Імуноглобулінова нефропатія характеризується антикомменсальними гуморальними імунними відповідями

IgA нефропатія(IgAN) єголовна причина ниркової недостатності, але про нього мало що відомоІмунопатогенез цього захворювання. IgAN характеризується відкладенням IgA вниркові клубочки, але джерело та стимул для виробництва IgA невідомі. Клінічні та експериментальні дані свідчать про рольаномальні імунні реакціїна мікробіоту слизової оболонки в IgAN, і в деяких країнах з високою поширеністю захворювання тонзилектомія вважається стандартною терапією. Щоб оцінити взаємозв’язок між мікробіотою та імунною реакцією слизової оболонки, ми охарактеризували мікробіоту мигдалин у пацієнтів з IgAN порівняно з неспорідненими учасниками контрольної групи з домогосподарства тавиявлено підвищене носійство родуNeisseria та підвищений Neisseria-націлений сироватковий IgA у пацієнтів з IgAN. Ми зворотно перевели ці результати в експериментальному IgAN, викликаному надмірною експресією BAFF у трансгенних мишей BAFF, які стали сприйнятливими до інфекції Neisseria шляхом введення гуманізованого трансгену CEACAM-1 (B × hC-Tg). Колонізація мишей B × hC-Tg Neisseria призвела до підвищення рівня системного Neisseria-специфічного IgA. Використовуючи спеціальний аналіз ELISPOT, ми виявили в нирках цих мишей клітини, що секретують анти-Neisseria-специфічні IgA. Ці результати свідчать про роль аберантних імунних реакцій слизової оболонки, викликаних цитокінами, на орофарингеальних патобіонтів, таких як Neisseria, в імунопатогенезі IgAN. Крім того, за наявності надлишку BAFF патобіонт-специфічний IgA може вироблятися in situ в нирці.

НОВІ ТРАВИ ДЛЯІГА НЕФРОПАТІЯЗАПРИЧИНА НИРКОВОЇ НЕДОСТАТНОСТІ

вступ

Механізми, що лежать в основі патогенезу IgA-нефропатії (IgAN), недостатньо вивчені, однак це одна з найпоширеніших причин ниркової недостатності. Широко визнана «гіпотеза багатьох ударів» для розвитку IgAN зосереджується на виробництві імунних комплексів патогенного галактозодефіцитного IgA1-, що містяться в кровообігу та депонуються в ниркових клубочках пацієнтів з IgAN (1). Джерело (тобто пов’язані зі слизовою оболонкою лімфоїдні тканини та/або кістковий мозок) і стимули для виробництва імунного комплексу невідомі. Нещодавно ми продемонстрували, що плазматичні клітини, що виробляють IgA, з кишечника можуть мігрувати в тканини неімунної системи, такі як запалений мозок в експериментальній моделі енцефаліту розсіяного склерозу, радикально змінюючи переважаючі погляди на властивості плазматичних клітин (2). Тому спокусливо припустити, що отримані зі слизової оболонки IgA-секретуючі клітини також можуть бути залучені до інших органів, таких як нирки.

Клінічні та експериментальні дані свідчать про зв’язок між IgAN та мікробним впливом слизової оболонки. Пацієнти з IgAN відчувають макроскопічну гематурію одночасно з фарингітом (3), і тонзилектомія вважається стандартом лікування пацієнтів з IgAN в Японії (4–6). Наші попередні дослідження моделі мишачого IgAN свідчать про те, що комменсальна мікробна колонізація має важливе значення для розвитку IgAN у мишей із надмірною експресією представника сімейства TNF BAFF (7, 8). Ця модель має багато спільних рис з IgAN людини, включаючи недостатньо глікозильований IgA; клінічні та гістологічні показники ураження нирок, такі як протеїнурія; і IgA-домінантний гломерулонефрит (7, 8). Згодом локус TNFSF13 (APRIL) був пов’язаний з IgAN у дослідженнях асоціації на рівні геному (9). Оскільки APRIL і BAFF мають схожі рецептори, вісь BAFF/APRIL була залучена до патогенезу захворювання IgAN.

Тому ми припустили, що в умовах високих рівнів BAFF/APRIL клітини, що секретують IgA, рекрутуються до нирок і сприяють розвитку IgAN. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми охарактеризували мікробіомні профілі мигдаликів і калу великої групи пацієнтів з IgAN у порівнянні з учасниками неспорідненої контрольної групи, які проживали в домашніх умовах. Ми виявили підвищене носійство Neisseria в мигдалинах і посилене виробництво IgA, спрямованого проти Neisseria, у крові нашої когорти пацієнтів. Ми зворотно перевели ці спостереження в експериментальну модель IgAN і виявили, що підвищені рівні BAFF спровокували посилену IgA-упереджену системну імунну відповідь на вплив Neisseria на слизову оболонку. Ми відзначили підвищену експресію РНК, що кодує секретований сплайсований варіант IgA в нирках наших експериментальних мишей, що свідчить про локальну транскрипцію IgA. Використовуючи нестандартний ELISPOT, ми виявили, що в нирках цих мишей можна виявити клітини, що виділяють анти-Neisseria-специфічні IgA. Наші результати показали, що дезадаптивна реакція хазяїна на комменсальний організм була пов’язана із захворюванням IgAN і рекрутуванням комменсальних специфічних IgA-секретуючих клітин у нирці

Результати

Аналіз 16s рРНК виявляє зміни в мікробіомі мигдалин пацієнтів з IgAN порівняно зі здоровими особами контролю.

