Високочутливий та екологічно стійкий метод HPTLC із зворотною фазою для визначення гідрохінону в комерційних відбілюючих кремах

Контактна особа:ali.ma@wecistanche.com

Мохаммед Х. Алкарні 1, Правез Алам 1, Файяз Шакіль 2, Ахмед І. Фуда 1 і Султан Альшері 2,*

Анотація: гідрохінон(HDQ) є природним депігментуючим агентом, який зазвичай використовується в препаратах для тонізації шкіри. Безпека та екологічність аналітичних методів кількісного визначення HDQ не розглядалися в попередній літературі. Таким чином, для оцінки HDQ у чотирьох різних комерційних тестах було розроблено високочутливий і екологічно екологічно чистіший аналіз на основі високоефективної тонкошарової хроматографії (RP-HPTLC).відбілюваннякреми (CWC). Бінарну суміш етанол-вода (60:40, v·v−1) використовували як зелену систему розчинників. Оцінку HDQ проводили при 291 нм. Поточний аналіз на основі RP-HPTLC був лінійним у діапазоні 20–2400 нг смуги-1. Нинішній аналітичний метод був дуже чутливим на основі даних виявлення та кількісного визначення. Інші параметри перевірки, такі як точність, прецизійність і стійкість, також підходили для визначення HDQ. Максимальна кількість HDQ була отримана в CWC A (1,23 відсотка w·w-1), потім CWC C (0,81 відсотка w·w-1), CWC D (0,43 відсотка w·w-1) і CWC B (0,37 відсотка w· w−1). Оцінка analyticalGREEnness (AGREE) для цього аналітичного методу була оцінена як 0,91, що вказує на чудові більш екологічні характеристики поточного аналізу RP-HPTLC. Ці результати свідчать про те, що нинішній аналітичний метод є високочутливим і екологічно стійким для кількісного визначення HDQ у його комерційних композиціях.

Ключові слова:згоден;гідрохінон; екологічно стійкий RP-HPTLC; перевірка

Екстракт цистанхиможе поглинати вільні радикали та запобігати накопиченню тирозинази.

Натисніть, щобCistanche ефекти для відбілювання

1. Введення

гідрохінон(HDQ) — це природна сполука, яка присутня в кількох комерційних композиціях для тонізування шкіри для лікування мелазми (захворювання, спричинене надмірним накопиченням меланіну в шкірі людини) [1,2]. Це потужний депігментуючий агент і використовується як альтернатива тирозиназі [3]. Це один із найбільш часто використовуваних засобів у лікуванні гіперпігментації шкіри людини [4,5]. Ефективна концентрація HDQ у комерційних композиціях для тонізації шкіри коливається від 1,5 до 2.0 відсотків w·w−1[6]. Висока концентрація HDQ (вище 5 відсотків w·w−1) викликає місцеве подразнення та лейкодермію шкіри людини [5,6]. Через суперечливі побічні ефекти багато країн заборонили HDQ яквідбілюваннязасіб у місцевих формах [7]. Тим не менш, кілька клінічних досліджень показали різні захисні ефектиHDQу лікуванні різних гіперпігментних розладів шкіри, таких як мелазма, веснянки, лентигіни тощо [8,9]. Враховуючи як переваги, так і ризики HDQ, необхідно провести його кількісний аналіз у різних комерційних композиціях для тонування шкіри.

Різні фармацевтичні аналізи використовуються для кількісного визначення HDQ окремо або в поєднанні з іншимивідбілюванняагентів у проданих відбілюючих кремах (CWC). Для кількісного аналізу HDQ у комерційних відбілюючих продуктах (CWP) і фармацевтичних препаратах було задокументовано різноманітні аналізи на основі ультрафіолетової (УФ) спектрометрії [10–13]. Було задокументовано широкий спектр аналізів на основі високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) для визначення HDQ разом з його ефірами в різноманітних CWC та CWP [14–23]. Також були створені різні вольтаметричні методи для одночасного визначення HDQ та його ефірних похідних у CWP [24–29]. ДляHDQаналіз разом з його похідними ефіру та інвідбілюванняагентів у CWP. Деякі електрохімічні наносенсори також були використані для аналізу HDQ [34,35]. Для якісного та кількісного аналізу HDQ у CWC наша дослідницька група також застосувала єдиний метод на основі високоефективної тонкошарової хроматографії (HPTLC) з нормальною фазою [1].

