Сульфід водню послаблює ниркову I/R-індуковану активацію запальної відповіді та апоптозу шляхом регулювання опосередкованого Nrf2 інгібування сигнального шляху NLRP3
Mar 14, 2022
Анотація. Пошкодження ниркової ішемії/реперфузії (I/R) може призвести до гострогониркова недостатність, сповільнена функція трансплантата та відторгнення трансплантата. Нуклеотид-зв’язуючий домен олігомеризації NOD-подібний рецептор, що містить піриновий домен 3 (NLRP3), опосередковане запалення бере участь у розвиткунирковийтравма. Nrf2 прискорює активацію сигнального шляху NLRP3 і додатково регулює запальну відповідь. Крім того, сірководень виконує захисну роль вураження нирок; однак детальний основний механізм залишається погано зрозумілим. У цьому дослідженні досліджували, чи шляхи Nrf2 і NLRP3 беруть участь у регулюванні сірководнемнирковийI/R-індукована активація запальної відповіді та апоптозу. Мишам дикого типу та мишам з нокаутом Nrf2 (KO) була проведена операція, щоб викликатинирковийI/R через затискання двосторонньогонирковийніжки. Загалом 20 мг/кг MCC950 (інгібітор NLRP3) вводили внутрішньоочеревинно щодня протягом 14 днів до операції.нирковийтканини та кров були зібрані у мишей моделі I/R для аналізу рівнів експресії мРНК NLRP3 та Nrf2, рівня експресії протеїнів NLRP3, PYD та CARD, каспази-1, IL-1, Nrf2 та гемоксигенази 1, клітинного апоптозу, секрецію фактора некрозу пухлини, цитокінів IL-1 та IL-6 танирковийгістопатологія та функція.нирковийI/R активував сигнальні шляхи NLRP3 і Nrf2. І навпаки, лікування MCC950 пригнічувало активацію сигнального шляху NLRP3 і запобігало I/R-індукованимураження нирок, вивільнення цитокінів і апоптоз внирковийМиші моделі I/R. Гідросульфід натрію (NaHS) не тільки пом’якшує підвищення рівня експресії білка NLRP3, але й полегшуєураження нирок,вивільнення цитокінів і апоптоз клітин, індукований ренальним I/R у мишей дикого типу, але не у мишей Nrf2-KO. NaHS послаблює активацію запалення NLRP3,ураження нирок,запальну реакцію та апоптоз клітин через сигнальний шлях Nrf2 у мишей моделі ниркової I/R.
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ НИРКОВУ/НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ
вступ
Ниркова ішемія/реперфузія (I/R) є основною причиною гострогоураження нирок(ГПН), що зазвичай виникає під часнирковийхірургічне втручання та схиляє людей до серйозної дисфункції багатьох систем органів. I/R-індукована смерть клітин і запалення всерединінирковийтканини пов'язана зі складними патофізіологічними процесами і сприяє зниженню вфункція нирок,що призводить до накопичення відходів метаболізму (1). На додаток до спричинених ішемієюнирковийТакож було виявлено, що при пошкодженні тканин реперфузія запускає складний патофізіологічний каскад, який включає надмірне вивільнення вільних радикалів і накопичення запальних клітин, що згодом сприяє запаленню та подальшому посиленню місцевої ішемії та пошкодження клітин (2).
Підродини нуклеотидзв’язуючого домену та сімейства повторів, багатих на лейцин, відіграють ключову роль у розвитку запальної відповіді (3). Піриновий домен сімейства NLR містить 3 (NLRP3) інфламмасому (раніше відому як домени NACHT, LRR і PYD, що містять білок 3 і кріопірин) є найбільш охарактеризованою інфламмасомою на сьогоднішній день. Все більше досліджень повідомляють про зв’язок між NLRP3 іренаl I/R. У AKI бере участь NLRP3нирковийI/R травма (4,5). Наприклад, нокдаун NLRP3 та його адаптера, що містить домен PYD і CARD (ASC), послаблює I/R-індукованийнирковийдисфункція та надмірний приплив нейтрофілівтканини нирок(6). Крім того, нокдаун NLRP3 та/або каспази-1 захищає мишей від ГПН, спричиненого сепсисом або ліпополісахаридом (7,8). Ці результати свідчать про те, що інфламмасома NLPR3 може відігравати ключову роль у патогенезіураження нирок.
