Як синтаза оксиду азоту впливає на нирки?

Контактна особа: Одрі Хуaudrey.hu@wecistanche.com

Молекулярне дослідження токсичності діазинону на основі експресії індукованої синтази оксиду азоту (iNOS) у гепатоцитах та гістопатології нирок щурів (Rattus norvegicus)

Анотація

Діазинон - фосфорорганічний інсектицид, який широко використовується для знищення шкідників, але має більш високу токсичність, ніж інші інсектициди. Діазинон, який випадково вживається перорально, впливає на підвищення активних форм кисню (АФК) в організмі. Активні форми кисню (АФК) активують прозапальний цитокін, який індукує індукованийСинтаза оксиду азоту(iNOS), при якому iNOS (Синтаза оксиду азоту) вироблятимеОксид азоту(NO) як вільний радикал. Високий рівень ROS призведе до пошкодження клітин. Це дослідження було спрямоване на визначення токсичного ефекту діазинону щодо iNOS (Синтаза оксиду азоту)експресія в печінці таниркагістопатологія щурів (Rattus norvegicus). Щурів розділили на 4 групи, які складалися з групи негативного контролю та трьох експериментальних груп, яким вводили діазинон у дозі 20 мг/кг маси тіла (P1), 40 мг/кг BW (P2) та 60 мг/кг BW (P3). Параметри, які спостерігалися в цьому дослідженні, - це експресія iNOS (Синтаза оксиду азоту)у печінці за допомогою імуногістохімічного фарбування, потім аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом Тьюкі (a=0,05), іниркагістопатології, яку спостерігали за допомогою фарбування гематоксиліном-еозином і аналізували якісно описово. Результати показали, що пероральний прийом діазинону значно підвищував iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз (стор<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">нироккори, яка виявлялася інфільтрацією запальних клітин, некротичноюниркаклітини канальців і крововиливи в міжканальцевий простір.

Ключові слова:Діазинон, Органофосфат, iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз,ниркагістопатологія.

Цистанхея покращує роботу нирок

1. Введення

Вважається, що використання пестицидів сприяє збільшенню виробництва, особливо в якості профілактики проти шкідників і бур’янів (Kusriani, 2012). Однак часте використання пестицидів може призвести до того, що ці пестициди будуть токсичними для споживачів, включаючи тварин, як при вдиханні, так і через рот (Ameriana, 2006). Одним із пестицидів, який зазвичай використовується, є діазинон. Діазинон є фосфорорганічним пестицидом, механізм якого пригнічує функцію ферменту холінестерази. Ці пестициди також менш впливають на нецільові організми та більш токсичні для хребетних тварин порівняно з хлорорганічними речовинами (Luthfanto, 2014). Зазвичай пестициди нейтралізуються в печінці гепатоцитами шляхом детоксикації, але ці сполуки також здатні утворювати вільні радикали через пошкодження клітин. Вплив органофосфатів, який відбувається безперервно, може викликати пошкодження печінки як органу, який відіграє важливу роль у процесі детоксикації (Ginting, 2014). Органофосфати, метаболізовані в печінці, здатні інгібувати фермент AChE. Інгібування цього ферменту безпосередньо призводить до підвищення рівня ацетилхоліну в нервовій системі та нервово-м’язовій системі. Збільшення AChE може спричинити нестабільність іонів у клітинах і викликати утворення активних форм кисню (АФК) (Uchendu, 2012). Збільшення АФК призведе до вироблення прозапальних цитокінів. Найк і Вішва (2011) стверджують, що АФК впливає на транскрипцію прозапальних цитокінів, де високі рівні АФК будуть супроводжуватися високими рівнями прозапальних цитокінів, а також якщо виробництво АФК пригнічується інгібіторами, це вплине на зниження виробництва прозапальних цитокінів, таких як як IL-6 і TNF. Підвищене виробництво прозапальних цитокінів індукує iNOS (Синтаза оксиду азоту)і утворюють NO у надмірних кількостях (Актан, 2004).