Після вичерпного аналізу повідомлених есе про аналіз HDQ було виявлено, що безпека та екологічна стійкість фармацевтичних методів у літературі не оцінювалися та не розглядалися для оцінки. Крім того, аналізи на основі «зеленої»/екологічно стійкої зворотно-фазової HPTLC (RP-HPTLC) ще не використовувалися для оцінкиHDQу своїх CWC. Екологічно стійкі/зелені аналізи на основі ВЕРХ пропонують багато переваг, таких як простота, економічність, низька вартість експлуатації, короткий час аналізу, паралельний аналіз кількох зразків, чіткість виявлення та зниження токсичності для навколишнього середовища порівняно з ВЕРХ та іншими аналітичними методами [36–39]. Відповідно, для цього дослідження було обрано метод RP-HPTLC для визначення HDQ. Для оцінки профілю зеленості фармацевтичних аналізів використовуються різні підходи [38–43]. Тим не менш, лише аналітичний метричний підхід GREEnness (AGREE) застосовує всі 12 принципів зеленої аналітичної хімії (GAC) для оцінки зеленості [42].

Метричний підхід AGREE був застосований для оцінки зеленості поточного методу RP-HPTLC [42]. Таким чином, ця робота була проведена для розробки високочутливого та екологічно стійкого методу RP-HPTLC для оцінкиHDQу чотирьох різних CWC. Профіль зеленості поточного методу RP-HPTLC був отриманий за допомогою AGREE: аналітичного калькулятора зеленості. Нинішній аналітичний аналіз для аналізу HDQ було підтверджено згідно з рекомендаціями Міжнародної ради з гармонізації (ICH) Q2 (R1) [44].

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Еталонний стандарт HDQ (чистота: 99 відсотків) був придбаний у Fluka Chemica (Дармштадт, Німеччина). Метанол (MeOH) і етанол (EtOH) класу ВЕРХ були придбані в Alfa Aesar (Тьюксбері, Массачусетс, США). Воду класу ВЕРХ (H2O) збирали з системи очищення води Milli-Q (E-Merck, Дармштадт, Німеччина). Інші використовувані розчинники та реагенти були аналітичного класу. Чотири різні CWC HDQ були отримані на фармацевтичному ринку в Аль-Хардж, Саудівська Аравія, у червні 2021 року.HDQзберігали в прохолодному та темному місці при 22 ◦C до початку експериментів. CWC зберігали приблизно один місяць до початку експериментів.

2.2. Хроматографія

Кількісне денситометричне визначення HDQ за допомогою RP-HPTLC у його еталонному стандарті та чотирьох різних CWC було проведено за допомогою приладу HPTLC (CAMAG, Muttenz, Швейцарія). Кількісний аналіз HDQ проводили на пластинах зі скляною підкладкою розміром 10 × 20 см2, попередньо покритих пластинами з силікагелем RP 60 F254S (E-Merck, Дармштадт, Німеччина). Зразки на пластинах ТШХ позначали як смуги 6 мм. з використанням аплікатора автоматичного пробовідбірника 4 (ATS4) (CAMAG, Женева, Швейцарія). Аплікатор зразків був оснащений мікролітровим шприцом CAMAG (Hamilton, Bonaduz, Швейцарія). Норма застосування для кількісного аналізуHDQпідтримувався постійним на рівні 150 нл с-1. Пластини були виявлені в автоматичній камері проявлення 2 (CAMAG, Muttenz, Швейцарія) на відстані 80 мм. Зеленою системою розчинників для аналізу HDQ був EtOHH2O (60:40, об.·об.-1). Проявну камеру попередньо насичували парами рухомої фази протягом 30 хв при 22 ◦C. HDQ було виявлено при 291 нм. Розміри щілини становили 4 × 0,45 мм2, а швидкість сканування 20 мм/с. Кожен експеримент проводили в трьох повторах. Для обробки даних використовувалося програмне забезпечення WinCATs (версія 1.4.3.6336, CAMAG, Muttenz, Швейцарія).

