAR прямого TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, зворотного GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 вперед AATGCAGCGGTCTTAGCACT, реверс CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, реверс CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 вперед CATCGT ACCCACCATGCACT, реверс CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, 18S AGCTATCAATCTGTCAATCCT GTC, реверс GCT TAATTTGACTCAACACGGGA, а експресію кожного цільового гена нормалізували за допомогою гена 18S і розраховували за 2−ΔΔCT метод.

13. Вимірювання мембранного потенціалу мітохондрій

Потенціал мітохондріальної мембрани (ММР) було виявлено за допомогою JC-1 (Beyotime). Спочатку робочий розчин для фарбування JC-1 був отриманий шляхом додавання 8 мл надчистої води на кожні 50 мкл JC-1 (200X), який інтенсивно перемішували для повного розчинення, а потім 2 мл JC{{ Додано 7}} буфер для фарбування (5X). По-друге, клітини в шестипоровому планшеті двічі промивали PBS, а потім додавали 1 мл робочого розчину для фарбування JC-1 і залишали на 20 хвилин при 37°C. Нарешті клітини знову промивали PBS і додавали 2 мл розчину культури клітин. Візуалізовані зображення були отримані за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

Цистанхе капсули

14. Виявлення мітохондріальних активних форм кисню (АФК).

Генерацію АФК у мітохондріях вимірювали за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). Додавали робочий розчин реагенту MitoSOX (2.0 мл, 5 мкМ), щоб покрити клітини в шестипорових планшетах, після чого фарбували MitoSOX Red протягом 10 хвилин при 37 градусах. Потім клітини тричі промивали PBS, а візуалізовані зображення отримували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

15. Виявлення АТФ

Виробництво АТФ визначали за допомогою набору Enhanced ATP Assay Kit (Beyotime, Китай, кат. №: S0027) згідно з протоколом виробника.

16. Статистичний аналіз

Кількісну оцінку та графіки аналізували за допомогою GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, США) і представляли як середнє ± стандартна помилка середнього. Відмінності між кількома групами аналізували за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA), а статистичну значущість встановлювали на рівні P < 0.05.

Обговорення

У цьому дослідженні ми зосередилися на FAO при фіброзі нирок і визначили метаболічні ферменти (CPT1A) і регулятори транскрипції (PGC1, PPAR) FAO, які показали, що Hypo-EVs можуть усунути порушення метаболізму жирних кислот у фіброзній нирці, викликане I /Р. Крім того, ми виявили, що Hypo-EVs справляють глибокий вплив на CPT1A-опосередковану FAO, що частково пояснюється регуляцією мітохондріального гомеостазу.

Останніми роками зростає кількість досліджень, які повідомляють про нирковий захисний ефект MSC-EVs in vivo на моделях ХХН, і невелика кількість доступних даних продемонструвала, що EVs перевершують або однаково ефективні в ренопротекції порівняно з їхніми вихідними MSC [43]. . Лікування MSC-EVs при ХХН знаходиться на початковому етапі, і складний механізм не був повністю продемонстрований. ГПН є одним із основних факторів ХХН, що призводить до кінцевої стадії ниркової недостатності [44], а ниркове ураження І/Р є основним фактором ГПН, тому ми вибрали модель індукованого І/Р фіброзу, щоб розкрити потенційний молекулярний механізм, який як MSC-EV запобігає фіброзу нирок.

Низький вихід MSC-EV є обмежуючим фактором для широкомасштабного виробництва безклітинної терапії. Таким чином, були вивчені різні потенційні підходи до збільшення виходу EVs, включаючи оптимізацію умов культивування MSC, тривимірних каркасів на основі позаклітинного матриксу та регулювання біогенезу EVs [10]. Серед них гіпоксичне кондиціонування MSC є дійсним методом посилення ефекту лікування EV при різних захворюваннях, таких як загоєння переломів кісток [30], загоєння діабетичних ран [29] і відновлення міокарда [45]. Наше дослідження надає докази посиленої гіпоксією дії EV, що секретуються MSC. Більше того, ми також показуємо, що EVs, отримані з гіпоксичних прекондиціонованих MSC, мають більший антифіброзний та нирковий захисний ефект, ніж Norm-EVs у ХХН, індукованих I/R. Дані про мікроРНК у Hypo-EV порівняно з Norm-EV були добре повідомлені. Численні дослідження показали, що вміст мікроРНК був відповідальним за сприятливі ефекти Hypo-EV при багатьох захворюваннях [30, 46]. Порівняно з Norm-EVs, 215 мікроРНК було активовано, а 369 мікроРНК знижено в жирових Hypo-EVs, які головним чином регулюють клітинний метаболізм, диференціацію та функцію TGF [29]. Однак механізм, за допомогою якого Hypo-EVs регулюють функцію метаболізму, залишається недостатньо вивченим при ХХН. Велика кількість літератури вказує на те, що FAO знижується при фіброзі нирок і сприяє його патогенезу [47]. Відповідно до звітів, наше дослідження показало, що експресія генів пов’язаних з FAO ключових метаболічних ферментів (CPT1A, CPT2 і ACOX2) і регуляторних факторів транскрипції FAO (PPAR і PGC1) була помітно знижена при фіброзі нирок, індукованому I/R.

