Як екстракт цистанхи зменшує запальну гіперплазію

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Зменшення запальної гіперплазії в кишечнику у схильних до раку товстої кишки мишей водним екстрактом Cistanche deserticola

Ямін Цзя,1,2 та ін

Цистанхеdeserticola зазвичай використовується в традиційній китайській медицині для лікування багатьох проблем зі здоров'ям, включаючи синдром роздратованого кишечника або запор. Це дослідження було розроблено для перевірки ефективності водного екстракту C. deserticola в профілактиці колоректального раку на моделі миші. Багатий полісахаридами водний екстракт C. deserticola був отриманий шляхом кип’ятіння порошку його стебла в дистильованій воді. В якості експериментальної моделі використовували нульових мишей Tgfb1Rag2. Тут ми показали, що згодовування водного екстракту C. deserticola значно зменшило кількість слизових оболонокгіперплазіята кишкова інфекція Helicobacter у мишей. Цей сприятливий ефект корелював зі значною стимуляцією імунної системи, про що свідчить збільшення селезінки зі збільшенням кількості селезінкових макрофагів і природних клітин-кілерів, а також із більш сильною цитотоксичністю спленоцитів. In vitro водний екстракт C. deserticola посилив цитотоксичність наївних спленоцитів проти лінії клітин раку товстої кишки людини, а в культурах макрофагів посилив експресію синтази оксиду азоту II і стимулював фагоцитоз. На завершення наші дані показують, що пероральне введення екстракту C. deserticola знижуєзапальнийгіперпластичнийполіпи та хелікобактерну інфекцію у мишей завдяки його імуностимулюючій активності, що свідчить про те, що екстракт C. deserticola може мати потенціал для запобігання кишковим запаленням, включаючи колоректальний рак. Авторське право © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Ключові слова: трав'яна імуномодуляція;Цистанхеекстракт; полісахариди; хелікобактер;запальнийгіперплазія; колоректальний рак.

Цистанхеекстрактможе зменшитизапальнийгіперплазія

ВСТУП

Колоректальний рак є третім за поширеністю раком у чоловіків і другим серед жінок у всьому світі та займає четверте місце серед причин смерті від раку (8 відсотків усіх смертей від раку; Ferlay et al., 2010). Епідеміологічні дослідження свідчать про наявність багатьох факторів ризику, пов’язаних із цією хворобою, включаючи генетичні (наприклад, родинна історія раку товстої кишки) (Strate and Syngal, 2005) та харчові фактори (наприклад, червоне м’ясо та низький вміст клітковини; Chao et al., 2005; Park et ін., 2005), ізапальнийзахворювання кишечника (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). На сьогоднішній день, незважаючи на багато нових цитотоксичних препаратів і вдосконалені хірургічні та радіотерапевтичні методи, які використовуються для лікування цього захворювання (Cunningham et al., 2010), значна частина пацієнтів з колоректальним раком все ще залишається невиліковною; За оцінками, у 2008 році в усьому світі від цієї хвороби померло близько 608 000 осіб (Ferlay et al., 2010). Отже, потрібні нові методи лікування, і одним із кандидатів є імунотерапія. Були оцінені різні імунотерапевтичні підходи до лікування колоректального раку, і наразі результати є обнадійливими (Burgdorf et al., 2009). Було продемонстровано, що рослинні полісахариди мають специфічну імунорегуляторну дію (Jiang et al., 2010), що свідчить про те, що ці рослинні продукти можна використовувати як специфічний імуностимулюючий ад’ювант проти колоректального раку.

Цистанхеdeserticola Ma, відомий як Rou Cong Rong у китайській трав’яній медицині, був включений у трав’яні формули для багатьох проблем зі здоров’ям, включаючи імпотенцію, хворобливі білі та синдром роздратованого кишечника/запор (Jiang and Tu, 2009). Експериментальні дослідження виявили різну біологічну активність різних екстрактів C. deserticola; Екстракт фенілетаноїдних глікозидів цієї рослини має противтомну дію у мишей (Cai та ін., 2010), а також болезаспокійливу та анти-запальнийефектів у гризунів (Lin та ін., 2002), тоді як його полісахариди стимулюють проліферацію Т- і В-лімфоцитів у культурах лімфоцитів (Wu та ін., 2005; Dong та ін., 2007). Однак ефективність екстракту полісахаридів C. deserticola щодо стимуляції імунної відповіді in vivo ще не досліджувалася.

Ганчірка2^-/-у мишей відсутні зрілі Т- і В-лімфоцити, і на змішаному фоні (~97 відсотків 129 S6 і ~3 відсотки CF-1) спонтанно розвивається запалення, пов’язанегіперплазіяв кишечнику (Engle et al., 1999). Генетичне введення нульового алеля Tgfb1 (ген трансформуючого фактора росту b1 (TGF-b1)) у цю лінію мишей призводить до подальшого прогресуваннягіперплазіядо аденоми та карциноми (Engle et al., 2002), а залежний від патогенної мікрофлори коліт необхідний для розвитку раку товстої кишки (Engle et al., 2002), що свідчить про те, що цей штам мишей є ідеальною моделлю для вивчення потенційної терапії при лікуванні запалення/зЗК-індукованого колоректального раку. У цьому дослідженні ми вперше продемонстрували ефективність багатого полісахаридами водного екстракту C. deserticola у зниженнізапальнийгіперплазіяв цій моделі.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Насичений полісахаридами водний екстракт препарату C. deserticola.

