Причина хронічної хвороби нирок (ХНН) - анемія

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

ЧАСТИНА Ⅰ: Протеїнурична хронічна хвороба нирок пов’язана зі зміною тривалості життя, здатності до деформації та метаболізму еритроцитів

Розі Біссінгер, Тревіс Немков та ін.

Розвитоканеміяє типовим ускладненням запущениххронічні захворювання нирок(ХХН) і пов’язаний із погіршенням якості життя¹і підвищений ризик серцево-судинних подій²та госпіталізація,³а також когнітивне зниження.⁴Ступінь тяжкостіанеміярозглядається як незалежний предиктор смертності як при діалізній, так і при незалежній ХХН (хронічні захворювання нирок) пацієнтів.⁵Патофізіологія захворювання нирок – пов’язанаанеміяє комплексним і включає дефіцит заліза та еритропоетину (ЕРО) на фоні запалення низького ступеня, що, у свою чергу, порушує нормальний еритропоез при ХХН (хронічні захворювання нирок) пацієнтів.⁶При поширеній ХХН (хронічні захворювання нирок), відповідь EPO є неадекватно низькою щодо ступеняанемія.^7,8 Висока поширеність супутнього дефіциту заліза при ХХН (хронічні захворювання нирок) є наслідком порушення гомеостазу заліза.⁹ Ігнорований механізм втрати заліза при ХХН (хронічні захворювання нирок) є протеїнурія, яка може призвести до втрати сечею зв’язаного з трансферином заліза (до 0,3 мг/день), коли протеїнурія досягає нефротичного діапазону.¹⁰Ще один фактор, який, як вважають, сприяєанеміяпри ХХН (хронічні захворювання нирок) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 років тому.^6,11,12

Переваги цистанхе: лікування захворювань нирок і поліпшення функції нирок

Нещодавнє дослідження з використанням дихального тесту на окис вуглецю продемонструвало, що тривалість життя еритроцитів прогресивно зменшилася зі 120 днів у пацієнтів із ХХН 1 стадії (хронічні захворювання нирок) до 60 днів у пацієнтів із 5 стадією ХХН (хронічні захворювання нирок).¹³ Зокрема, переливання алогенних еритроцитів від здорових донорів хворим на ХХН (хронічні захворювання нирок) пацієнтів спостерігалося швидке очищення від перелитих еритроцитів без ознак гемолізу.¹²Вірогідним механізмом цього спостереження може бути стимуляція загибелі клітин, подібної до апоптозу, у без’ядерних еритроцитах, що означає структуру пошкодження, при якій цілісність клітинної мембрани не порушується, а цитоплазматичний вміст залишається незмінним.¹⁴Еритроцити, які зазнають клітинної смерті, демонструють різні морфологічні зміни в результаті пошкодження цитоскелету, такі як утворення поверхневих пухирців, втрата еластичності мембрани та/або клітинна дегідратація.¹⁵На молекулярному рівні загибель еритроцитів пов’язана з внутрішньоклітинним накопиченням Ca2þ, зміною енергетичного статусу клітини та порушенням фосфоліпідної асиметрії, що зрештою призводить до екстерналізації фосфатидилсерину (PS) на зовнішній плазматичній мембрані.^15,16Як наслідок, макрофаги та спеціалізовані дендритні клітини швидко розпізнають PS-екстерналізовані еритроцити, що призводить до фагоцитозу еритрози та їх катаболізму в селезінці та печінці.¹⁷Через плутанину патофізіологіїхвороба печінки– асоційованийанеміяу людей дослідження на тваринах виправдані, щоб точно визначити механізми, що сприяють цьому. Індукована доксорубіцином нефропатія (DIN) у мишей 129S1/SvImJ¹⁸та миші з індукованим дефіцитом подоцину (Nphs2Dipod)¹⁹є 2 моделі, які характеризуються індукцією протеїнурії нефротичного діапазону протягом кількох днів, прогресуванням до ниркової недостатності через 3 тижні та смертю через 6–7 тижнів.^19–21Обидві мишачі моделі ефективно повторюють усі стадії ХХН людини (хронічні захворювання нирок). У цьому дослідженні ми перевірили, чи є прогресуюча ниркова недостатність у цих мишей з протеинуриейхвороба печінкивпливає на тривалість життя еритроцитів і сприяєанемія. Паралельно ми досліджували фенотип еритроцитів у крові, взятій із ХХН (хронічні захворювання нирок) пацієнти з протеїнурією нефротичного діапазону.