Nrf2 — це ендогенний антиоксидантний ген, розташований у цитозолі, який поєднується з Kelch-подібним ECH-асоційованим білком 1 (Keap). Після активації Nrf2 вивільняється з Keep і переміщується в ядро, де згодом зв’язується з елементами антиоксидантної відповіді, щоб ініціювати транскрипцію його низхідних антиоксидантних і цитопротекторних цільових генів, таких як супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза, глутатіон-S-трансфераза ізоферменти, каталітичні та модифікуючі субодиниці ‑глутамілцистеїнлігази та NADP(H): хіноноксидоредуктаза (9). Раніше повідомлялося, що Nrf2 асоціюється з ГПН, спричиненим впливом навколишнього середовища, ішемією або ксенобіотиками (10). Окрім його захисної ролі при пошкодженні тканин, попередні дослідження також продемонстрували, що надмірна експресія Nrf2 пригнічує активність запалення NLRP3 і полегшує пошкодження тканин (11-13). Проте основний механізм сигнального шляху Nrf2 та його вплив на активацію запалення NLRP3 унирковийI/R залишається невідомим.Сірководень (H2S) отримав визнання за свою здатність регулювати гомеостаз ссавців і основні клітинні процеси, такі як аутофагія (14). Низка досліджень показала, що H2S відіграє захисну роль проти апоптозу, окислювального стресу та запалення вураження нирок(15-20). Тим не менш, основний захисний механізм H2S вураження нирокіндукований I/R залишається невідомим. Таким чином, у цьому дослідженні досліджувалися рівні експресії NLRP3 та його адаптера, ASC, у мишей з моделлю ниркової I/R моделі, а потім визначено вплив Nrf2 на експресію NLRP3. Це дослідження також мало на меті визначити, чи захищає H2Sтканини нирокпротиураження нирок,запалення та апоптоз через Nrf2-опосередковане інгібування NLRP3.
Ключові слова:ниркова ішемія/реперфузійне пошкодження, Nrf2, сірководень, апоптоз, пошкодження нирок; ниркова недостатність
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ЗАХВОРЮВАННЯ НИРОК
Матеріали та методи
Створення моделі ниркової I/R та груп лікування.Загалом 24 миші-самці дикого типу (вага 20-25 г; вік 6-8 тижнів) були отримані з Центру лабораторних тварин Академії військово-медичних наук (Пекін, Китай). Крім того, дев’ять мишей-самців з нокаутом Nrf2 (KO) (вага 20–25 г; вік 6–8 тижнів) були отримані від Junke Biological Co., Ltd. Усі протоколи щодо тварин були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин Загальна лікарня Тяньцзінського медичного університету (схвалення № IRB2020‑DW‑04; Тяньцзінь, Китай), і було докладено всіх зусиль, щоб звести до мінімуму страждання тварин і кількість тварин. Мишей акліматизували в навколишньому середовищі протягом 3 днів до експерименту при 22˚C з 40-60% вологістю, 12-годинним циклом світла/темряви та вільним доступом до води та їжі для гризунів. Після анестезії мишей за допомогою внутрішньоочеревинного (ip) 50 мг/кг пентобарбіталу натрію двостороннійнирковийніжки перев'язували на 30 хв за допомогою затискачів для мікроаневризм. Згодом затискачі мікроаневризми були видалені. У контрольній групі хірургічне втручання проводили за тим же способом; проте,нирковийніжки не перев'язані. Після операції 0.9-відсотковий розчин хлориду натрію використовувався для відновлення мишей. Потім мишей умертвляли після реперфузії протягом 24 годин. Загалом 24 миші дикого типу були випадковим чином розділені на наступні шість груп: i) контрольна (Con) група (n=9); ii) I/R група (n=9); iii) I/R плюс група MCC950 (n=3); і iv) I/R плюс група NaHS (n=3). Загалом дев’ять мишей Nrf2‑KO були випадковим чином розділені на такі три групи: i) Con група (n=3); ii) I/R група (n=3); і iii) I/R плюс група NaHS (n=3).