Трав’яний C. deserticola був зібраний доктором Y. Guo (Китайський сільськогосподарський університет) в автономному регіоні Внутрішня Монголія, Китай. Порошок цілих висушених стебел (300 г) двічі кип’ятили у бідистильованій воді: спочатку протягом 1 год у 500 мл води, потім збирали надосадову рідину, потім протягом 45 хв у 400 мл води. Супернатанти фільтрували через фільтрувальний папір Whatman (середньої швидкості) після кожного разу кип’ятіння та об’єднували разом. Розчин екстракту сушили шляхом ліофілізації та витримували при 80°C. Кінцевий продукт становив приблизно 10 г (вихід: ~3 відсотки).

Миші та клітинні культури. Миші з дефіцитом TGF-b1 (Tgfb1 плюс /- Rag2^-/-) на змішаному фоні (~97 відсотків 129 S6 і ~3 відсотки CF-1) були отримані з племінної колонії, яка утримувалася в умовах, вільних від патогенів, у тваринницькому приміщенні дослідницького центру Джека Белла (Ванкувер, Британська Колумбія). Ці миші походять із репозиторію Консорціуму мишачих моделей раку людини (MMHCC) (Національний інститут раку у Фредеріку, штат Меріленд, США). Миші C57BL/6 J (B6) (самці, віком 8–10 тижнів) були придбані в лабораторії Джексона (Бар-Харбор, Мен, США). Усіх тварин для експериментів утримували в умовах звичайного утримання та дієти (5001 Rodent Diet, LabDiet) після відлучення у віці 4 тижнів, а лікування травами та збір зразків проводили відповідно до рекомендацій Канадської ради з догляду за тваринами.
протоколи, схвалені Підкомітетом з використання тварин Університету Британської Колумбії.

Як клітинну лінію аденокарциноми товстої кишки людини SW480, так і клітинну лінію макрофагів мишачого лейкему RAW 246.7 вирощували в середовищі Ігла, модифікованому Дульбекко (DMEM, Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США), що містило 10 відсоток ембріона великої рогатої худоби сироватки (FBS) (повне середовище DMEM) при 37-C у зволоженому 5% CO2/95% повітряному інкубаторі. Спленоцити виділяли шляхом обережного розбивання фрагментів селезінки у фосфатно-сольовому буфері (PBS) з подальшим видаленням еритроцитів за допомогою буфера для лізису (0. 15 М NH4Cl, 1,0 мМ KHCO3, 0,1 мМ EDTA, pH 6,8). Після повторного промивання PBS спленоцити суспендували в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10 відсотків FBS (повне середовище RPMI).

Цистанхеекстрактможе зменшитизапальнийгіперплазія

Лікування екстрактом.

Екстракт трав, назЦистанхеекстракту цьому дослідженні був остаточно приготовлений шляхом розчинення висушеного порошку стерилізованою двічі дистильованою водою та містив 2–3 відсотки (маса/маса) фенілетаноїдів, 65–70 відсотків (маса/маса) полісахаридів і 0.6–1 відсоток (маса/маса) білка на основі наступних аналізів: кількість фенілетаноїдів визначали за поглинанням при 332 нм за допомогою раніше описаної спектрофотометрії (Ouyang et al., 2005); вміст полісахаридів вимірювали стандартним фенолсульфатно-кислотним методом (Dubois et al., 1956) після осадження етанолом; білок визначали за допомогою аналізу білка Bio-Rad згідно з протоколом виробника (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, США). Згідно з нашим пілотним дослідженням, доза екстракту Cistanche становила 0,4 г/кг/день. Середнє споживання води дорослою мишею на день становило приблизно 4 мл, а якщо 1 мл питної води містив 3 мгЦистанхеекстракткожній миші перорально вводили 12 мг екстракту на день. Виходячи з того, що середня маса тіла дорослої миші становила 30 г, питна вода, що містить 3 мг/млЦистанхеекстрактдав мишам дозу 0,4 г/кг/день. Мишей лікували, даючи питну воду ad labium, що містила 3 ​​мг/млЦистанхеекстрактякий поповнювався не рідше одного разу на два дні, починаючи з двомісячного віку протягом трьох місяців у звичайному приміщенні тваринницького закладу.

Гістологічна оцінка колоректального раку.

Наприкінці тримісячного лікування тканини тонкої та товстої кишки збирали та розкривали поздовжньо, після чого обережно промивали вміст PBS. Загалом було зібрано шість шматочків (кожен довжиною 2 см) кишкової тканини від кожної миші: три з тонкої кишки в проксимальному, середньому та дистальному місцях; два з товстого кишечника в проксимальному і дистальному відділах і один зі сліпої кишки. Всі тканини фіксували в 10% формаліні і заливали в парафін. Кожен зріз фарбували гематоксиліном і еозином (HE) для гістологічної оцінки колоректального раку. Класифікацію захворювання проводили за ознаками патологіїгіперплазія, аденоми або карциноми в кожному зразку, як описано раніше (Engle et al., 1999) методом сліпого тестування. Загальна кількість кожної патологічної зміни (гіперплазія, аденоми та карциноми) підраховували у двох зрізах кишкової тканини для кожної миші.