Theниркає головним органом, який підтримує баланс позаклітинної рідини (ECF), виконуючи свої функції виділення та метаболізму (Curthoys, 2014). Виведення або елімінація метаболізму ксенобіотиків відбувається внирка. Theниркапошкодження може знизити рівень виведення хімічних речовин без збільшення токсичності токсичних речовин (Gupta, 2012). Стан окислювального стресу ініціює процес перекисного окислення ліпідів шляхом відбирання іонів водню від зв’язку поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) для формування більш стабільної молекули. Процес розриву зв’язку на ПНЖК може спричинити некроз клітин або тканин (Sharma et al., 2003).

Це дослідження було проведено для визначення токсичного ефекту діазинону проти iNOS (Синтаза оксиду азоту)експресія в гістопатології печінки та нирок щурів.

Синтаза оксиду азоту впливає на роботу нирок

2. Матеріали та методи

2.1. Моделі тварин та дизайн експерименту

Двадцять щурів (Rattus norvegicus) розділили на 4 групи: група негативного контролю (здорові щури). Групам P1, P2 і P3 вводили діазинон протягом 8 тижнів перорально за допомогою зонда для годування в дозах 20 мг/кг маси тіла, 40 мг/кг маси тіла та 60 мг/кг маси тіла відповідно. Діазоній 600EC змішували з дистильованою водою до тих пір, поки він не містив 5 мг діазонію в 1 мл (Baconi et al., 2013).

Щурів акліматизували протягом тижня перед лікуванням. Усі умови та поводження з тваринами проводилися відповідно до протоколу, схваленого Комітетом з етичних дозволів Університету Бравіджая (№: 732-KEP-UB).

2.2. Підготовка та спостереження за гістологічним дослідженням нирок

Підготовканиркагістопатологія складається з наступних етапів: фіксація, дегідратація, очищення, вбудовування, розрізання, приклеювання до скляних предметів згідно з Muntiha (2001). Спостереження заниркагістопатологію проводили за допомогою бінокулярного світлового мікроскопа зі збільшенням мікроскопа 100x з наступним збільшенням до 400x. Спостереження проводили на ниркових клубочках і ниркових канальцях.

2.3. Аналіз експресії iNOS (синтази оксиду азоту) у печінці

iNOS (Синтаза оксиду азоту)Експресію в печінці аналізували імуногістохімічними методами з використанням анти iNOS (Синтаза оксиду азоту) як первинне антитіло та анти-кролячий IgG, мічений біотином, як вторинне антитіло. Вимірювання iNOS (Синтаза оксиду азоту)Експресію на печінці проводили за допомогою програмного забезпечення Immunoratio. Результати відсоткової площі експресії iNOS аналізували кількісно за допомогою тесту одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) і супроводжували тестом Тьюкі.

3. Результати та їх обговорення

3.1. Аналіз експресії iNOS (синтази оксиду азоту) у печінці

Проаналізувати експресію iNOS (Синтаза оксиду азоту)на клітинах печінки проводили імуногістохімічним методом. Експресія iNOS (Синтаза оксиду азоту)може бути показано у вигляді експресії коричневого кольору на гепатоцитах, яку можна побачити на малюнку 1.

Малюнок 1. iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз на печінці.

(1) Група негативного контролю (K-). (2) P1 (індукований діазиноном 20 мг/кг маси тіла. (3) P2 (індукований діазиноном 40 мг/кг маси тіла).

(4) P3 (індукований діазиноном 60 мг/кг маси тіла. Біле коло показує площу iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз.

Результати імуногістохімічного аналізу були якісно проаналізовані та показали, що спостерігається збільшення інтенсивності коричневого кольору (рис. 1). Цей результат вказує на збільшення iNOS (Синтаза оксиду азоту)рівні експресії в групі лікування порівняно з контрольною групою.