ХХН (хронічні захворювання нирок) іанемія: CISTANCHE

МЕТОДИ

Детальну інформацію про матеріали та методи наведено в Додаткових матеріалах і методах.

Дослідження мишей

Експерименти проводили на 8-тижневих мишах дикого типу 129S1/SvImJ обох статей (Charles River). DIN був викликаний одноразовою ін'єкцією доксорубіцину (14,5 мг/г маси тіла), як описано раніше.^18,22Щоб контролювати мієлотоксичну дію доксорубіцину, не пов’язану з розвитком нефропатії, резистентних до доксорубіцину мишей C57BL/6 також піддавали такому ж протоколу лікування.²³ Крім того, подібні експерименти проводилися на 8-тижневих мишах із індуцибельною делецією подоцину (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) або мишей Nphs2Dipod, яких лікували доксицикліном протягом 14 днів.¹⁹Усі досліди на тваринах проводилися відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин та Закону Німеччини щодо добробуту тварин за дозволу місцевих органів влади (Regierungspräsidium Tübingen, номери дозволу M12/17 та M17/19G). ). Експериментальна схема досліджень на мишах описана на додатковому малюнку S1.

Пацієнти

Дослідження пацієнтів було проведено відповідно до Гельсінської декларації та схвалено місцевим комітетом з етики університетської лікарні Тюбінгена (556/2018BO2). Літій-гепаринові зразки крові та сечі були взяті у пацієнтів із протеїнурією нефротичного діапазону та збереженою швидкістю клубочкової фільтрації (ШКФ; стадії 1–2; n=10) і пацієнтів зі зниженою ШКФ (ХНН (хронічні захворювання нирок) 3–5 стадія; n ¼ 15) в університетській лікарні Тюбінгена. В якості контрольної групи кров від здорових добровольців відповідного віку та статі (n=25) була надана банком крові університетської лікарні Тюбінгена. Усі зразки людей були зібрані після інформованої згоди. Клінічні характеристики хворих викладені вТаблиця 1.

Таблиця 1|Характеристика хворих на ХХН (хронічну хворобу нирок) та здорових донорів крові

Аналіз проточною цитометрією

Різні параметри загибелі еритроцитів визначали за допомогою аналогової цитометрії.¹⁴ Щоб визначити тривалість життя еритроцитів in vivo, 25 мл барвника 5,6-карбоксифлуоресцеїну діацетату сукциніміділового ефіру [5(6)-CFDA, SE] вводили в концентрації 9,96 мМ (розчинений у диметилсульфоксиді) у ретроорбітальний отвір. сплетення 129S1/SvImJ дикого типу та мишей, яким вводили доксорубіцин, як описано раніше.24 У зазначені моменти часу кров брали з ретроорбітального сплетення мишей, і відсоток 5(6)-CFDA, SEþ клітин було виявлено за допомогою аналогічного цитометричного аналізу. Нарешті, дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення FlowJo (FlowJo LLC).

Ектацитометрія деформованості еритроцитів та осмотичного градієнта

Деформативність еритроцитів вимірювали за допомогою лазерного оптичного аналізатора ротаційних клітин (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), який був детально описаний в іншому місці.²⁵Аналіз осмотичного градієнта ектацитометрії (космічна банка) також проводили за допомогою LORCA Max Sis і вимірювали деформованість за різних осмотичних умов.²⁶

Гістологічне дослідження

Для фарбування гематоксиліном та еозином селезінки та стегнові кістки фарбували гематоксиліном та еозином. Усі слайди пофарбували первинним антитілом Ter119 (BD Pharmingen; розведення 1:500). Для періодичного фарбування кислотою–Шиффом, зрізи товщиною 25-ммниркифарбували реактивом Періодної кислоти–Шиффа (Carl Roth) і гематоксиліном (Abcam). Фарбування за Меєм-Грюнвальдом-Гімзою (метод Паппенгейма) проводили для визначення змін форми еритроцитів, як описано раніше.²⁷ Виділення клубочків проводили за допомогою підходу біотинілювання та сортування клітин.¹⁹Для виявлення білка подоцину застосовували антитіло фірми Sigma (P0372).¹⁹Для фарбування ядер використовували Roti-Mount Fluor Care 4,6-діамідіно-2-феніліндол (DAPI; Carl Roth).