Цистанхеекстрактможе зменшитизапальнийгіперплазія

Виявлення Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) у фекаліях мишей.

Для перевірки ефектуЦистанхеекстрактна ріст патологічної мікрофлори в кишечнику H. hepaticus у фекаліях визначали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з видоспецифічними праймерами 16S рДНК, як описано раніше (Shames et al., 1995). Приблизно 200 мг свіжих фекалій розчиняли в 1 мкл PBS та інкубували при 50 градусах протягом 30 хвилин, після чого центрифугували при 8000 об/хв протягом 10 хвилин. Супернатант (200 мл) збирали та змішували з рівною кількістю розчину протеїнази К, що містив 5 відсотків (об’єм/об’єм) 18,7 мг/мл розчину протеїнази К (Fermentas Canada, Берлінгтон, Онтаріо, Канада) у буфері для переварювання (50 мкМ Tris–HCl, рН 8,0, 0,1 М EDTA, 0,5% додецилсульфату натрію) та інкубували при 70 °C протягом 30 хв. ДНК в отриманому розчині екстрагували за допомогою набору QIAprep Miniprep згідно з протоколом виробника (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada).
Ампліфікацію бактеріальної ДНК методом полімеразної ланцюгової реакції проводили в суміші, що містила {{0}}.75 мкл 10 буфера для ПЛР, 0.5 мкл 50 мМ MgCl2, 0,5 мкл кожного праймера (смисловий: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; антисмисловий: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 мМ кожен), 0,5 мкл полімерази Taq, 18,75 мкл вільної від нуклеази води та 1 мкл некількісного розчину ДНК фекалій. Суміш для ПЛР нагрівали при 94 градусах протягом 5 хвилин, потім 40 циклів денатурації при 94 градусах протягом 1 хвилини, відпалу при 55 градусах протягом 1,25 хвилини та подовження при 72 градусах протягом 1,5 хвилини. ПЛР завершували етапом елонгації тривалістю 10 хвилин при 72 градусах. Отриманий продукт ПЛР (25 мкл) піддавали електрофорезу на 1% агарозному гелі в трис-ацетат-EDTA (TAE) буфері, що містить 0,5 мг/мл броміду етидію, і візуалізували в УФ-світлі.

Визначення макрофагів і природних клітин-кілерів (NK).

Відсоток макрофагів і NK-клітин у суспензії спленоцитів визначали за допомогою аналізу сортування клітин, що активується флуоресценцією (FACS). Один мільйон спленоцитів у буфері FACS інкубували з відповідною комбінацією антитіл для різних фенотипів клітин у льоду: анти-CD3-флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) і анти-CD49b-фікоеритрин (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Канада) для CD3 CD49b плюс NK-клітин і щурячий антимишачий F4/80 плюс як первинне антитіло та антищурячий IgG-FITC як вторинне антитіло (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) для F4/80 плюс макрофаги. Інтенсивність флуоресценції для кожного типу клітин вимірювали за допомогою проточної цитометрії та аналізували шляхом порівняння з фоновими контролями за допомогою програмного забезпечення CELLQUEST (BD Biosciences).

Тест на цитотоксичність кальцеїн-ацетоксиметил (кальцеїн-АМ).

Літичну активність ефекторних спленоцитів проти клітин-мішеней SW480 оцінювали за допомогою аналізу цитотоксичності кальцеїну-АМ з використанням системи спільного культивування, як описано раніше (Neri et al., 2001). Коротко кажучи, клітини SW480 були помічені флуоресцентним барвником кальцеїн-АМ наступним чином: 1 x 10⁶клітин/мл клітин SW480 у повному середовищі DMEM інкубували з 15 мкМ кальцеїну-AM при 37 градусах з періодичним струшуванням. Після 30 хв інкубації клітини ретельно промивали повним середовищем DMEM для видалення позаклітинного барвника. Мічені флуоресцентним барвником клітини SW480 у повному середовищі DMEM (0,2 x 10⁶клітин/{{0}}.25 мл/лунку) висівали в 24-лункові планшети. Виходячи з різних співвідношень (12:1, 6:1, 3:1 та 1,5:1) E (ефектор): T (мішень), спленоцити в 0.25 мл повного середовища RPMI на лунку додавали в лунки з клітинами-мішенями в трьох повторах. Спільні культури інкубували при 37 градусах у 5% CO2 протягом 24 годин. Супернатанти збирали після обертання планшета при 2000 об/хв протягом 5 хв. Вивільнення кальцеїну-АМ у супернатант визначали за допомогою мікропланшетного спектрофлуориметра (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) при випромінюванні 527 нм при збудженні при 485 нм. Клітини-мішені, інкубовані із сумішшю 0,25 мл повного середовища DMEM і 0,25 мл повного середовища RPMI, використовували як контроль фону або спонтанного вивільнення, а в присутності 2 відсотків Triton X-100 використовували як максимальний контроль випуску. Цитотоксичність спленоцитів розраховували наступним чином:

Вимірювання оксиду азоту (NO). Оксид азоту, що виділяється з клітин, швидко окислюється до нітриту в культуральному середовищі. Таким чином, концентрацію нітратів у середовищі визначали за допомогою методу Ґрісса як вимірювання продукції NO. RAW264,7 клітинок (0,25 x 10⁶

клітин/лунку в 0.5 мл повного середовища DMEM) в 24-планшети з лунками стимулювалиЦистанхеекстракт(50–200 мг/мл) і ліпополісахарид (ЛПС) (10 нг/мл) як позитивний контроль. Після 24 годин обробки 50 мл супернатанту культури спочатку змішували з 50 мл 1% розчину.
сульфаніламіду в 5% фосфорної кислоти в 96-планшети з лунками в трьох примірниках і інкубували протягом 10 хв, потім до кожної лунки додавали 50 мл 0,1% дигідрохлориду нафтилетилендіаміну в дистильованій воді. Поглинання зчитували при 550 нм після інкубації протягом 10 хвилин, і рівень NO/нітриту розраховували за допомогою стандартної кривої з відомими концентраціями нітриту натрію.

Цистанхеекстрактможе зменшитизапальнийгіперплазія

Вестерн-блот.

Клітинні рівні синтази оксиду азоту II (NOS 2 або iNOS) досліджували методом вестерн-блоттингу, як описано раніше (Du et al., 2006). Коротко, зразки білка (приблизно 100 мг/зразок) фракціонували за допомогою 7% SDS-PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану. Білкові смуги NOS II ідентифікували за допомогою первинного кролячого поліклонального анти-NOS II антитіла (N-20) (розведення 1:500; Santa Cruz Biotech, Санта-Крус, Каліфорнія, США) і вторинного козячого антитіла IgG кролика ( Розведення 1:10000; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). Комплекс білок-антитіло NOS II візуалізували за допомогою розширеного хемілюмінесцентного аналізу (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Бакінгемшир, Англія). Блоти повторно досліджували за допомогою анти-b-актину IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) для підтвердження навантаженого білка в кожному зразку.

Тест на фагоцитоз. Фагоцитоз вимірювали за кількістю мічених флуоресценцією латексних кульок (SigmaAldrich Canada, L-3030, модифікованих карбоксилатом, середній розмір 2 мм), охоплених клітинами RAW264.7, як описано раніше (Wu et al., 2{{ 9}}07). Коротко кажучи, клітини RAW264.7 (0,1 106 клітин/0,5 мл/лунку) у повному середовищі DMEM висівали в 24-лункові планшети та стимулювали 100 мг/млЦистанхеекстрактабо повне середовище DMEM лише як контроль. Після нічної стимуляції 2,5 мл флуоресцентних латексних кульок на лунку додавали до культур макрофагів та інкубували протягом 2 годин. Для проточної цитометрії клітини відокремлювали піпетуванням після промивання PBS, а інтенсивність флуоресценції фагоцитуючих клітин вимірювали проточним цитометром і аналізували шляхом порівняння з фоновими контролями (без кульок) за допомогою програмного забезпечення CELLQUEST (BD Biosciences).

Статистичний аналіз.

Дані були представлені як середнє плюс стандартне відхилення (SD). Для порівняння даних між групами проводили дисперсійний аналіз (ANOVA) або t-критерій Стьюдента. P-значення < 0.05="" вважалося="">

РЕЗУЛЬТАТИ

Лікування сЦистанхеекстрактзнижує частотугіперплазіята кишкова інфекція H. hepaticus Протягом періоду лікування (3 місяці) вагу тіла та споживання питної води контролювали один раз кожні 2 дні у мишей групи, що отримували екстракт, порівняно з групою, що отримувала носій, істотної різниці не було зазначено (дані не показані). Гістологічний аналіз, однак, показав, що пероральний прийомЦистанхеекстрактизначно скоротилася кількістьзапальнийгіперплазіяв кишечнику (рис. 1), про що свідчить той факт, що миші, які отримували воду з екстрактом, мали меншегіперплазія(5.00 плюс -2.83/миша, n=15), ніж ті, хто п’є просту воду або транспортний засіб (7,53 плюс -3.09/миша, n {{9) }}) (екстракт проти транспортного засобу: p=0.0133, t-тест). Різниця в кількості аденом і карцином між мишами, які отримували екстракт і носій, не була статистично значущою, оскільки лише кілька мишей мали ці стадії патологічних змін (дані не показані).