Згідно з попередніми дослідженнями та попередніми експериментами (21, 22), 20 мг/кг MCC950 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) вводили (в/б) щодня протягом 14 днів до операції в I/R плюс MCC950 група. Загалом 50 мкмоль/кг гідросульфіду натрію [NaHS; ip; розведений у звичайному (0,9%) фізіологічному розчині; Сігма-Олдріч; Merck KGaA] вводили перед операцією в групі I/R плюс NaHS. Після завершення всіх експериментальних процедур мишей умертвляли шляхом дислокації шийки матки, а тканину та кров збирали для подальшого аналізу.
Вестерн-блот. Тканина нирокбув зібраний у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії для аналізу рівнів експресії білка. Коротко, загальний і нуклеїновий білки екстрагували за допомогою буфера RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.), а концентрацію білка визначали за допомогою набору BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Загалом 40 мкг білка на доріжку відокремлювали за допомогою 10-відсоткового SDS-PAGE і переносили на мембрани з полівінілідендифториду, а потім блокували 5-відсотковим молоком протягом 2 годин при кімнатній температурі. Згодом мембрани інкубували з наступними первинними антитілами протягом ночі при 4˚C: анти-NLRP3 (1:500; кат. № ab214185; Abcam), анти-ASC (1:200; кат. № sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-каспаза-1 (1:200; кат. № sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), анти-IL-1 (1:1, 000; кат. . № ab200478; Abcam), анти-Nrf2 (1:1, 000; кат. № ab137550; Abcam), анти-гемоксигеназа (HO)-1 (1:2, 000 ; кат. № ab68477; Abcam), анти-актину (1:2, 000; кат. № ab8227; Abcam) і антигістону H3 (1:2, 000; кат. № ab176842; Abcam). Після первинної інкубації антитіл мембрани інкубували з відповідними HRP-кон’югованими вторинними антитілами (1:5, 000; кат. № ab6721 і ab6728; обидва Abcam) протягом 1 години при кімнатній температурі. Білкові смуги візуалізували за допомогою розширеного хемілюмінесцентного набору (Thermo Fisher Scientific, Inc.) за допомогою системи Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) і напівкількісно оцінювали за допомогою програмного забезпечення Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories). , Inc.). Рівні експресії білка були нормалізовані до -актину для цитоплазматичного білка або гістону для нуклеїнового білка.
Зворотна транскрипція – кількісна(RT-q)ПЛР.Тканина нирокбув зібраний у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії для аналізу рівнів експресії мРНК. Коротко кажучи, загальну РНК екстрагували з тканини за допомогою реагенту TRIzol® (номер за каталогом 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Загальну РНК зворотно транскрибували в кДНК за допомогою набору RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (кат. № K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) згідно з протоколом виробника. Згодом кПЦР проводили за допомогою SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) на системі 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Умови термоциклування були такими: денатурація при 95˚C протягом 5 хв; 40 циклів при 95˚C протягом 15 секунд; і розширення при 60˚C протягом 20 секунд. Геноспецифічні послідовності праймерів перераховані в таблиці I. Відносні рівні експресії цільових генів були розраховані за допомогою методу 2‑ΔΔCq (23) і нормалізовані до рівнів експресії GAPDH.