Метаболоміка надвисокопродуктивної рідинної хроматографії та мас-спектрометрії еритроцитів миші

Аналізи були виконані, як було опубліковано раніше.²⁸Коротко кажучи, аналітична платформа використовує надвисокоефективну рідинну хроматографічну систему Vanquish (Thermo Fisher Scientific), з’єднану онлайн із мас-спектрометром Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Цистанхою лікують захворювання нирок, викликані анемією

Статистичний аналіз

Дані надаються як середнє арифметичне SEM або як медіана з інтерквартильним діапазоном (25-75-й процентиль), де n представляє кількість використаних тварин або включених пацієнтів відповідно. Дані були перевірені на нормальність за допомогою тесту Колмогорова-Смирнова, тесту Д'Агостіно та тесту Шапіро-Вілка. Дисперсії аналізували за критерієм Бартлетта для рівних дисперсій. Посттест Тьюкі або Данна з множинним порівнянням, непарний t-тест Стьюдента або U-тест Манна-Уітні проводили за допомогою GraphPad Prism 8 (програмне забезпечення GraphPad). P < 0.05="" з="" 2-="" хвостовим="" тестуванням="" вважалося="" статистично="" значущим.="" додаткові="" графіки="" були="" побудовані="" за="" допомогою="" graphpad="" prism="">

РЕЗУЛЬТАТИ

Викликає експериментальну протеїнуричну хворобу нироканеміяу мишей. Після індукції у мишей 129S1/SvImJ з мишами DIN та Nphs2Dipod розвинулася протеїнурія нефротичного діапазону (Малюнок 1a та Додатковий малюнок S2C) та прогресуюча ниркова недостатність, що характеризується високими рівнями сечовини в плазмі з 20 дня і далі (Малюнок 1b та ​​Додатковий малюнок S2D). Протягом перших 10 днів у мишей спостерігалося збільшення маси тіла з асцитом (рис. 1c і додаткова рис. S2E), що відображає затримку натрію, викликану екскрецією серинових протеаз або протеїнурією.¹⁸Після спонтанного відновлення затримки натрію ці миші стабільно втрачали вагу. У мишей з DIN та у мишей Nphs2Dipod світлова мікроскопія, зроблена через 10 днів, виявила типові гістоморфологічні зміни, що відповідають фокальному сегментарному клубочковому склерозу (Малюнок 1d та Додатковий малюнок S2B). Вони були відсутні у мишей C57BL/6, яким вводили доксорубіцин (рис. 1d). Лікування доксорубіцином спричинило сильне зниження гемоглобіну, кількості еритроцитів і гематокриту (рис. 1e–g) з 10-го дня у мишей 129S1/SvImJ і C57BL/6, які в останніх нормалізувалися на 20-й і 30-й дні. на 20-й і 30-й дні у мишей, яким вводили доксорубіцин 129S1/SvImJ, і мишей з дефіцитом подоцину розвинулася прогресуючаанемія, що характеризується зменшеним середнім корпускулярним об’ємом (Малюнок 1h) і зниженим вмістом гемоглобіну (Додатковий малюнок S2F), що свідчить про те, щоанеміяасоціюється з прогресуючою нирковою недостатністю, а не з лікуванням доксорубіцином.

Малюнок 1|Функція нирок і явна анемія у мишей 129S1/SvImJ, яким вводили доксорубіцин.(a–d) Миші 129S1/SvImJ, яким вводили доксорубіцин, розвинули (a) високу протеїнурію, (b) прогресуюче підвищення концентрації сечовини в плазмі, (c) транзиторне збільшення маси тіла та (d) типові гістоморфологічні зміни, що вказують на фокальний сегментарний гломерулярний склероз на 10 день (фарбування періодичною кислотою–Шиффом; смуга ¼ 10 мм). (e–h) Крім того, ці миші розвивалисяанеміящо відображається (e) зниженням рівня гемоглобіну, (f) зниженням кількості еритроцитів (еритроцитів), (g) зниженням рівня гематокриту та (h) зменшенням середнього корпускулярного об’єму. (a–d) Миші C57BL/6, яким вводили доксорубіцин, не виявляли жодних ознак ураження нирок, і (e–g)анеміяна день 10 було нормалізовано на дні 20 і 30. Показано арифметичні середні SEM. *P <0,05, **p=""><0,01,>< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Анемія при експериментальній протеїнуричній хворобі нирок не спричинена порушенням еритропоезу