Рисунок 1. Зменшення випадків гіперплазії шляхом лікування водним екстрактом C. deserticola (Цистанхеекстракт). Tgfb1 плюс /-Rag2-/- мишей годувалиЦистанхеекстракту питній воді (група «Екстракт») у порівнянні з тими, що містять лише звичайну питну воду (група «Розчинник»). Ракові ураження в кишечнику були досліджені гістологією з фарбуванням H&E. (A) Типове зображення зрізу здорової тканини. (B) Типове зображення гіперплазії в розрізі, позначеному стрілкою. (C) Кількість гіперплазій у кишечнику кожної тварини підраховували за допомогою гістології (p=0.0133, екстракт проти носія, n=15). Цей малюнок доступний у кольорі онлайн за адресою wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Було продемонстровано, що мікробний вміст кишківника, зокрема інфекція H. hepaticus, необхідний для розвитку всіх стадій раку товстої кишки, включаючи гіперплазію в Rag2^-/- мишей (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Перевірити, чи лікування сЦистанхеекстрактизниження патологічної мікрофлори в кишечнику, наявність H.hepaticus у фекаліях мишей, які отримувалиЦистанхеекстрактвизначали за допомогою ПЛР порівняно з контролем транспортного засобу. У кожному експерименті по три миші на клітку отримували екстракт цистанхи або носій. Зразки стільця збирали наприкінці 14- год протягом нічного періоду після очищення клітки. Як показано на рис. 2, рДНК H. hepaticus 16S у фекаліях було ефективно виявлено методом ПЛР. У трьох окремих експериментах (табл. 1) лише 20–40 відсотків зразків зЦистанхе-екстрактмиші, які отримували лікування, були виявлені як ПЛР-позитивні, тоді як 60–80 відсотків контрольних мишей були позитивними (екстракт проти носія: p=0.0189, t-тест, n=3), що свідчить про те, що лікування Екстракт цистанхи зменшив кишкову інфекцію H. hepaticus у мишей.

Лікування екстрактом цистанхи збільшує кількість селезінкових макрофагів і NK-клітин

Ключову роль в усуненні хелікобактерної інфекції відіграє імунна відповідь. Вивчити якщоЦистанхе екстрактлікування вплинуло на імунну систему цих схильних до раку товстої кишки мишей, розмір селезінки (12 мишей у кожній групі) і кількість спленоцитів (шість мишей, випадково відібраних з кожної групи) визначали наприкінці лікування. Селезінки 12 мишей у кожній групі були зважені, інші три миші в початковий експеримент не були включені. Як показано в таблиці 2,Цистанхе-екстракт-ліковані миші (0.055 плюс -0.022 г/селезінка) були важчі, ніж у групі носія (0.038 плюс -0.01 г/селезінка; екстракт порівняно з транспортним засобом: p=0.04, t-тест). Ці дані були додатково підтверджені збільшенням кількості спленоцитів у мишей, які отримувалиЦистанхеекстракт, позначається 7,095 плюс -1,353 (x10⁶ клітин/селезінка) порівняно з 2,941 плюс -1,492 (x10⁶клітини/селезінка) контрольні миші в транспортному засобі (екстракт проти транспортного засобу: p=0.002, t-тест).

Щоб додатково оцінити, чиЦистанхеекстрактлікування вплинуло на певний підтип спленоцитів у мишей, кількість NK-клітин селезінки (CD3^-CD49b^плюсклітини) і макрофаги (FT/80^плюсклітин) підраховували аналізом FACS. Відсоток CD3^-CD49b^плюсклітини в спленоцитахЦистанхе-екстрактмишей, які отримували лікування (32,06 плюс -2.13 відсотка), не відрізнялося суттєво від такого у мишей, які отримували носій (28,47 плюс -2.74 відсотка; екстракт проти носія: p=0). 3741, t-тест, n=6), але загальна кількість NK-клітин у селезінціЦистанхе-екстракт-оброблені миші (2,22 плюс - 0.44x10⁶/селезінка) була вищою, ніж у контрольній групі автомобіля (0.83 плюс -0.17x10⁶/селезінка; екстракт проти транспортного засобу: p=0.01, t-тест, n=6; рис. 3B). Подібні результати спостерігалися при дослідженні селезінкових клітин FT/80 plus; як і в популяції NK-клітин селезінки, різниця у відсотках селезінкових FT/80 плюс клітин між мишами, які отримували екстракт (35,25 плюс -7.28 відсотків), і контрольними мишами (31,74 плюс -5). 07 відсотків ) не було значущим (екстракт проти носія: p=0.407, n=6), але загальна кількість селезінкових макрофагів у групі, що отримувала екстракт (2,439 плюс -0 .452x10⁶клітин/селезінка) була вищою, ніж у контрольних групах (1,114 плюс -0.685x10⁶клітини/селезінка; екстракт проти транспортного засобу: p=0.001, t-тест, n=6; рис. 3D). У сукупності ці дані свідчать про те, що лікування сЦистанхеекстрактможе збільшити загальну кількість, але не відсоток або пропорцію підтипів ефекторних спленоцитів, NK-клітин і макрофагів у селезінці.