Імуногістохімія (ІГХ). Тканина нирокбув зібраний у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії для визначення рівнів експресії NLRP3 та Nrf2. коротко,ниркатканину фіксували при кімнатній температурі протягом 48 годин у 10% формаліні, заливали в парафін і нарізали на зрізи 5 мкм. Потім зрізи блокували 5% молоком при 37°C протягом 30 хвилин та інкубували з анти-NLRP3 (1:100; кат. № ab214185; Abcam) або анти-Nrf2 (1:200; кат. № ab137550; Abcam) первинні антитіла протягом ночі. Після первинної інкубації з антитілами зрізи інкубували з HRP-міченим вторинним антитілом проти кролика (1:200; кат. № ab214880; Abcam) при 37°C протягом 30 хвилин, проявленим за допомогою розчину діамінобензидину для<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Дослідження функції нирок. Загалом 2-3 мл крові було зібрано після центрифугування при 3,000 xg протягом 10 хвилин при 4˚C у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії. Для аналізу була отримана сироваткафункції нирокза допомогою ELISA для визначення рівнів креатиніну (кат. № C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) та азоту сечовини крові (BUN; кат. № C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), відповідно до інструкцій виробника.Травма ниркиРівні молекули-1 (KIM-1) у сироватці вимірювали за допомогою ELISA (номер за кат. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) відповідно до інструкцій виробника.
Забарвлення гематоксиліном і еозином.Тканина нирокбув зібраний у мишей моделі I/R після 24 годин реперфузії для оцінкинирковийгістопатологічні зміни. Тканина була фіксована при кімнатній температурі протягом 48 годин в 10% формаліні, а потім залита в парафін. Залиті парафіном зрізи нарізали на зрізи товщиною 5 мкм і фарбували 0.5% гематоксиліном протягом 5 хвилин і еозином протягом 3 хвилин при кімнатній температурі (25°C). Наявність крововиливу, некрозу тубулярних клітин, дилатації канальців і утворення цитоплазматичної вакуолі в тканині оцінювали наступним чином: 0, норманирка;1, мінімальний збиток; 2 — помірні пошкодження; і 3, серйозні пошкодження (24).Травма нирокоцінки були розраховані наосліп двома дослідниками під світловим мікроскопом (збільшення, x200; Biorevo BZ‑9000; Keyence Corporation).
ІФА аналіз рівнів TNF‑, IL‑1 та IL‑6. Відбирали кров (1 мл) у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії. Сироватку отримували центрифугуванням при 3,000 xg протягом 10 хвилин при 4˚C. Рівні TNF- (кат. № MTA00b), IL-1 (кат. № MLB00C) та IL-6 (кат. № M6000B) у сироватці аналізували за допомогою комерційні набори ELISA (R&D Systems, Inc.), згідно з протоколом виробника на рідері мікропланшетів (кат. № CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ІНФЕКЦІЮ НИРОК/НИРОК
Фарбування TUNEL.Тканина нирокбув зібраний у мишей моделі I/R після 24-годинної реперфузії для оцінки апоптозу клітин за допомогою фарбування TUNEL. Коротко, тканину фіксували при кімнатній температурі протягом 48 годин у 10% формаліні, заливали в парафін і нарізали на зрізи товщиною 5 мкм. Зрізи інкубували з реагентом TUNEL у зволоженій камері при 37˚C протягом 60 хвилин у темряві (Roche Diagnostics) і фарбували DAPI протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Потім випадковим чином вибирали 10 полів потужного мікроскопа та спостерігали в кожній секції за допомогою флуоресцентного мікроскопа (збільшення, х10).Статистичний аналіз. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення трьох експериментів і проаналізовані за допомогою GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Статистичні відмінності між двома групами аналізували за допомогою парного t-критерію Стьюдента. Статистичні відмінності між більш ніж трьома групами були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим ретроспективним тестом множинних порівнянь Тьюкі. Усі дані були нормально розподілені та мали однакову дисперсію. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Результати
Лікування MCC950 запобігає наступній активації сигналу NLRP3, індукованій I/Rураження нироку мишей. Інфламмасомний шлях NLRP3 активується і відіграє вирішальну роль уураження нирок(25,26). Попереднє дослідження також повідомляло, що передача сигналів NLRP3 активується в нирковій тканині мишей через 24 години після реперфузії (4). Тому 24 години після реперфузії було обрано як поточну точку часу оцінки. Рівні експресії білка NLRP3 підвищувалися внаслідок ураження нирок I/R у групі I/R порівняно з контрольною (Con) групою (рис. 1A та B). Подібна тенденція спостерігалася в рівнях експресії мРНК NLRP3 (рис. 1C). Крім того, кількість NLRP3-позитивних клітин зросла в групі I/R порівняно з групою Con, як визначено фарбуванням IHC (рис. 1D і E).