Для вимірювання рівня iNOS (Синтаза оксиду азоту)Експресія на гепатоцитах використовується програмною імунореакцією. Результати кількісного аналізу iNOS (Синтаза оксиду азоту)експресію в печінці щурів можна побачити в таблиці 1, і можна зробити висновок, що існує значна різниця (р<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Синтаза оксиду азоту)Секспресія становила 1,340 ±0,092 відсотка. У групі лікування 1 (P1), яка була групою, індукованою діазинонорганофосфатом у дозі 20 мг/кг маси тіла, середній відсоток площі iNOS (Синтаза оксиду азоту)експресія становила 4,184±1,041 відсотка. Групою лікування 2 (P2) була група, індукована діазинонорганофосфатом у дозі 40 мг/кг маси тіла та середнім iNOS (Синтаза оксиду азоту)експресія становила 7,496±0,997 відсотків. Групою лікування 3 (P3) була група, індукована діазинонорганофосфатом у дозі 60 мг/кг маси тіла та середнім iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз був 11,604 ± 0.864.

На негативній контрольній групі виявлено iNOS (Синтаза оксиду азоту)вираз низької інтенсивності (1,340 ± 0,092 відсотка). McNaughton та ін. (2002) виявили, що iNOS (Синтаза оксиду азоту)виражався в нормальних ацинусах печінки. Поширення iNOS (Синтаза оксиду азоту)у нормальній печінці виявляється зона навколо порталу з найсильнішим виразом, а інтенсивність зменшується вздовж ацинусів печінки. Відповідно до Kubes (2000), iNOS (Синтаза оксиду азоту)може надати терапевтичний ефект, якщо його регулювати у правильній кількості та місці, iNOS відіграє позитивну роль, включаючи загоєння шкіри та слизової оболонки кишечника, боротьбу з певними бактеріями, потенціал у регуляції проліферації та диференціювання Т-клітин, а також регуляцію рекрутування лейкоцитів .

Група лікування продемонструвала значне збільшення у відсотках площі iNOS (Синтаза оксиду азоту) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Збільшення ROS призведе до вироблення прозапальних цитокінів. Активні форми кисню впливають на транскрипцію прозапальних цитокінів, де високі рівні АФК супроводжуються високими рівнями прозапальних цитокінів, аналогічно, якщо виробництво АФК інгібується інгібіторами, це також вплине на зниження виробництва прозапальних цитокінів, таких як ІЛ{{0 }} і TNF (Naik і Vishva, 2012). Dunlop та ін. (2014) та Pahan та ін. (2000) заявили, що TNF- та IL-1 відіграють важливу роль у підвищенні експресії iNOS (Синтаза оксиду азоту)у тканинах шляхом активації Nappar Kappa B(NF-kB), у якому NF-kB потрапляє в ядро ​​та зв’язується з промоторною областю iNOS (Синтаза оксиду азоту). Підвищене виробництво прозапальних цитокінів індукує iNOS (Синтаза оксиду азоту)і утворюють надмірну кількістьОксид азоту(НІ) (Актан, 2004).

3.2. Аналіз гістопатології нирок

Результати цього дослідження впливу токсичності діазинону наниркагістопатологічні ознаки за допомогою фарбування гематоксиліном-еозином (HE) представлені на малюнку 2. Гістологічна картина кори нирок щурів у групі негативного контролю (K-) показала нормальний стан і не виявила жодних відхилень. Це підтверджується появою ниркового тіла, проксимальних і дистальних судомних канальців з шаром кубоподібних епітеліальних клітин (рис. 2(1)).