Крім того, відновлення ліпідного обміну є потенційною стратегією лікування фіброзу нирок [48]. Надмірна експресія CPT1A в ниркових канальцях є суттєвим внеском у посилення функції FAO та призводить до захисту ниркової функції та фіброзу шляхом запобігання мітохондріальній дисфункції, диференціації TEC та запаленню на моделях ХХН на тваринах [21]. Наші дані показали, що Hypo-EVs можуть повністю повернути пошкоджену FAO при I/R-індукованому фіброзі, що свідчить про те, що терапевтичні ефекти Hypo-EVs при фіброзі нирок частково є результатом відновлення FAO.

Порушення ниркової сигналізації PPAR знижувало активність шляху FAO та посилювало розвиток фіброзу нирок [49]. Застосування фенофібрату, агоніста PPAR, відновлювало дефект окиснення жиру та тубулоінтерстиціальний фіброз при ХХН [50, 51]. PGC-1 є коактиватором PPAR у транскрипційному контролі ємності мітохондріальної ФАО [39]. Ми досліджували, чи можуть HypoEV посилити передачу сигналів PPAR і відновити FAO при пошкодженні I/R. Наші результати показали, що не було очевидних відмінностей у експресії PGC-1 і PPARa між Norm-EV і Hypo-EV. Тому повинні бути й інші фактори, що сприяють виникненню цього процесу. Мітохондрії є джерелом енергії для ФАО, яка генерує енергію для клітини [52]. Мітохондріальна дисфункція є критичною в патогенезі фіброзу нирок [53]. Відновлення мітохондріального гомеостазу стало багатообіцяючою терапевтичною стратегією для запобігання пошкодження нирок і прискорення відновлення нирок [25]. Нещодавні дослідження показали, що MSC-EV мають захисну дію на пошкодження мітохондрій, спричинене AKI, що захищає TEC від інсульту шляхом зменшення фрагментації мітохондрій, нормалізації потенціалу мітохондріальної мембрани та відновлення делеції мтДНК і мітохондріальних дефектів OXPHOS [26, 27]. Наші результати показали, що лікування Hypo-EV відновило аномальний зсув мітохондріальної морфології, збільшило масу мітохондрій і покращило функцію мітохондрій у фіброзних нирках. Наші висновки показують, що ефект Hypo-EVs на FAO може бути досягнутий шляхом регулювання мітохондріального гомеостазу.

У нашому дослідженні є деякі обмеження. Наприклад, наші дані демонструють, що Hypo-EVs мають кращий антифіброзний ефект у мишей з травмою I/R, ніж Norm-EV. Однак ми не визначили диференціальну експресію вмісту між Norm-EV і Hypo-EV, а також не оцінили конкретний спосіб, яким Hypo-EV впливають на мітохондріальний гомеостаз у цьому дослідженні.

Переваги Cistanche

Висновки

Підсумовуючи, наші дані вказують на те, що Hypo-EV значною мірою пригнічують нирковий фіброз шляхом відновлення CPT1Amediated FAO, і цих ефектів можна досягти шляхом регулювання мітохондріального гомеостазу. Наші висновки забезпечують подальшу механічну підтримку для розробки безклітинної терапії фіброзу нирок.

Список літератури

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Хронічна хвороба нирок. Ланцет. 2021;398(10302):786–802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Analysis of the Global Burden of Disease study highlights the global, regional, and national тенденції епідеміології хронічної хвороби нирок з 1990 по 2016 рр. Kidney Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ронко К., Белломо Р., Келлум Д.А. Гостре ураження нирок. Ланцет. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Hippo-YAP/MCP-1 опосередковане тубулярне дезадаптивне відновлення сприяє запаленню при невдалому відновленні нирок після ішемічний ГПН. Смерть клітин Dis. 2021; 12 (8): 754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Визначення терапевтичних цілей для фіброзу нирок: використання біології патогенезу. Біомед Фармакотер. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Позаклітинні везикули, вироблені мезенхімальними стовбуровими клітинами кісткового мозку, послаблюють нирковий фіброз, частково шляхом інгібування шляху RhoA/ROCK, у моделі UUO щурів. Стовбурові клітини Res Ther. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Позаклітинні везикули, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин, полегшують пошкодження нирок при нефропатії аристолохієвої кислоти . Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. Позаклітинні везикули, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин, для порятунку при пошкодженні нирок. Int J Mol Sci. 2021; 22 (12): 6596.