Для того, щоб визначити основний механізм активації запалення NLRP3 і вплив на нижчий сигнальний шлях після пошкодження нирок I/R, мишей лікували інгібітором NLRP3 MCC950. Результати Вестерн-блоттингу продемонстрували, що I/R підвищує рівень експресії білка NLRP3 та його адаптера ASC і сприяє дозріванню від про-каспази-1 до каспази-1 та про-IL-1 до IL-1 у групі I/R порівняно з групою I/R. Група Con (Рис. 2A-E). Ці результати показали, що нирковий I/R може індукувати активацію шляху запалення NLRP3 і лікування MCC950 може знижувати рівень експресії NLRP3, ASC, каспази-1 та IL-1 після пошкодження ниркового I/R.
Вплив інфламмасоми NLRP3 наураження нирок, запалення та апоптоз у мишей моделі I/R нирок. Щоб
щоб визначити вплив NLRP3 на пошкодження нирок, мишей моделі I/R лікували інгібітором NLRP3 MCC950. Миші моделі ниркової I/R продемонстрували значно підвищені рівні BUN, сироваткового креатиніну та KIM-1, який є біомаркером ураження нирок (рис. 3A-C), що вказує на успішну індукцію ураження ниркової I/R. Гістологічне дослідження ниркової тканини мишей моделі I/R виявило підвищення гістологічної оцінки, про що свідчить сильний набряк канальцевого епітелію, розширення канальців та інтерстиціальний набряк, вакуольна дегенерація та втрата щіткової облямівки, що свідчить про те, що нирковий I/R може сприяти розвитку значне пошкодження ниркової тканини та підвищення гістологічної оцінки (рис. 3D та E). Інгібування NLRP3 лікуванням MCC950 значно зменшувало I/R-індуковане підвищення рівнів BUN, креатиніну та KIM-1 і знижувало гістологічну оцінку, при цьому ниркова тканина демонструвала менше серйозно пошкоджених канальців (рис. 3A-E).
Крім того, рівні факторів запалення та апоптотичних клітин після введення MCC950 аналізували на мишах з нирковою I/R моделлю. Показники запалення, включаючи TNF‑, IL‑1 та IL‑6, були значно підвищені в групі I/R порівняно з групою Con (рис. 3F-H). Крім того, порівняно з групою Con, відсоток апоптичних клітин був значно збільшений через 24 години після реперфузії в групі I/R (рис. 3I та J). Порівняно з групою I/R, секреторні рівні цитокінів, TNF‑, IL-1 та IL-6, а також відсоток апоптичних клітин були знижені під час лікування MCC950 у групі I/R плюс MCC950 (рис. 3F-J). ). Ці результати показали, що інгібування інфламмасоми NLRP3 може запобігати вивільненню факторів запалення та апоптозу ниркової тканини, індукованого I/R.