Малюнок 3. Збільшення кількості NK-клітин і макрофагів селезінки при лікуванніЦистанхеекстракт. NK-клітини або макрофаги в суспензії спленоцитів визначали за допомогою FACS-аналізу з комбінованим фарбуванням FITC-анти-CD3e антитіла та APC-анти-CD49b/Pan-NK-клітинного маркера (для NK-клітин) або одним фарбуванням FITC-анти-CD3e. FT/80 (для макрофагів). (A) Репрезентативний графік відсотка NK-клітин селезінки (CD3^-CD49b^плюс) у спленоцитах мишей, які отримувалиЦистанхеекстрактпроти автомобіля. (B) Загальна кількість NK-клітин на селезінку. Дані представлені як середнє плюс -SD у кожній групі (p= 0.01, n= 6). (C) Представницький графік відсотка селезінкових макрофагів (FT/80 плюс) у спленоцитах мишей, які отримувалиЦистанхеекстрактпроти автомобіля. (D) Загальна кількість макрофагів на селезінку. Дані представлені як середнє плюс -SD у кожній групі (p= 0.001, n=6).

Лікування екстрактом цистанхи стимулює цитотоксичність спленоцитів in vivo та in vitro

Імунна відповідь залежала не тільки від кількості спленоцитів, але й від їх функції, наприклад цитотоксичності. Ефект відЦистанхеекстрактлікування на функцію спленоцитів (тобто цитотоксичність) перевіряли на спільних культурах з клітинами SW480. Як показано на рис. 4A, цитотоксичність спленоцитів мишей, які отримувалиЦистанхеекстрактбула вищою, ніж у клітин мишей, які отримували носій, що вказувалося на 39,38 плюс -2.64 відсотка вивільнення кальцеїну-АМ у спільних культурах спленоцитів, оброблених екстрактом, із клітинами SW480 на 6 співвідношення :1, 51,11 плюс -2.6 відсотка при співвідношенні 3:1 і 57,33 плюс -2.53 відсотка при співвідношенні 1,5:1 порівняно з 27.75- 0.18 відсотків у спільних культурах спленоцитів, оброблених носієм, із клітинами SW480 у співвідношенні 6:1, 40.97 =-2.85 відсотків у співвідношенні 3:1 та 45,16 плюс -0.18 відсотків у Співвідношення 1,5:1 (екстракт проти носія: p <0,0001, двосторонній="" дисперсійний="" аналіз).="" щоб="" додатково="" підтвердити="" стимулюючу="">Цистанхеекстрактна цитотоксичність спленоцитів, цитотоксичністьЦистанхе-екстрактСпленоцити мишей B6, оброблені наївними препаратами, що містять функціональні Т- і В-клітини, досліджували в спільних культурах з клітинами SW480. Як показано на рис. 4B, додаванняЦистанхеекстракт(100 мг/мл) значно збільшив вивільнення кальцеїну-АМ у спільних культурах залежно від спленоцитів: 57,64 плюс -3.41 відсоток у співвідношенні 12:1, 52,25 плюс { {11}}.77 відсотка при співвідношенні 6:1 і 45,72 плюс -2.43 відсотка при співвідношенні 3:1 порівняно з 14,36 плюс -0.05 відсотка при співвідношенні 12:1 , 20,67 плюс -2.03 відсотка при співвідношенні 6:1 і 23,1 плюс -3.73 відсотка при співвідношенні 3:1 у нестимульованих спільних культурах (екстракт проти носія: p <0,0001, два="" -way="" anova).="" ці="" результати="" свідчать="" про="">Цистанхеекстрактстимулює літичну активність спленоцитів. Причина, чому спостерігалася менша цитотоксичність при додаванні більшої кількості ефекторних спленоцитів, невідома. Однією з можливостей було те, що рівень вивільнення кальцеїну-АМ у цій системі спільного культивування міг не точно відображати загибель клітини-мішені, оскільки кальцеїн-АМ міг повторно поглинатися ефекторними спленоцитами після тривалого періоду інкубації.

Екстракт цистанхи активує макрофаги

Активація макрофагів є однією з критичних імунних реакцій проти інфекції та розвитку пухлини (Mantovani et al., 2002, 2008). Щоб глибше розкрити розуміння механізмів, за допомогою якихЦистанхеекстрактлікування зменшує кишкову гіперплазію та мікробний вміст, ефектЦистанхеекстрактна продукцію NO та фагоцитоз макрофагів, клітин RAW264.7. Як показано на рис. 5A, експресія білка NOS II посилювалася в культурах після інкубації зЦистанхеекстракт. Ці результати були додатково підтверджені збільшенням виробництва NO вСтимульований екстрактом цистанхикультури (рис. 5B), що підтверджено 3,88 плюс -0.13 мМ нітриту в 50 мг/млЦистанхеекстрактстимульовані клітинні культури RAW264.7 порівняно з 0.11 плюс -0.12 мМ нітриту в нестимульованих контрольних культурах (однофакторний ANOVA, p<>

Фагоцитоз — це клітинний процес поглинання твердих частинок, наприклад бактерій. Як показано на рис. 5C і D, додаванняЦистанхеекстрактистимулював фагоцитоз макрофагів, про що свідчить більша кількість фагоцитуючих клітин (9,8 плюс -0,1 відсотка), знайдених уЦистанхе-екстракт-стимульовані культури макрофагів порівняно з тими (5,2 плюс -0.4 відсотка) у культурах, стимульованих носієм (екстракт проти носія: p=0.0007, t-тест, n=3) після 2 год інкубації. Ці дані свідчать про теЦистанхеекстрактможе безпосередньо активувати макрофаги шляхом посилення локального виробництва NO та стимуляції фагоцитозу макрофагів у кишечнику мишей.