9. Huang Y, Yang L. Мезенхімальні стовбурові клітини та позаклітинні везикули в терапії захворювань нирок. Стовбурові клітини Res Ther. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Farmer D, Wang A. Розробка мезенхімальних стовбурових клітин для покращення їхньої екзосомної ефективності та продуктивності для безклітинної терапії. J Позаклітинні везикули. 2018; 7 (1): 1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Гіпоксія та позаклітинні везикули: огляд методів, везикулярного вантажу та функцій. J Позаклітинні везикули. 2020; 10 (1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Мезенхімальні стовбурові клітини, зумовлені гіпоксією, у застосуванні регенерації тканин. Tissue Eng Part B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Мезенхімальні стовбурові клітини, підготовлені до гіпоксії, запобігають нирковому фіброзу та запаленню при ішемії-реперфузії щури. Стовбурові клітини Res Ther. 2020; 11 (1): 130.

14. Панізо С, Мартінес-Аріас Л, Алонсо-Монтес С, Канната П, Мартін-Карро Б, Фернандес-Мартін Дж.Л., Навес-Діас М, Каррільо-Лопес Н, Канната-Андіа Дж.Б. Фіброз при хронічній хворобі нирок: патогенез і наслідки. Int J Mol Sci. 2021; 22 (1): 408.

15. Хамфріс Б.Д. Механізми фіброзу нирок. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Націлювання на фіброз нирок: механізми та системи доставки ліків. Adv Drug Deliv Rev. 2018; 129: 295–307.

17. Чжао X, Кван JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Націлювання на метаболічну дисрегуляцію для терапії фіброзу. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Епітеліальні клітини ниркових канальців: знехтуваний медіатор тубулоінтерстиціального фіброзу після травми. Смерть клітин Dis. 2018;9(11):1126.

19. Гевін Л.С. Фіброз нирок: первинність проксимального канальця. Matrix Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Дефектне окислення жирних кислот у епітеліальних клітинах ниркових канальців відіграє ключову роль у розвитку фіброзу нирок. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Мігель V, Тітуана Дж., Ерреро Дж. І., Ерреро Л., Серра Д., Куевас П., Барбас К., Пуйоль Д. Р., Маркес-Експозіто Л., Руїс-Ортега М., Кастільо К., Шенг Х, Суштак К., Руїс-Канела М. Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Надекспресія Cpt1a ниркових канальців захищає від фіброзу нирок шляхом відновлення мітохондріального гомеостазу. J Clin Invest. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Астрагалозид IV покращує метаболізм жиру в печінці старіючих мишей шляхом націлювання на мітохондріальну активність. J Cell Mol Med. 2021; 25 (18): 8863–76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Мітохондріальна енергетика в нирці. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Мітохондріальна дисфункція та перехід AKI до ХХН. Am J Physiol Renal Physiol. 2020; 319 (6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Мітохондріальний контроль якості при пошкодженні та відновленні нирок. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299–318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Мезенхімальні стовбурові клітини позаклітинних везикул послаблюють мітохондріальне пошкодження та запалення шляхом стабілізації мітохондріальної ДНК. ACS Nano. 2021;15(1):1519–38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. In vivo tracking of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles improving мітохондріальна функція при ішемічно-реперфузійному пошкодженні нирок. ACS Nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Мезенхімальні стромальні клітини, отримані позаклітинними везикулами, полегшують гостре ішемічно-реперфузійне пошкодження нирок шляхом інгібування мітохондріального поділу через miR-30. Стовбурові клітини Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Екзосоми, отримані з жирової клітини гіпоксії, сприяють високоякісному загоєнню діабетичної рани, включаючи активацію шляхів PI3K/Akt. J Нанобіотехнології. 2021; 19 (1): 202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Гіпоксичні екзосоми, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин, сприяють загоєнню переломів кісток шляхом передачі miR{{2} }. Акта Біоматер. 2020; 103: 196-212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Гіпоксична попередня обробка малих позаклітинних пухирців опосередковує відновлення хряща при остеоартриті шляхом доставки miR{ {1}}a-5стор. Акта Біоматер. 2021; 122: 325-42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Inhibition of Disruptor of Telomeric Silencing 1-Like Alleviated Renal Ischemia and Reperfuzion Injury-Indured Fibrosis by Blocking PI3K/AKT-Mediated Oxidative Stres. Drug Des Devel Ther. 2019; 13: 4375–87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. Передача сигналів рецепторів P2X7 сприяє запаленню в ниркові паренхіматозні клітини, які страждають від ішемічно-реперфузійного ушкодження. Смерть клітин Dis. 2021; 12 (1): 132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Рекомбінантний альфа-Клото може бути профілактичним і терапевтичним при прогресуванні гострого захворювання нирок до хронічного та уремічної кардіоміопатії. Kidney Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Дюбуа В., Екхут Дж., Лефевр П., Сталс Б. Різні, але взаємодоповнюючі внески ізотипів PPAR в енергетичний гомеостаз. J Clin Дослідження. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Рецептори, що активуються проліфератором пероксисом: ядерний контроль метаболізму. Endocr Rev. 1999; 20 (5): 649–88.

