Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Натисніть тут, щоб отримати інформацію про частину I (Вступ, матеріали та методи) цієї статті.

Як китайські ліки, які тонізують нирки, пригнічують апоптоз дофамінергічних нейронів?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 і Jing Cai, MD, Ph.D.2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Дизайн

Порівняльне спостереження сироваткової фармакології in vitro.

Час і налаштування

Експерименти проводилися в лабораторії цитобіології Фуцзяньського університету традиційної китайської медицини, Китай, з 2010 по 2011 рік.

Матеріали

Тварини

Загалом 60 самців щурів Wistar віком 8 тижнів, вагою 200–220 г, були придбані у SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Шанхай, Китай (ліцензія № SCXK (Hu) {{4} }). Їх розмістили в Центрі лабораторних тварин Фуцзяньського університету традиційної китайської медицини в Китаї при температурі 20–22 градуси, вологості 40–60 відсотків і освітленні з 7:00 ранку до 7:00 вечора. Їжу надавав Центр лабораторних тварин Фуцзяньського університету традиційної китайської медицини. Усі експериментальні процедури відповідали Рекомендаціям щодо догляду та використання лабораторних тварин, сформульованим Міністерством науки і технологій Китаю[33].

Cistanche для покращення функції нирок

наркотики

Herba Epimedii, надземна частина Epimedium sagittatum Maxim походить з провінції Сичуань, Китай; Semen Cuscutae, сухе зріле насіння Cuscuta Chinensis Lam., було з провінції Шаньдун, Китай; і Herba Cistanches, хілокаулез лускоподібного листя Cistanche deserticola YCMa, був із Сіньцзян-Уйгурського автономного району. Усі ліки були надані компанією Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., провінція Фуцзянь, Китай. Herba Epimedii, Semen Cuscutae і Herba Cistanches, по 97,2 г кожна, занурюють у посудину для відвару, що містить 1 500 мл дистильованої води, швидко нагрівають, кип’ятять, підтримують температуру 100 градусів до дозволити активним компонентам ліків розчинитися і згущити до 540 мл. Неочищена кількість препарату в розчині препарату становила 0,180 г/мл. Розчин фільтрують, поміщають у пляшку, закупорюють, стерилізують і зберігають при 4 градусах. Селегілін, 5 мг × 10 таблеток на набір, був придбаний у Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (провінція Цзянсу, Китай). Селегілін, 21,6 мг, розчиняли у двічі дистильованій воді, щоб отримати 540 мл водного розчину. Концентрація розчину препарату становила 0,04 мг/мл. Розчин препарату поміщали у флакон, закупорювали, стерилізували та зберігали при 4 градусах.

методи

Приготування лікарської сироватки

Групи Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches і селегіліну внутрішньошлунково перфузували сироваткою, що містить лікарський засіб, що містить 0.180 г/мл Herba Epimedii, Semen Cuscutae або Herba Cistanches або {{ 5}}.04 мг/мл селегіліну двічі на день у дозі 0.1 мл/кг протягом 14 днів поспіль. Групі холостої сироватки вводили рівний об’єм дистильованої води. Тварин позбавляли їжі та води протягом 12 годин після останнього введення. Щурів анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін'єкції 0,3 мл/100 г кетаміну гідрохлориду. Кров забирали з черевної аорти та центрифугували при 1 000 об/хв протягом 15 хвилин. Супернатант збирали, деактивували на водяній бані при 56 градусах протягом 30 хвилин, фільтрували через мікропористу мембрану 0,22 мкм і зберігали при –20 градусах.

Приготування 50×розчину Сато

Суміш 60 мл DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, США), 15 мг бичачого інсуліну (Sigma, St. Louis, MO, США), 15 мг трансферину (Sigma), 145,8 мг пірувату натрію (Biosharp, Корея), 12 мг путресцину (Solarbio, Пекін, Китай), 25 мкл селеніту натрію (1 мг/мл, 100 мг/100 мл H2O; Sigma) і 100 мкл прогестерону (0,315 мг). /мл, 15,75 мг/50 мл; Biosharp) піддавали впливу ультразвуку на крижаній бані протягом 1,5 годин, фільтрували через фільтр 0,22 мкм, аликвотували та зберігали при –20°.

Cistanche для лікування функції нирок

Культура клітин

Клітини висівали в DMEM/F12 з додаванням 5 відсотків (об’єм/об’єм) фетальної бичачої сироватки (Gibco), 1 відсоток (об’єм/об’єм) глутаміну (Sigma), 2 відсотки (об’єм/об’єм) 50×Sato’s розчину та 2% (об’єм/об’єм) пеніциліну/стрептоміцину. Потім клітини інкубували в 5% (об./об.) CO2 і підтримували при насиченій вологості при 37 градусах. Клітини трипсинізували 0,25 відсотками (мас./об.) трипсину та пасували. Клітини в логарифмічній фазі збирали для подальших експериментів.