Nrf2 необхідний для ниркової I/R-індукованої регуляції активності запалення NLRP3.Попереднє дослідження показало, що Nrf2 активується і рівні експресії цільових генів Nrf2 підвищуються втканини нирокпісля травми нирки (27). Подібні результати були отримані в цьому дослідженні. Рівні експресії нуклеїнової кислоти, загального білка та мРНК Nrf2 аналізували через 24 години після пошкодження нирок I/R. Результати показали, що порівняно з групою Con рівні експресії нуклеїнових, загальних білків і мРНК Nrf2 були підвищені в групі I/R (рис. 4A-D). Крім того, аналіз IHC виявив, що рівні експресії Nrf2 у нирковій тканині були підвищені, що було продемонстровано збільшенням кількості Nrf2-позитивних
клітин, що спостерігаються в групі I/R (рис. 4E і F). Ці дані свідчать про те, що активація сигнального шляху Nrf2 може ініціювати захисну відповідь у мишей з моделлю ниркової I/R. Щоб перевірити вплив Nrf2 на шлях запалення NLRP3 у ниркових I/R, у наступних експериментах використовували мишей Nrf2-KO. Рівні експресії білка Nrf2 і його цільового гена, HO‑1, були значно знижені після ниркової I/R у мишей KO порівняно з мишами дикого типу (рис. 5A-C). І навпаки, порівняно з групою I/R дикого типу, рівні експресії NLRP3 та його адаптора, ASC, каспази-1 та IL-1 були підвищені в групі I/R KO (рис. 5A та D-G). Ці дані показали, що нирковий I/R може індукувати активацію інфламмасоми NLRP3 у мишей Nrf2-KO.
NaHS послаблює індуковане I/R підвищення рівня експресії білка NLRP3 у мишей дикого типу, але не у мишей Nrf2-KO. Було продемонстровано, що NaHS впливає на експресію Nrf2 і активацію запалення NLRP3 у різних моделях захворювання (28-30). У цьому дослідженні було досліджено, чи вплив NaHS на активацію шляху NLRP3 відбувається через сигнальний шлях Nrf2 шляхом аналізу рівнів експресіїпротеїнів Nrf2 і NLRP3, асоційованих з інфламасомою, у мишей дикого типу та KO.У мишей дикого типу, порівняно з групою Con, рівень експресії Nrf2, NLRP3, каспази-1 та IL-1 підвищувався через пошкодження нирок I/R. Крім того, лікування NaHS додатково посилювало експресію Nrf2 і знижувало рівні експресії NLRP3, каспази-1 та IL-1 у групі I/R плюс NaHS порівняно з групою I/R (рис. 6A-E). У мишей Nrf2-KO не спостерігалося статистично значущих відмінностей у рівнях експресії Nrf2, NLRP3, каспази-1 та IL-1 між групами I/R та I/R плюс NaHS (рис. 6A-E). У групі I/R плюс NaHS рівні експресії Nrf2 були значно знижені, тоді як рівні експресії NLRP3, каспази-1 та IL-1 були значно підвищені у мишей Nrf2-KO порівняно з мишами дикого типу. Ці результати свідчать про те, що NaHS може зменшувати активацію запалення NLRP3 через сигнальний шлях Nrf2 при пошкодженні нирок I/R
NaHS полегшує пошкодження нирок, запалення та апоптоз через сигнальний шлях Nrf2 у мишей моделі I/R нирок. NaHS відіграє важливу роль у пошкодженні нирок при ГПН, І/Р та інших моделях захворювань (31). NaHS зменшував гістопатологічні пошкодження, спричинені I/R нирками, що було продемонстровано зменшенням набряку епітелію канальців, розширенням канальців та інтерстиціальним набряком таниркагістологічні оцінки в групі I/R плюс NaHS порівняно з групою I/R у мишей дикого типу (рис. 7A і B). Показники функції нирок, включаючи креатинін, BUN і KIM-1, також були знижені під час лікування NaHS у групі I/R плюс NaHS порівняно з групою I/R у дикого типу.