2.3. Калібрувальна крива HDQ і підготовка зразків контролю якості

Зазначену кількість HDQ (10 мг) було розподілено в 100 мл EtOH-H2O (60:40, v·v-1) системи зелених розчинників для отримання вихідного розчину з концентрацією 100 мкг мл-1. Різні об’єми вихідних розчинів додатково розбавляли за допомогою систем EtOH-H2O (60:40, об·об–1) для досягнення концентрацій HDQ у діапазоні 20–2400 нг–1. Отримані розчиниHDQщо містять різні концентрації, наносили на пластини HPTLC. Площа піку HPTLC для HDQ була отримана для кожного розчину HDQ з використанням цього фармацевтичного аналізу. Калібрувальна крива HDQ була створена шляхом побудови графіка концентрацій HDQ відносно її площі HPTLC. Крім того, три різні зразки контролю якості (QC), такі як низький КЯ (LQC; 20 нг смуга-1), середній КЯ (MQC; 600 нг смуга-1) і високий КЯ (HQC; 2400 нг смуга-1) , були отримані окремо, щоб визначити різні параметри валідації для цього фармацевтичного аналізу.

2.4. Обробка зразків для визначення HDQ у CWC

HDQ було виділено з чотирьох різних CWC за допомогою процедури, описаної в літературі [1]. Точно зважені (5.0 г) кількості чотирьох різних CWC, включаючи A, B, C і D, були перенесені в ділильну воронку окремо. Кожен CWC струшували в ділильній лійці з MeOH (3 × 70 мл) протягом 30 хвилин при 22 ◦C. Екстракти MeOH з кожного CWC об’єднували та випарювали окремо досуха при зниженому тиску за допомогою роторного вакуумного випарника. Отримані залишки розчиняли 10 мл MeOH і зберігали в холодильнику до подальшої оцінки. Отримані зразки піддавали аналізу HDQ із застосуванням даного аналітичного методу при 291 нм.

2.5. Параметри перевірки

Нинішній аналіз RP-HPTLC для аналізу HDQ був валідований для різних параметрів валідації відповідно до рекомендацій ICH-Q2 (R1) [44]. TheHDQЛінійність оцінювали шляхом побудови графіка концентрацій HDQ проти виміряної площі піку. Лінійність HDQ була оцінена в 11 різних зразках QC 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 і 2400 нг смуги-1 для цього фармацевтичного аналізу. Параметри ефективності системи для даного аналітичного методу були оцінені з точки зору коефіцієнта затримки (Rf), коефіцієнта асиметрії (As) і кількості теоретичних пластин на метр (Н·м−1). Rf, As і N м-1 були отримані при MCQ (600 нг смуга-1), як повідомлялося раніше в літературі [45].

Точність поточного методу RP-HPTLC було визначено як відсоток відновлення. Відсоток відновлення було отримано при LQC (20 нг смуга-1), MQC (600 нг смуга-1) і HQC (2400 нг смуга-1) для поточний аналітичний метод.

Точність цього аналітичного методу оцінювалася як внутрішньоденна/міжденна точність. Внутрішньоденна точність була визначена за допомогою аналізу HDQ на LQC, MQC і HQC в той самий день для цього аналітичного аналізу. Міжденна точність була визначена за допомогою аналізу HDQ при LQC, MQC і HQC у три різні дні для цього аналітичного аналізу [44]. Кожну точність вимірювали шість разів (n=6).