Вплив H2O2 на ріст клітин MES23.5

Клітини висівали в культуральні планшети з 96-лунками (5 × 105 клітин на лунку), інкубували з 50, 100, 150, 200, 300 і 400 мкмоль/л культуральним розчином H2O2 (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd). ., Шанхай, Китай) через 24 години протягом 1, 3, 6, 9, 12, 24 годин, а потім MTT (Sigma) протягом 4 годин. Розчин у лунках викидали та додавали 150 мкл диметилсульфоксиду (Sigma). Культуральний планшет струшували протягом 10 хвилин і визначали абсорбцію зразків при 570 нм за допомогою автоматичного пристрою для зчитування мікропланшетів (EXL800; Biotek, Winooski, VT, США). Свіжоприготований культуральний розчин DMEM/F12 використовували як негативний контроль. У кожну точку часу встановлювали дві паралельні лунки. Експерименти проводили в трьох повторах.

Вплив сироватки, що містить препарат, у різних концентраціях на ріст клітин MES23.5, оброблених H2O2-

Клітини висівали та піддавали дії лікарської сироватки, яка містила 5, 10, 15, 20, 25 та 30 відсотків (об’єм/об’єм) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches та селегілін або порожню сироватку протягом 24 годин. Клітини далі культивували з культуральним розчином, що містить 100 мкмоль/л H2O2 протягом 3 годин, з подальшим MTT протягом 4 годин. У кожній групі встановлювали три паралельні лунки. Свіжоприготований культуральний розчин DMEM/F12 використовували як негативний контроль. Клітини, культивовані в культуральному розчині, що містить 100 мкмоль/л H2O2 і порожню сироватку, слугували модельною групою, а клітини, культивовані лише в порожній сироватці, служили групою порожньої сироватки. Експерименти проводили в трьох повторах. Середнє значення поглинання кожної групи розраховували як рівень виживання клітин.

Проточна цитометрія для експресії FasL, Fas, каспази-3 та Bcl-2 у клітинах MES23.5

Клітини висівали та обробляли, як і раніше. Клітини, культивовані лише в 100 мкмоль/л H2O2, розглядалися як модельна група. Антитіло FasL, мічене фікоеритрином, і контроль ізотипу FasL (5 мкл кожен) додавали у дві пробірки (BD, Сан-Хосе, Каліфорнія, США), рівномірно змішували з клітинами, зберігали при кімнатній температурі в темряві протягом 15 хвилин, центрифугували при 1 000 об/хв протягом 5 хвилин після додавання 2 мл PBS. Супернатант видаляли, а клітини ресуспендували з використанням 500 мкл PBS. Довжина хвилі лазерного пристрою для проточної цитометрії (Facscalibur; BD) становила 488 нм. Швидкість експресії FasL-позитивних клітин аналізували та розраховували програмним забезпеченням Cell Quest (BD). Швидкість експресії Fas-, каспаз-3- і Bcl-2-позитивних клітин була виявлена ​​за допомогою того самого методу.

ІФА на вміст у клітинах фактора росту нервів, нейротрофічного фактора головного мозку та нейротрофічного фактора лінії гліальних клітин

Клітини висівали та обробляли, як описано раніше. Супернатант збирали та вимірювали вміст фактора росту нервів, нейротрофічного фактора, отриманого з мозку, і вміст нейротрофічного фактора, отриманого з лінії гліальних клітин, відповідно до інструкцій виробника (BD). Оптичну густину вимірювали при 450 нм за допомогою автоматичного пристрою для зчитування мікропланшетів (EXL800; Biotek, Winooski, VT, США).

Статистичний аналіз

Результати виражали як середнє значення ± SD. Дані аналізували за допомогою програмного забезпечення SPSS 18.0 (SPSS, Чикаго, Іллінойс, США). Було проведено односторонній дисперсійний аналіз з подальшим множинним порівнянням тестів найменшої значущої різниці. Значення P < 0.05="" вважалося="" статистично="">

Цистанхе для функції нирок

Подяки

Ми дякуємо Chen B, лабораторія нейробіології Столичного медичного університету, за люб’язне надання MES23.5дофамінергічнінервові клітини.

Виноски

Фінансування: це дослідження було підтримано Фондом розвитку інтегративної медицини Чень Кеджі, № CKJ2010025 та Ключовою основою розвитку суспільства в провінції Фуцзянь, № 2013Y0059.

Конфлікти інтересів: не оголошено.

Етичне схвалення: це дослідження отримало дозвіл Комітету з етики тварин Фуцзяньського університету традиційної китайської медицини, Китай.

(Переглянуто Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(За редакцією Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

[1] Zhang ZX, Роман GC, Hong Z та ін. Хвороба Паркінсона в Китаї: поширеність у Пекіні, Сіані та Шанхаї. Ланцет. 2005;365(9459):595–597. [PubMed] [Google Scholar]