миші (рис. 7C-E). Однак у мишей Nrf2-KO NaHS не зміг зменшити збільшенняниркагістологічна оцінка та рівні показників ниркової функції, індуковані нирковою I/R. Крім того, відсоток апоптичних клітин і вивільнення цитокінів, TNF-, IL-1 та IL-6, були знижені після лікування NaHS в I/R плюс NaHSгрупу порівняно з групою I/R у мишей дикого типу (рис. 7F-J). Однак NaHS не зміг надати захисний ефект проти апоптозу та надмірного вивільнення факторів запалення після реперфузії ниркової тканини в групі I/R плюс NaHS мишей Nrf2-KO порівняно з I/R плюс NaHS мишами дикого типу (рис. 7F-J). Ці результати свідчать про те, що NaHS може полегшити пошкодження нирок, запалення та апоптоз у мишей дикого типу I/R, але не у мишей Nrf2-KO.
Обговорення
Запалення є ключовим патогенним процесом ГПН, індукованим I/R (4). Інфламмасома NLRP3 і сигнальний шлях Nrf2 беруть участь у регуляції запалення вураження нирок(32). У цьому дослідженні встановлено, що ГПН, індукований I/R, активував інфламмасому NLRP3 та її адаптор, ASC, сприяв дозріванню про-каспази-1 та про-IL-1 і прискорював надмірне вивільнення цитокінів і апоптоз, що завершилося важким порушення функції нирок. Інгібування інфламмасоми NLRP3 лікуванням MCC950 покращило функцію нирок, рівень запалення та апоптозу в нирковій тканині. На додаток до активації NLRP3, нирковий I/R також активував сигнальний шлях Nrf2. Однак відсутність Nrf2 у мишей Nrf2‑KO призвела до подальшої активації інфламмасоми NLRP3 та її адаптора. Було виявлено, що лікування NaHS полегшує активність запалення NLRP3 через сигнальний шлях Nrf2. Крім того, пошкодження нирок, запалення та апоптоз були зменшені лікуванням NaHS за допомогою Nrf2-опосередкованого інгібування активації запалення NLRP3.
Пошкодження нирки I/R є важливою клінічною проблемою та основною причиною ГПН, що призводить до підвищеного ризику розвитку хронічногохвороба печінки(33). Запалення є важливою патологічною ознакою ішемічного ураження і виникає як наслідок активації імунних клітин шляхом розпізнавання молекулярних структур, пов’язаних з патогеном і пошкодженням (34). Крім того, раніше повідомлялося, що інфламмасома NLRP3 відіграє певну роль у рядіхвороби нирокшляхом регуляції запалення, піроптозу, апоптозу та фіброзу (35). Інфламмасома NLRP3 — це білковий комплекс, що включає NLRP3, його адаптерний білок, ASC і каспазу-1. Каспаза-1 розщеплює про-ІЛ-1 і про-ІЛ-18 до зрілих, активованих секреторних форм. Пошкодження нирок, викликане різними патологіями, включаючи ішемію (33), активує інфламмасомний комплекс, посилює експресію NLRP3 і сприяє наступному дозріванню про-IL-1 (36). NLRP3 KO, використовуючи малу інтерферуючу РНК у мишей або епітеліальних клітин ниркових канальців, надає захисний ефект проти пошкодження ниркової тканини, спричиненого ішемією або пошкодженням клітин за відсутності глюкози (37). Отримані результати показали, що нирковий I/R індукує активацію інфламмасоми NLRP3, тоді як інгібування NLRP3 за допомогою MCC950 значно знижує регуляцію рівнів експресії NLRP3 та ASC і дозрівання про-каспази-1 та pro-IL-1 у ниркових I/R. модель травми. Крім того, інгібування NLRP3 за допомогою MCC950 полегшило ниркову дисфункцію та зменшило гістопатологічне пошкодження та оцінку, надмірне вивільнення цитокінів і кількість апоптичних клітин. Ці дані свідчать про те, що активація NLRP3 може відігравати ключову роль у пошкодженні нирок, а інгібування NLRP3 може справляти захисний ефект проти пошкодження тканин і дисфункції, викликаної нирковою I/R.