Гістопатологічна картина кори нирок щурів у групі P1 показала аномалії, які характеризуються наявністю клітин, що піддаються каріолізу та гіпертрофії. Клітини каріолізу характеризуються зникненням клітинного ядра, тоді як епітеліальні клітини, які піддаються гіпертрофії, мають характеристики збільшеного розміру клітин, так що структура ниркових канальців виглядає неправильною. На цьому знімку можна побачити еритроцити в міжканальцевому просторі, що вказує на наявність крововиливу (Малюнок 2(2). Патогістологічне зображення в групі P2 показує аномалії, подібні до групи P1. Аномалії, які можна спостерігати в корі нирки P2 щурів включають появу клітин, що піддаються каріолізу, гіпертрофію клітин і крововилив.ниркаканальці виглядають нерегулярними порівняно з K-групою (рис. 2(3)). Гістопатологічна картина кори нирок щурів у групі P3 показала аномалії, як видно на гістопатології картини кори нирок у щурів P1 та P2, що характеризується появою клітинної гіпертрофії, каріолізу та еритроцитів у міжканальцевому просторі (крововилив ). Також можна спостерігати наявність запальної клітинної інфільтрації в тканинах (рис. 2(4)).

Діазинонорганофосфат, який дали щурам перорально, буде перетравлюватися травним трактом, який потім буде поглинатися кишечником, особливо дванадцятипалою кишкою. Метаболізм фосфорорганічних кислот в основному відбувається в печінці, але в меншій мірі метаболізм також відбувається в долонях і кишечнику. Фосфорорганічні сполуки пройдуть фазу 1 метаболізму, яка є процесом окислення, під час якого фосфорорганічні сполуки розщеплюватимуться на оксон-органофосфатні метаболіти та вільні іони сірки за допомогою ферментів цитохрому (CYP) (Gupta, 2009; Elersek and Metka 2011). Потім оксон-органофосфатний метаболіт потрапляє в кровотік і йде в печінку для подальшого метаболізму. У печінці оксон-органофосфатні метаболіти гідролізуються за допомогою ферментів карбоксилестерази (CE) і параоксонази (PON), розщеплюються на діалкілфосфат і залишають групу. Далі діалкілфосфатаза буде каталізуватися ферментами у фазі 2 метаболізму, які вироблятимуть молекули, які є гідрофільними та можуть виводитися із сечею, залишаючи групи (у формі діетилу), які можуть викликати окислювальний стрес в організмі. Діетил є дуже реакційноздатною молекулою і може реагувати з групами гідроксильних радикалів (-OH) з утворенням нових вільних радикалів (Elersek and Metka, 2011). Велика кількість вільних радикалів в організмі не може бути нейтралізована ендогенними антиоксидантами, що призводить до дисбалансу між вільними радикалами та антиоксидантами, що спричиняє окисне пошкодження (Caramori and Papi, 2004). Це окислювальне пошкодження відбувається тому, що діетилгідроксил як вільний радикал від фосфорорганічного діазинону здатний виробляти велику кількість АФК (Uchendu et al., 2012). Збільшення ROS спричинить стан окисного стресу та ініціює процес перекисного окислення ліпідів шляхом забирання іонів водню з поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) для утворення більш стабільних молекул. Процес розриву зв’язку PUFA може спричинити некроз клітин або тканин (Sharma et al., 2003).

Аномалії виникли вниркаепітелію канальців внаслідок безпосереднього контакту епітелію з токсичною речовиною діазинону, а вниркаканальця відбувається процес реабсорбції та збільшення в процесі утворення сечі (Mescher, 2010). Токсична речовина діазинон, яка все ще знаходиться в кровоносних судинах, буде безпосередньо контактувати з ендотелієм, викликаючи порушення проникності судинної мембрани. Крововилив у міжканальцевий простір був викликаний порушенням проникності мембрани кровоносних судин (перитубулярних капілярів), так що еритроцити могли проникнути в тканину (Djumadi et al., 2008). Пошкодження ендотеліальних клітин ініціює запальні реакції, що призводять до накопичення макрофагів і тромбоцитів поза та всередині артерій. Поява запальної клітинної інфільтрації в пошкодженій тканині свідчить про те, що метаболіти діазинону викликають токсичність длянирка(Худайр та ін., 2017).

Згідно з результатами гістопатологічного дослідження кора нирок у групі лікування зазнала аномалій порівняно з K-групою. Відомо, що група P1 з найнижчою дозою 20 мг/кг BW показала пошкодженняниркатрубчастих клітин порівняно з К-групою.