[2] He JC, Wang WW. Вплив Tianma Gauteng Yin наапоптозздофамінергічнінейронів у щурів моделі хвороби Паркінсона. Чжуньї Зажи. 2010;51(11):1024–1027. [Google Scholar]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Мітохондрії та запрограмована клітинна смерть при хворобі Паркінсона:апоптозі за його межами. Антиоксидно-відновний сигнал. 2012;16(9):883–895. [PubMed] [Google Scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Етіопатогенез і лікування хвороби Паркінсона. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google Scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA та ін. Терапія нейротрофічним фактором хвороби Паркінсона. Prog Brain Res. 2010;184:237-264. [PubMed] [Google Scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Мозковий нейротрофічний фактор при нейродегенеративних захворюваннях. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Вплив рецепту кущів янбань на функцію нігростріату у модельних щурів із хворобою Паркінсона після тривалого лікування леводопою. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002;22(1):43–46. [PubMed] [Google Scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Вплив відвару Bushen Huoxue на орфанний рецептор і тирозингідроксилазу в мозку щурів із хворобою Паркінсона. Chin J Integr Med. 2011;17(1):43–47. [PubMed] [Google Scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Вплив кущів Хуо Сюе Інь на вміст NF-kB і NO в мозку модельної миші з хворобою Паркінсона. J Tradit Chin Med. 2012;32(1):67–70. [PubMed] [Google Scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ та ін. Захисні ефекти китайського підживленняниркатрави на нейронах нейронів смугастого тіла у миші моделі хвороби Паркінсона. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31(3):440–443. [Google Scholar]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL та ін. Ідентифікація та аналіз активності тирозингідроксилази в клітинах MES23.5. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004;20(1):95–100. [Google Scholar]

[12] Ван XR. Пекін: Народне медичне видавництво; 2007. Експериментальні методи та технології токсикології. [Google Scholar]

[13] Lv SJ. Пекін: China Medical Science Press; 2010. Клінічний імунологічний тест. [Google Scholar]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Молекулярний патогенез хвороби Паркінсона. Arch Neurol. 2005;62(3):353–357. [PubMed] [Google Scholar]

[15] Крістен Ю. Окислювальний стрес і хвороба Альцгеймера. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S–629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R та ін. Нейропротекторний ефект разагіліну в моделі хвороби Паркінсона на гризунах. Exp Neurol. 2004;187(2):455–459. [PubMed] [Google Scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ та ін. Захисна дія ікаріїну наапоптозпервинно культивованих нейронів щурів, індукованих пептидом Aâ{0}}. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixue Ban. 2007;36(3):224–228. [PubMed] [Google Scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Нейрозахисний ефект екстрактів Cuscuta Chinensis Lam на пошкодження нейрональних диференційованих клітин PC12, викликане активними формами кисню. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005;27:69–72. [Google Scholar]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Інгібування екстрактів повилики до серцевого міоцитаапоптозу старіючих мишей. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31:642-644. [Google Scholar]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K та ін. Структурно-активні зв'язки фенілетаноїдних глікозидів у рослинах Cistanche salsa на антиоксидантну активність. Чжун Яо Цай. 2009;32(7):1067–1069. [PubMed] [Google Scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T та ін. Захисні ефекти ехінакозиду на гепатотоксичність, спричинену тетрахлоридом вуглецю, у щурів. Токсикологія. 2007;232(1-2):50–56. [PubMed] [Google Scholar]

[22] Cheng SD. Пекін: Народне медичне видавництво; 2006. Хвороба Паркінсона. [Google Scholar]

[23] Ян Т. Пекін: Народне медичне видавництво; 2010. Клітинна біологія. [Google Scholar]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M та ін. Реципрокні зміни в експресії Bcl-2 і Bax в під'язиковому ядрі після аксотомії у дорослих щурів: можлива участь в індукції загибелі нейронних клітин. Brain Res. 1999;827(1-2):122–129. [PubMed] [Google Scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Мозковий нейротрофічний фактор при нейродегенеративних захворюваннях. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta індукує реакцію GDNF у нейронах шляхом залучення GFRalpha1 до плазматичної мембрани. J Cell Biol. 2002;159(1):157–167. [Безкоштовна стаття PMC] [PubMed] [Google Scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. GDNF терапія хвороби Паркінсона. Експерт Rev Neurother. 2008;8(7):1125–1139. [PubMed] [Google Scholar]

[28] Чатурведі Р.К., Шукла С., Сет К. та ін. Фактор росту нервів збільшує виживаністьдофамінергічнітрансплантат, рятує чорні дофамінергічні нейрони та відновлює функціональний дефіцит у щурячій моделі хвороби Паркінсона. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44–49. [PubMed] [Google Scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR та ін. Функціональність захищених NGF клітин PC12 після впливу 6-гідроксидопаміну. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):890–895. [PubMed] [Google Scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Нейротрофічний фактор, отриманий з мозку, необхідний для встановлення належної кількостідофамінергічнінейрони компактної частини чорної субстанції. J Neurosci. 2005; 25 (26): 6251–6259. [Безкоштовна стаття PMC] [PubMed] [Google Scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Механізм дії гемоксигенази-1 бере участь у посиленні експресії нейротрофічного фактора. Нейрофармакологія. 2010;58(2):321–329. [PubMed] [Google Scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM та ін. Нейропротекція GDNF в ішемізованому мозку. Фактори росту. 2012;30(4):242–257. [PubMed] [Google Scholar]

[33] Міністерство науки і технологій Китайської Народної Республіки. Рекомендації щодо догляду та використання лабораторних тварин. 30 вересня 2006 р.; [Google Scholar]