Обидві моделі мишей з анемією показали значне збільшення відсотка циркулюючих ретикулоцитів (рис. 2а та додаткова рис. S3C). Концентрації EPO в плазмі різко зросли на 10-й день у 129S1/SvImJ з DIN і здорових мишей C57BL/6, але знову нормалізувалися на 20-й і 30-й дні (рис. 2b). У мишей з дефіцитом подоцину концентрації EPO в плазмі підскочили на 10-й день і залишалися підвищеними на 20-й і 30-й дні (додатковий малюнок S2H). У гістологічних аналізах кісткового мозку та селезінки кількість еритроїдних клітин-попередників порівняно з мієлоїдними попередниками була збільшена на 30-й день (рис. 2d–g), що вказує на стимульований еритропоез у анемічних мишей 129S1/SvImJ з DIN.

Малюнок 2|Еритропоез стимулюється у мишей з анемією, яким вводили доксорубіцин 129S1/SvImJ. (a) анеміяу мишей 129S1/SvImJ, яким вводили доксорубіцин, відбулося незважаючи на збільшення кількості ретикулоцитів на 2{{30}} і 30 дні. (b) Концентрація еритропоетину в плазмі була значно збільшена на день 10 у мишей 129S1/SvImJ і C57BL/6, яким вводили доксорубіцин, але знову нормалізувалася на дні 20 і 30. (c–e) Кількісне визначення абсолютної кількості (c) мієлоїдних та (d) еритроїдних клітин у кістковому мозку. (e) Співвідношення мієлоїдних та еритроїдних клітин у здорових мишей та мишей, яким вводили доксорубіцин 129S1/SvImJ, у кістковому мозку показало більшу кількість еритроїдних клітин-попередників у мишей, яким вводили доксорубіцин 129S1/SvImJ, на 3-й день{{5{{52 }}}}. (f,g) Гістологія (f) селезінки та (g) кісткового мозку показала збільшення еритроїдних клітин-попередників, яке спостерігалося навіть при менших збільшеннях, у мишей 129S1/SvImJ, яким вводили доксорубіцин (праві панелі), порівняно зі здоровими мишами (ліві панелі) ) на 30-й день. (f,g) Імуногістохімія Ter119 (нижні панелі) підтвердила результати гематоксиліну та еозину (H&E). Ter119 є позитивним в еритроїдних попередниках (ядерних клітинах) і в еритроцитах (без’ядерних клітинах). Брусок ¼ 100 мм; вставки ¼ 25 мм. Показані середні арифметичні SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 і="" ***p=""><0,001 вказують="" на="" суттєву="" різницю="" між="" здоровими="" мишами="" 129s1/svimj="" і="" мишами,="" яким="" вводили="" доксорубіцин="" 129s1/svimj;="" ##p="">< 0,01="" і="" ####p="">< 0,0001="" вказують="" на="" значну="" різницю="" з="" вихідним="" рівнем="" мишей="" 129s1/svimj,="" яким="" вводили="" доксорубіцин;="" і="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" і="" §§§§p="">< 0,0001="" вказують="" на="" значну="" різницю="" між="" мишами="" 129s1/svimj,="" яким="" вводили="" доксорубіцин,="" і="" мишами="" c57bl/6,="" яким="" вводили="">

Користь відЦистанхе: лікування захворювань нирок і покращення функції нирок

Зменшення тривалості життя еритроцитів є основною причиною анемії при експериментальній протеїнуричній хворобі нирок