ДИСКУСІЯ

Це дослідження вперше демонструє, що пероральне введенняЦистанхеекстрактзначно знижує частоту гіперплазії та інфекції H.hepaticus у кишківнику схильних до раку товстої кишки мишей. Благотворний ефект відЦистанхеекстрактлікування пов'язане зі збільшенням кількості та цитотоксичності селезінкових NK-клітин і макрофагів. Додавання in vitroЦистанхеекстрактстимулює продукцію NO і фагоцитоз в макрофагах. Rag2 з дефіцитом TGF-b1^-/-було продемонстровано, що рак товстої кишки (гіперплазія, аденома або аденокарцинома) розвивається у мишей у віці від 3 до 6 місяців, і було продемонстровано, щозапальнийвогнища завжди пов’язані з цими пухлиноподібними ураженнями (Engle et al., 1999). Подальші дослідження показали, що у цих мишей розвиток раку товстої кишки необхідний для присутності інфекції патогенної мікробної флори, оскільки рак товстої кишки повністю ліквідується при утриманні мишей у вільних від мікробів умовах (Engle et al., 2002), і H. hepaticus інфекція також викликає коліт і карциному товстого кишечника в Rag2-/-мишей (Erdman et al., 2003). Подібним чином у людей мікробний статус та імунітет господаря є ключовими факторами прогресування ЗЗК (Fiocchi, 1998), а карцинома шлунка, як повідомлялося, пов’язана з індукованою H. pylori хронічною інфекцією або запаленням (Parsonnet et al., 1991; Ель-Омар і Малфертейнер, 2001). Результати цих досліджень показують, що шлунково-кишкові інфекції можуть відігравати ключову роль у розвитку раку товстої кишки. Таким чином, націлювання на шлунково-кишкові інфекції може стати терапевтичною стратегією для профілактики або лікування раку товстої кишки, а також IBD. Наше дослідження вперше демонструє, що пероральне введенняЦистанхеекстрактзнижує частотузапальнийгіперплазіяу кишечнику та кількість H.hepaticus у фекаліях у мишей з дефіцитом TGF-b1. Благотворний ефект відЦистанхе екстрактможе бути наслідком його активації макрофагів, про що свідчить збільшення виробництва NO та фагоцитозу після лікування препаратомЦистанхеекстракт(Рис. 5), що може обмежити кишкову патогенну мікрофлору, включаючи helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Як наслідок, ураження взапальнийгіперплазіябуло скорочено.

В екстрактах C. deserticola виявлено різноманітні біоактивні сполуки, включаючи фенілетаноїдні глікозиди та полісахариди (Jiang and Tu, 2009). Фенілетаноїдні глікозиди є цитопротекторними, про що свідчить той факт, що ці сполуки запобігають загибелі клітин у культивованих гепатоцитах і нейронах гранул мозочка (Xiong та ін., 1998; Pu та ін., 2003). Тоді як полісахариди стимулюють індуковану мітогеном проліферацію Т- і В-лімфоцитів (Wu and Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Було добре задокументовано, що полісахариди рослинного походження модулюють імунну відповідь (Jiang et al., 2010).Цистанхеекстрактмістить 2-3 відсотки фенілетаноїдів і 65-70 відсотків полісахаридів, що свідчить про імуномодулюючу діюЦистанхеекстрактлікування може бути зумовлене імунорегуляторною активністю полісахаридів, більшості біологічно активних речовин у екстракті цистанхи. Однак цільові імунні клітини (наприклад, макрофаги або NK-клітини, або обидва) і молекулярні шляхи вимагають подальшого дослідження. Крім того, нещодавнє дослідження демонструє, що введення рослинного фенілетаноїду ацетоніду, одного з біоактивних фенілетаноїдів в екстракті C. deserticola (Xiong та ін., 1996; Jiang і Tu, 2009), має сприятливий вплив на зниження декстрану. сульфат-натрій-індукований коліт у мишей (Hausmann et al., 2007), що свідчить про те, що фенілетаноїди (2–3 відсотки) уЦистанхеекстрактможе принаймні частково сприяти його ефективності в зниженнізапальнийгіперплазія, що також потребує оцінки в майбутньому.
Підсумовуючи, колоректальний рак є одним із найпоширеніших видів раку в усьому світі, якому в більшості випадків можна запобігти. Використання нетоксичних рослинних екстрактів може запропонувати ефективну стратегію для запобігання розвитку колоректального раку, а також може застосовуватися як хіміо-ад’ювант, який може сприяти підвищенню протипухлинної ефективності хіміотерапевтичних препаратів та/або зменшенню хіміотерапевтичного ефекту. побічні ефекти. Дані, представлені в цьому дослідженні, чітко демонструють, що лікування водним екстрактом C. deserticola зменшує гіперплазію та інфекцію H. hepaticus у кишечнику схильних до раку товстої кишки мишей. Хелікобактерна інфекція або кишечникзапаленнягіперплазіяє фактором ризику розвитку колоректального раку. Наше поточне дослідження показує, що використання цієї трави може мати потенціал для профілактики та лікування колоректального раку, особливо для тих осіб, які мають IBD.