Попередні дослідження показали, що Nrf2 бере участь у запальній відповіді (10-12). Крім того, Nrf2 відіграє ключову протизапальну, антиоксидантну або антиапоптотичну роль при ішемічних станах. Активація сигнального шляху елемента Nrf2/антиоксидантної реакції послаблює запалення та апоптоз у нирковій тканині мишей, індукованих циклофосфамідом (38). Інше дослідження продемонструвало, що активація Nrf2 сульфорафаном пригнічує активність сигнального шляху NF‑κB, тим самим знімаючи запалення в дистрофічній м’язовій тканині (39). Крім того, нокдаун Nrf2 сприяє активації запалення NLRP3 і призводить до активації IL-1 у моделі ішемії (11). Нинішні дані підтвердили висновки про те, що нирковий I/R може індукувати сигнальний шлях Nrf2 і експресію його генів-мішеней, таких як HO‑1. Миші Nrf2-KO додатково сприяли активації інфламмасоми NLRP3, що вказувало на те, що рівні експресії NLRP3, ASC, каспази-1 та IL-1 були підвищені в нирковій моделі I/R. Ці результати свідчать про те, що Nrf2 справляв інгібуючу дію на активацію запалення NLRP3 при пошкодженні нирок I/R.
Попередні дослідження показали, щониркавиробляє H2S (40). Крім того, H2S збільшує нирковий кровотік і сприяє кліренсній функціїнирка, про що свідчить підвищена швидкість клубочкової фільтрації (41). Крім того, H2S не тільки полегшує запалення та окислювальний стрес, але також відіграє вирішальну роль у регуляції ендотеліальної дисфункції та гіпертензії (28). H2S бере участь у регуляції захворювань, пов’язаних з нирками, таких як ураження В/Р та обструктивна та діабетична нефропатія (42), однак основні механізми залишаються недостатньо вивченими. NHS використовувався як екзогенний донор H2S у дослідженнях (43). У цьому дослідженні доставка H2S була у формі NaHS. Нинішні результати продемонстрували, що NaHS полегшує пошкодження тканин,ниркадисфункція, надмірне вивільнення цитокінів і апоптоз, індукований нирковою І/Р. Раніше повідомлялося, що NaHS запобігає активації мікроглії та запаленню, спричиненому пошкодженням нерва, шляхом регулювання сигнального шляху Nrf2 (44). У відповідності з гіпотезою про те, що NaHS регулює запалення через сигнальний шлях Nrf2, поточні результати продемонстрували, що NaHS підвищує рівень експресії Nrf2 і пригнічує рівні експресії NLRP3 у мишей з нирковою моделлю I/R. Крім того, Nrf2 KO скасував регуляторний вплив NaHS на Nrf2 і інфламмасому NLRP3. У цьому дослідженні також досліджували роль Nrf2 на пошкодження та функцію нирок після лікування NaHS; інгібування Nrf2 не тільки частково скасовує захисну дію NaHS наураження нирокі дисфункції, але також скасував інгібуючий ефект NaHS на запальну відповідь і апоптоз після ниркової I/R. Ці результати свідчать про те, що Nrf2 може бути необхідним для захисного ефекту NaHS на ГПН, індукованого I/R, і NaHS може виконувати свою захисну роль проти пошкодження тканин через Nrf2-опосередковане інгібування запалення NLPR3. Підсумовуючи, I/R-індуковане пошкодження нирок активувало інфламмасому NLRP3 і сигнальний шлях Nrf2, а інгібування запалення нирок NLRP3 захищало від пошкодження нирок. Nrf2 негативно регулює активацію запалення NLRP3 і полегшує NaHSураження нирокі дисфункція, апоптоз і запальна відповідь через Nrf2-опосередковане інгібування запалення NLRP3 NLRP3. Ці результати дають нове розуміння потенційної майбутньої цілі для лікування ішемічного ураження нирок.