Цистанхе покращує роботу нирок

4. Висновок

Було показано, що введення діазинону в найнижчій дозі 20 мг/кг маси тіла має токсичний ефект у щурів, про що свідчить значне підвищення iNOS. (Синтаза оксиду азоту)вираз (стор<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Література

[1] Актан, F 2004 iNOS (Синтаза оксиду азоту)-Опосередковане виробництво оксиду азоту та його регулювання. Life Sciences, 75:639-653.

[2] Амеріана, М. 2006. Perilaku Petani Sayuran dalam Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CG and EHJohn.1997.Fisiologi Kedokteran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana та NL Rahmah.2012. Ефективність саргассума дублює екстракти Борі в терапії запальних захворювань кишкових екстрактів у Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Караморі, Г. та А. Папі. 2004. Антиоксиданти при отруєнні фосфорорганічними сполуками. IntJ Pharm Bio Sci, 59 (2): 170-173.

[6] Кокс, C. 2000. Діазинон: Токсикологія. Журнал реформи пестицидів/ Літо 20 (2).

[7] Curthoys, NP і WM Orson. 2014. Функція проксимальних канальців і реакція на ацидоз. Американське товариство нефрології. Клінічний журнал Американського товариства нефрології 9:1627-1638

[8] Джумаді Х. та Х. Сугійоно. 2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon dan Kurkumin Kunyit (Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol.9(1):62-83.

[9] Данлоп, К., Г. Кіранджот, К. Крістал, І. Джуліана, Д. Рупіндер, Д. Жан-Франсуа, ACKim, Дж. Аміш, П. Дж. Макнамара та П. Дж. Роберт. 2014. Терапевтична гіперкапнія запобігає систолічній дисфункції правого шлуночка, спричиненій вдиханням оксиду азоту, у молодих щурів. Elsevier Inc. Вільна радикальна біологія та медицина 9: 35-49.

[10] Елерсек, Т. і Ф. Метка. 2011. Пестициди: вплив впливу пестицидів. InTech Europe. Рієка.

[11] Фрейзер, С.К., К.С.Джон, Ч.Г. Гордон, Б.Грем, Б.Роджер, Н.Шінджі, Н.Акійоші, Д.Біте та Б. Аксель. 2012. Проліферативні та непроліферативні ураження сечової системи щурів і мишей. Токсикологічна патологія, 40:14S-86S

[12] Георгієвський, В.1., Б.Н.Анненков, В.Т.Самохін. 2013. Матеріальне харчування тварин: Дослідження в галузі сільського господарства та харчових наук. Butterworths & Co. (Publishers) Ltd. Лондон. 160-161.

[13] Гупта, RC2012. Друге видання ветеринарної токсикології. Elsevier inc. Waltham. США.

[14]Хубрехт Р. і Дж. Кірквуд. 2010. UFAW: Посібник з догляду та догляду за лабораторними та іншими дослідними тваринами. Університетська федерація захисту тварин. Сполучене Королівство.

[15] Khudair, ZW, ASHanan і KE Manal. 2017. Гістопатологічні зміни, що виникли у внутрішніх органах білого щура після дії діазинону.Bas..Vet.Res. 1(2)

[16] Kubes, P.2000. Індукована синтаза оксиду азоту: трошки добра в усіх нас. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24 липня 2019].

[17] Макнотон, Л., П. Лакшмі, А. М. Марія, К. Норм, М. Ірвін, М. Редван, Х. Оутайба та В. Р. Марек. 2002. Розподіл синтази оксиду азоту в нормальній та циротичній печінці людини. Праці Національної академії наук, том 99, №.26 17161-17166.

[18] Мешер, AL2010. Основна гістологія Джункейри: Текст і атлас 12 видання. Компанії McGraw-Hill, Inc. Сполучені Штати Америки.

[19] Mishra, BP 2013. Антиоксидантний статус і окислювальний стрес при отруєнні органофосфатними пестицидами.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Том 7, Випуск 6 (травень-червень 2013), PP 20-24