Подяка

YM був підтриманий стипендією для аспірантів від Ради стипендій Китаю.

Конфлікт інтересів

Автори не мають конфлікту інтересів.

Цистанхеекстрактможе зменшитизапальнийгіперплазія

Від: «ЗменшеннязапальнийГіперплазіяв кишечнику у схильних до раку товстої кишки мишей водним екстрактомЦистанхеdeserticola' Яміна Цзя,1,2 та ін

---Авторське право © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. рез. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Імунотерапія колоректального раку. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Антивтомна активність екстракту, багатого на фенілетаноїди зЦистанхеdeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ та ін. 2005. Споживання м'яса та ризик колоректального раку. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ та ін. 2010. Колоректальний рак. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Структурна характеристика та імунологічна активність двох екстрагованих холодною водою полісахаридів зЦистанхеdeserticola YC. мама Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Ду С, Гуань К, Діао Х, Інь З, Джевнікар А.М. 2006. Оксид азоту індукує апоптоз в епітеліальних клітинах ниркових канальців шляхом активації каспази-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Колориметричні методи для визначення цукрів споріднених речовин. Анальна хімія 28: 350–356.

Іден Дж.А., Абрамс К.Р., Мейберрі Дж.Ф. 2001. Ризик колоректального раку при виразковому коліті: мета-аналіз. Кишка 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori і рак шлунка. Curr Opin Gastroenterol 17 (Додаток 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Трансформуючий фактор росту beta1 пригнічує неметастатичний рак товстої кишки на ранній стадії пухлиноутворення. Cancer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pavlowski S та ін. 2002. Ліквідація раку товстої кишки у безбактерійних мишей з дефіцитом трансформуючого фактора росту бета 1-. Cancer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M та ін. 2003. CD4 плюс CD25 плюс регуляторні Т-лімфоцити пригнічують індукований мікробами рак товстої кишки у мишей з дефіцитом Rag2-. Am J Pathol 162: 691–702.
Ферлей Дж., Шин Х.Р., Брей Ф., Форман Д., Мазерс К., Паркін Д.М. 2010. Оцінки світового тягаря раку в 2008 році: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Фіоккі К. 1998.запальнийзахворювання кишечника: етіологія та патогенез. Гастроентерологія 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH та ін. 2007. Лікування in vivo рослинним фенілетаноїдом актеозидом полегшує запалення кишечника при коліті, спричиненому декстрансульфатом натрію. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Імунорегуляторні дії полісахаридів з китайської фітотерапії. Експерт Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Аналіз хімічних складових вЦистанхевидів. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Антиноцицептивні та анти-запальнийдіяльність, викликанаЦистанхеdeserticola у гризунів. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Лукас М. 2010.запальнийзахворювання кишечника як фактор ризику колоректального раку. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Запалення, пов’язане з раком. Природа 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Поляризація макрофагів: асоційовані з пухлиною макрофаги як парадигма для поляризованих мононуклеарних фагоцитів M2. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Аналіз кальцеїн-ацетоксиметил цитотоксичності: стандартизація методу, що дозволяє проводити додаткові аналізи відновлених ефекторних клітин і супернатантів. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Покращене виробництво фенілетаноїдних глікозидівЦистанхеклітини deserticola, культивовані в ерліфтному біореакторі з внутрішньою петлею з стояком сита. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Парк Y, Hunter DJ, Spiegelman D та ін. 2005. Споживання харчових волокон і ризик колоректального раку: об’єднаний аналіз проспективних когортних досліджень. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Інфекція Helicobacter pylori та ризик раку шлунка. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromЦистанхеsalsa пригнічує апоптоз іоном 1-метил-4-фенілпіридинію в нейронах гранул мозочка. Planta Med 69: 65–66.
Шеймс Б., Фокс Дж.Г., Дьюхірст Ф., Ян Л., Шен З., Тейлор Н.С. 1995. Ідентифікація поширеної інфекції Helicobacter hepaticus у фекаліях комерційних колоній мишей за допомогою культури та аналізу ПЛР. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Синдроми спадкового колоректального раку. Cancer Causes Control 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Ризик раку у пацієнтів із хворобою Крона. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Протеомний аналіз ефектів пікногенолу в макрофагах RAW 264.7 показує індукцію експресії катепсину D і посилення фагоцитозу. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Ву XM, Гао XM, Цім KW, Ту PF. 2005. Арабіногалактан, виділений зі стебелЦистанхеdeserticola індукує проліферацію культивованих лімфоцитів. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-глюкани зЦистанхеdeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Гепатопротекторна активність фенілетаноїдів зЦистанхеdeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Антиоксидантні ефекти фенілетаноїдів зЦистанхеdeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.