37. Ліббі А.Е., Джонс Б., Лопес-Сантьяго І, Роуленд Е., Леві М. Ядерні рецептори в нирках під час здоров’я та хвороби. Mol Aspects Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Молекулярні дії PPARalpha у метаболізмі ліпідів і запаленні. Endocr Rev. 2018; 39 (5): 760–802.

39. Вега Р.Б., Хасс Дж.М., Келлі Д.П. Коактиватор PGC-1 співпрацює з рецептором альфа, який активується проліфератором пероксисом, у контролі транскрипції ядерних генів, що кодують мітохондріальні ферменти окислення жирних кислот. Mol Cell Biol. 2000; 20 (5): 1868–76.

40. Li SY, Susztak K. Роль активованого проліфератором пероксисом гамма-коактиватора рецептора 1альфа (PGC-1альфа) при захворюванні нирок. Семін Нефрол. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Зв'язок між пероксисомами та мітохондріями: як і чому? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Апарісіо-Трехо О.Е., Авіла-Рохас С.Х., Тапіа Е., Рохас-Моралес П., Леон-Контрерас Дж.К., Мартінес-Клімова Е., Ернандес-Пандо Р., Санчес-Лозада Л.Г., Педраза Чаверрі Дж. Хронічне порушення мітохондріальної біоенергетики та бета -окислення сприяє експериментальному переходу ГПН у ХХН, індукованому фолієвою кислотою. Free Radic Biol Med. 2020;154:18-32.

43. Ейрін А, Лерман Л.О. Позаклітинні везикули мезенхімальних стовбурових/стромальних клітин для хронічної хвороби нирок: чи ми вже там? Гіпертонія. 2021; 78 (2): 261–9.

44. Курцхаген Дж.Т., Деллепіан С., Канталуппі В., Рабб Х. ГПН: все більш визнаний фактор ризику розвитку та прогресування ХХН. J Нефрол. 2020;33(6):1171–87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Репаративні функції міокарда екзосом із мезенхімальних стовбурових клітин посилюється лікуванням гіпоксії клітин шляхом перенесення мікроРНК-210 залежним від nSMase2- шляхом. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Викликані гіпоксією екзосоми, отримані з мезенхімальних стовбурових клітин, полегшують відновлення серця через miR-125b-опосередковане запобігання загибелі клітин при інфаркті міокарда. Тераностика. 2018; 8 (22): 6163–77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. Роль шляху CTRP6/AMPK у фіброзі нирок через сприяння окисленню жирних кислот. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Лікарська здатність модуляції ліпідного обміну проти фіброзу нирок. Acta Pharmacol Sin. 2021 рік.

49. Чунг К.В., Лі Е.К., Лі М.К., О Г.Т., Ю Б.П., Чунг Х.Й. Порушення PPARalpha та шляху окислення жирних кислот посилює фіброз нирок під час старіння. J Am Soc Nephrol. 2018; 29 (4): 1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Делеція Lkb1 у епітеліальних клітинах ниркових канальців призводить до ХХН через зміну метаболізму. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. ATF6alpha downregulation of PPARalpha promotes lipotoxicity-induced tubulointerstitial фіброз. Kidney Int. 2019;95(3):577–89.

52. Спінеллі Дж.Б., Хейгіс М.Ц. Багатогранний внесок мітохондрій у клітинний метаболізм. Nat Cell Biol. 2018; 20 (7): 745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Мітохондріальне пошкодження та активація шляху STING призводять до запалення нирок і фіброз. клітинний метаб. 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1, Qianqian Chen1, Yinghua Zhao4, Liangmei Chen5, Xu Wang1 і Xiangmei Chen1,2

1 Відділення нефрології, Перший медичний центр китайської загальної лікарні PLA, Інститут нефрології Китайської народно-визвольної армії, Державна ключова лабораторія захворювань нирок, Національний клінічний дослідницький центр захворювань нирок, Пекінська ключова лабораторія дослідження захворювань нирок, Пекін, Китай.

2 відділення нефропатії Другої лікарні університету Цзілінь, Чанчунь, Китай.

3 Науково-дослідний інститут нирок, Національний клінічний дослідницький центр геріатрії та відділ нефрології, лікарня Західного Китаю Сичуаньського університету, Ченду, Китай.

4 Школа клінічної медицини, Університет Цінхуа, Пекін, Китай.

5 Відділення нефрології, Перша афілійована лікарня Цзінаньського університету, Гуанчжоу, Китай.