Надійність оцінювали шляхом внесення деяких невеликих змін у системи зелених розчинників для поточного методу RP-HPTLC. Для оцінки надійності початкову систему розчинників EtOH H2O (60:40, об.·об.-1) було замінено на EtOH-H2O (62:38, об.·об.-1) та EtOHH2O (58:42, об.·об.-1). ) системи розчинників, а специфічна відповідь HPTLC і значення Rf були зареєстровані та інтерпретовані [44].

Чутливість цього аналітичного методу оцінювали як межі виявлення (LOD) і кількісного визначення (LOQ) за допомогою методу стандартного відхилення. LOD і LOQ HDQ для цього аналітичного методу були розраховані, як зазначено в літературі [44,45].

Пікова чистота/специфічність була оцінена шляхом порівняння значень Rf та УФ-спектрів HDQ у CWC A, B, C та D зі стандартним HDQ для цього фармацевтичного аналізу.

2.6. Кількісний аналіз HDQ в CWC

Отримані зразки CWC A, B, C і D наносили на пластини HPTLC і відзначали їхні реакції TLC. Площа піку дляHDQв CWCs було зафіксовано. Вміст HDQ у CWC було розраховано з використанням калібрувальної кривої HDQ для даного аналітичного методу.

2.7. Оцінка зеленості

Характеристики зеленості для цього аналітичного методу були отримані з використанням метричного підходу AGREE [42]. Оцінки AGREE (0.0–1.0) цього аналітичного методу були записані з використанням AGREE: аналітичного калькулятора зеленості (версія0.5, Гданський університет технології, Гданськ, Польща, 2020).

3. Результати та їх обговорення

3.1. Розробка методу

На основі аналітичних методів літератури було виявлено, що екологічно стійкий/зелений метод RP-HPTLC для аналізу HDQ у комерційній косметиці відсутній. Тому це дослідження було проведено для розробки швидкого, високочутливого та екологічно стійкого методу. Метод RP-HPTLC для аналізу HDQ в CWC.

Для RP-HPTLC аналізу HDQ різні пропорції EtOH і H2O, включаючи EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (60:40, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH H2O (80:20, v·v−1) та EtOH-H2O (90:10, v·v−1), були оцінені як зелені комбінації розчинників для розробка надійної смуги для аналізу HDQ. Суміші розчинників проявляли в умовах насичення камери. Із записаних даних було помічено, що EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH-H2O (80:20, v·v− 1), а суміші зелених розчинників EtOH-H2O (90:10, v·v−1) показали погану хроматограмуHDQіз неприйнятним значенням As (As {{0}}.29). Проте комбінація EtOH-H2O (60:40, v·v−1) зелений розчинник показала, що забезпечує добре розділену хроматограму HDQ при Rf=0.83 ± 0,02 з прийнятним значенням As (As {{ 12}}.03) (Малюнок 1). Таким чином, EtOH H2O (60:40, v·v−1) було оптимізовано як зелені суміші розчинників для аналізу HDQ у CWC. Смуги УФ-спектру для даного методу RP-HPTLC були зареєстровані денситометрично, і максимальна відповідь HPTLC була знайдена при 291 нм для даного методу RP-HPTLC. Тому весь аналіз HDQ проводили при 291 нм.

3.2. Параметри перевірки

Нинішній фармацевтичний аналіз для кількісного визначення HDQ був перевірений на діапазон лінійності, параметри ефективності системи, точність, точність, міцність, чутливість і пік чистоти/специфічності відповідно до рекомендацій ICH [44]. Результати регресійного аналізу методом найменших квадратів калібрувальної кривої HDQ для цього методу RP-HPTLC представлені в таблиці 1.HDQкалібрувальна крива була лінійною в діапазоні 20–2400 нг з коефіцієнтом визначення 0,9997 для цього аналітичного методу. ці дані свідчать про хорошу лінійність між концентрацією HDQ та її реакцією.