Екстерналізація PS на зовнішньому листку плазматичної мембрани еритроцитів є індикатором загибелі клітин і промотором еритрофагоцитозу.¹⁴Смерть клітин еритроцитів була кількісно визначена за допомогою аналізу сортування клітин, активованих флуоресценцією, флуоресцентного зв’язаного з анексином V поверхневого PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >У {{0}}разів вище на 2-й день0 у мишей із DIN (4,16 відсотка та 0.86 відсотка ) порівняно зі здоровими мишами (1.{{7 }} відсотків & 0.11 відсотків ) (Малюнок 3a). Подібним чином миші Nphs2Dipod продемонстрували приблизно 2-кратне збільшення експозиції ФС (1,27 відсотка та 0,20 відсотка) порівняно зі здоровими мишами (0,58 відсотка та 0,05 відсотка) на 30-й день (додатковий малюнок S3A). Відомо, що еритроцити виводяться з кровообігу макрофагами, які знаходяться в селезінці. Таким чином, це спостереження може пояснити більш високе співвідношення селезінка/маса тіла мишей Nphs2Dipod (додатковий малюнок S2G), де руйнується вдвічі більше еритроцитів порівняно зі здоровими C57BL/6 мишей. Оскільки протеїнурія нефротичного діапазону призводить до диспротеїнемії29, ми далі досліджували, чи може посилена смерть клітин еритроцитів стимулюватися компонентом у плазмі мишей з DIN. Як показано на малюнку 3b, експозиція PS на 10 і 20 дні була вдвічі вищою після інкубації (30 хвилин на 37^OC) здорових еритроцитів у плазмі мишей 129S1/SvImJ, яким ввели доксорубіцин, порівняно з інкубацією в плазмі здорових мишей. Приплив Ca2þ до еритроцитів, опосередкований напругозалежними та незалежними від напруги неселективними катіонними каналами,^30,31є одним із ключових регуляторів загибелі еритроцитів. У еритроцитах, зібраних на 20-й і 30-й дні від мишей 129S1/SvImJ з DIN, внутрішньоклітинні концентрації Ca2þ були підвищені (рис. 3c); це явище було повторено на мишах Nphs2Dipod на 20 день (додатковий малюнок S3B). В обох мишачих моделях спостерігалася значна негативна кореляція відсотка PS-позитивних еритроцитів із тяжкістюанеміявідображається рівнями гемоглобіну (Малюнок 3d і Додатковий малюнок S3D). Крім того, спостерігався значний зв’язок із пошкодженням нирок, що відображається концентрацією сечовини в плазмі (рис. 3e та додатковий малюнок S3E) і меншою мірою з протеїнурією (рис. 3f та додатковий малюнок S3F). Щоб компенсувати втрату еритроцитіванемія, утворення нових еритроцитів стимулювалося в обох мишей, на що вказує підвищений відсоток циркулюючих ретикулоцитів, і суттєво корелювало з величиною PS, що експонує еритроцити (малюнок 3g і додатковий малюнок S3G).

Малюнок 3|У мишей із спричиненою доксорубіцином нефропатією розвивається посилена загибель еритроцитів (еритроцитів), опосередкована підвищенням рівня внутрішньоклітинного кальцію.(a) Екстерналізація фосфатидилсерину (PS), що відображає загибель еритроцитів, була посилена на 20 і 30 дні після індукції доксорубіцин-індукованої нефропатії. (b) Інкубація здорових еритроцитів у плазмі, взятій у дні 10 і 20 від цих мишей, призвела до екстерналізації PS. (c) Екстерналізація PS супроводжувалася підвищенням внутрішньоклітинного рівня кальцію в еритроцитах, взятих на 20 та 3{{30}} дні після індукції. (d–g) (d) відсоток еритроцитів, що експонують PS, корелює з рівнем гемоглобіну, пошкодженням нирок, що вказується (e) концентрацією сечовини в плазмі та (f) протеїнурією, а також з (g) утворенням ретикулоцитів. (d–g) Дані включають кожну часову точку (0, 10, 20 і 30 днів) кожної здорової миші 129S1/SvImJ і 129S1/SvImJ із нефропатією, спричиненою доксорубіцином. Показані середні арифметичні SEM. **P <0,01, ***p=""><0,001 і="" ****p=""><0,0001 вказують="" на="" суттєву="" різницю="" між="" здоровими="" мишами="" 129s1/svimj="" і="" мишами,="" яким="" вводили="" доксорубіцин="" (внутрішньо)="" 129s1/svimj;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" і="" ####p="">< 0,0001="" вказують="" на="" значну="" різницю="" з="" початковим="" рівнем="" мишей="" 129s1/svimj,="" яким="" вводили="" доксорубіцин;="" і="" §§§§p=""><0,0001 вказують="" на="" значну="" різницю="" між="" мишами="" 129s1/svimj,="" яким="" вводили="" доксорубіцин,="" і="" мишами="" c57bl/6,="" яким="" вводили="" доксорубіцин.="" креа,="" креатинін;="" mfi,="" середня="" інтенсивність="">

Користь відЦистанхе: лікування захворювань нирок і покращення функції нирок

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ЧАСТИНА Ⅱ