Параметри ефективності системи цього фармацевтичного методу досліджували на MQC (600 нг смуга-1), і результати включені в таблицю 2. Значення Rf, As і N m-1 для поточного аналітичного методу було передбачено як 0.83 ± 0,02, 1,03 ± 0,03 і 4987 ± 2,87 відповідно. Ці результати показали, що поточний аналітичний метод був надійним для аналізу HDQ у CWC.

Результати аналізу точності для цього аналітичного методу наведено в таблиці 3. Відсоток відновлення HDQ для цього методу RP-HPTLC було визначено як 101,80 відсотка, 98,16 відсотка та 99,38 відсотка при LQC, MQC та HQC відповідно. . Високі значення відсотка відновлення вказують на точність поточного методу RP-HPTLC для аналізу HDQ у CWC.

Точність визначали як відсоток коефіцієнта варіації (відсоток CV), а результати наведено в таблиці 4. Відсотки CV HDQ ​​для цього аналітичного методу були передбачені як 0.91, 0. 59 і 0.26 відсотків за LQC, MQC і HQC, відповідно, для внутрішньоденної точності. Відсоток CV HDQ ​​для поточного методу RP-HPTLC було передбачено як 0.98, {{10}}.69 і 0,32 відсотка при LQC, MQC і HQC, відповідно, для міжденна точність. Низькі значення відсотка CV вказують на точність поточного методу RP-HPTLC для аналізу HDQ у CWC.

Результати аналізу надійності для поточного аналітичного методу наведено в таблиці 5. Відсоток CV для аналізу стійкості був прогнозований як 0.59–0.66 відсотків для поточного аналітичного методу. Значення Rf HDQ були знайдені в діапазоні 0.82–0.84 для даного аналітичного методу. Вузькі зміни значень Rf для HDQ і нижчий відсоток CV показали надійність поточного аналітичного методу кількісного визначення HDQ у CWC.

Чутливість для даного аналітичного методу була записана як "LOD і LOQ", а їх фізичні значення наведено в таблиці 1. "LOD і LOQ" для даного аналітичного методу були передбачені як 6,91 ± 0.23 і 2 0.73 ± 0,68 нг band−1 відповідно дляHDQкількісна оцінка. Ці фізичні значення "LOD і LOQ" для даного аналітичного методу вказують на чутливість аналізу HDQ у CWC.

Пікова чистота/специфічність для даного аналітичного методу була оцінена шляхом порівняння накладених УФ-спектрів HDQ у чотирьох різних CWC зі стандартними HDQ. Накладені УФ-спектри стандартних HDQ і HDQ у чотирьох різних CWC показані на рисунку 2. Найвищий хроматографічний відгук для HDQ у стандартних HDQ і досліджених CWC спостерігався при 291 нм для цього аналітичного методу. Ідентичні УФ-спектри, значення Rf і довжина хвилі HDQ у стандартних HDQ і CWC вказують на пік чистоти/специфічності для цього аналітичного методу.

3.3. Аналіз вмісту HDQ в CWC

Застосовність даного аналітичного аналізу була перевірена в кількісній оцінці HDQ в CWC. ХроматограмаHDQз CWCs було ідентифіковано шляхом порівняння його плями TLC при Rf {{0}}.83 ± 0.02 із показниками стандартної HDQ для цього аналітичного методу. Хроматограми HDQ у CWC A і B для цього аналітичного аналізу підсумовані на рисунку 3. Хроматограми HDQ за допомогою ВЕРТХ у CWC були ідентичними хроматограмам чистого HDQ. Деякі додаткові піки також з’явилися на хроматограмах CWC, які можуть бути пов’язані з різними допоміжними речовинами, присутніми в CWC. Екологічно стійкий метод HPTLC був селективним для аналізу HDQ при Rf=0.83 без перешкод з боку інших інгредієнтів CWC. Значення Rf (0.83) HDQ у CWC виявилося ідентичним значенню стандартного HDQ ({{20}}.83), що вказує на відсутність взаємодії між HDQ і Інгредієнти CWC. Отже, не було жодного впливу інгредієнтів препарату на якість хроматограми HDQ, LOD та ефективність поточного методу HPTLC аналізу HDQ. Наявність додаткових піків на хроматограмах CWC вказує на те, що поточний метод RP-HPTLC був надійним для оцінки HDQ у присутності інгредієнтів препарату. Вміст HDQ у CWCs було визначено за калібрувальною кривою HDQ, і результати включені в таблицю 6. У таблиці 6 також узагальнено позначену кількість HDQ та інгредієнти його рецептури. Вміст HDQ був найвищим у CWC A (1,23% w·w−1), потім CWC C (0.81% w·w−1), CWC D (0.43% w·w−1). -1) і CWC B (0,37 відсотка w·w-1). Зареєстрований вміст HDQ був набагато нижчим, ніж позначена кількість (2.00 відсотки w·w−1) HDQ у досліджуваних CWC. Вміст HDQ у двох різних CWC (A і B) було зареєстровано як 0,69 відсотка w·w-1 і 0,34 відсотка w·w-1, відповідно, за допомогою методу HPTLC з нормальною фазою в літературі [1]. Повідомлений вміст HDQ також був набагато нижчим, ніж кількість (2.00% w·w−1) HDQ у літературі [1]. Кілька CWC або CWP продаються під заявою про те, що вони повністю натуральні. Однак зазвичай можна знайти деякі синтетичні хімічні речовини як домішки з тим самим ефектом, що й такі CWC або CWP, як шахрайство. Кількість HDQ, зареєстрована в цій роботі, і ті, що зареєстровані в літературі, вказують на те, що досліджувані CWC мають низьку кількість HDQ і не відповідають вимогам етикетки [1]. Отже, очікується, що досліджувані CWC містять деякі синтетичні хімічні речовини як домішки. Загалом, цей аналітичний аналіз можна використовувати для аналізу HDQ у косметичних і фармацевтичних препаратах.

3.4. Оцінка зеленості

Для оцінки зеленості фармацевтичних аналізів використовуються різні методи [38–43]. Однак тільки підхід AGREE використовує всі 12 принципів GAC для оцінки екологічності [42]. Таким чином, профіль зеленості цього аналітичного методу було отримано за допомогою калькулятора AGREE. Прогнозована оцінка AGREE з використанням 12 різних принципів GAC для цього аналітичного аналізу представлена ​​на рисунку 4. Оцінка AGREE для різних принципів GAC була записана таким чином: Обробка зразка: 0.61 Розташування аналітичного пристрою: 1.{{ 9}}Етапи підготовки зразка: 1.00Ступінь автоматизації: 0.80Дериватизація: 1.00Кількість відходів: 1.{{17} }Пропускна здатність аналізу: 1.00Споживання енергії: 1.00Обробка зразка: 0,51 Джерело реагенту: 1.00Токсичність розчинників: 1.00 Безпека оператора: 1.00

Загальна оцінка AGREE для поточного аналітичного методу була записана як 0.91, що вказує на чудовий зелений аналітичний метод дляHDQкількісна оцінка.

4. Висновок

Метод денситометрії RP-HPTLC був розроблений для аналізу HDQ у чотирьох різних CWC HDQ. Нинішній аналіз RP-HPTLC був валідований для різних параметрів валідації. Даний аналітичний метод був високочутливим, швидким і екологічно стійкимHDQаналіз. Оцінка AGREE для цього аналітичного методу запропонувала чудовий аналітичний аналіз для кількісного визначення HDQ. Нинішній РМетод P-HPTLC був придатним для аналізу HDQ у чотирьох різних CWC. Ці результати показали, що даний аналітичний аналіз можна застосовувати для аналізу HDQ в різних косметичних і фармацевтичних препаратах.