Враховуючи зв’язок між фарингітом і гематурією при IgAN (4), ми порівняли мікробіоту мигдаликів і калу групи пацієнтів із IgAN (n=93) із мікробіотою здорових неспоріднених осіб (n {{3} }) з використанням секвенування 16S рРНК V4. Клінічні характеристики наведені в таблиці 1. Ми не спостерігали жодних статистично значущих відмінностей у різноманітності Шеннона або таксономічному багатстві між випадками та здоровими контрольними зразками мигдаликів (додатковий малюнок 1; додатковий матеріал доступний в Інтернеті разом із цією статтею; https://doi.org/ 10.1172/jci.insight.141289DS1). Домінуючий рід мигдалин відрізнявся між випадками та контролем (рис. 1A), з тенденцією до відмінностей у Neisseria як домінантному роду в зразках мигдалин IgAN (тест χ2, P=0.15). Таким чином, ми оцінили різницю у відносній чисельності (RA) Neisseria (рис. 1B) і підтвердили наявність значно більшої чисельності мигдалин Neisseria в IgAN порівняно з контролем (2-кінцевий нескоригований t-критерій P {{19} }.002). Не було помічено жодних відмінностей у різноманітності чи таксономічному багатстві мікробіоти калу в IgAN порівняно з контролем (додатковий малюнок 2).

Гуморальні імунні відповіді на Neisseria є зміщеними в бік IgA проти IgG у пацієнтів з IgAN. На підставі спостережуваних відмінностей у чисельності мікроорганізмів мигдаликів ми припустили, що пацієнти можуть демонструвати змінені титри антикомменсальних антитіл у своїй циркуляції. Оскільки Neisseria представляли найпоширеніший рід у пацієнтів, ми вимірювали гуморальні відповіді проти нейсерій, оцінюючи співвідношення анти-Neisseria IgA до анти-Neisseria IgG у сироватці. Це співвідношення повідомляється як середня відповідь IgA/IgG проти панелі з 4 комменсальних видів Neisseria (анти-N. lactamica, N. sicca, N. cinerea та N. flavescens) і 4 патогенних N. men гінгівіту (Nme) штами (90/18311, H4476, 208 і 860800). Як показано на малюнку 2, у пацієнтів із IgAN спостерігалося збільшення співвідношення титрів IgA/IgG антитіл до Neisseria у плазмі крові. Підвищення титрів IgA проти Neisseria спостерігалося у відповідь як на патогенний штам Nme, так і на комменсальний штам (додатковий малюнок 3). Таким чином, пацієнти з IgAN демонстрували упередженість у бік генерації посиленої відповіді IgA на різноманітні коменсальні види Neisseria та штами Nme порівняно зі здоровими особами контролю.

Вплив надекспресії BAFF на імунну відповідь на Nme у BAFF-трансгенних мишей. Раніше ми повідомляли, що цитокін APRIL (TNFSF13) був підвищений у сироватці пацієнтів з IgAN порівняно з контролем у 2 незалежних когортах (8). Ми підтвердили, що APRIL був підвищений у пацієнтів із IgAN у поточній когорті (медіана 1,98 проти 1,55; IQR 1,75, {{10}}.38; P <0,01). Крім того, ми спостерігали позитивну кореляцію між рівнями APRIL у сироватці крові та протеїнурією (ρ=0.28 за Спірменом, P=0.01). Як і в нашому попередньому дослідженні, ми не спостерігали відмінностей у рівнях BAFF у сироватці крові.

APRIL зв’язується з TACI, рецептором TNF, який сприяє переключенню класу на IgA (10). TACI також стимулюється мультимерами вищого порядку BAFF, і надмірна експресія BAFF у BAFF-трансгенних (BAFF-Tg) мишей є достатньою для стимуляції TACI, таким чином імітуючи сигнал APRIL/TACI (11). Важливо, що з віком миші BAFF Tg демонструють IgAN-подібне захворювання, що характеризується недостатньо глікозильованим IgA у сироватці, відкладенням IgA в нирках, підвищеною протеїнурією та патологією нирок (8). Раніше ми показали, що мікробіота є істотним кофактором, який сприяє відкладенню імунних комплексів IgA в нирках мишей BAFF у порівнянні з мишами BAFF-Tg (8). Це означає, що взаємодія хазяїн-мікробіом може відігравати певну роль в етіології IgAN, принаймні у мишей. Однак у наших попередніх дослідженнях ми не оцінювали, чи можуть конкретні мікробні кандидати прискорити патогенез IgAN-подібного захворювання у мишей BAFF-Tg.

Таким чином, далі ми досліджували можливість того, що націлені на Neisseira імунні відповіді, упереджені IgA, можуть спостерігатися у мишей із надмірною експресією BAFF. Name вражає епітелій через рецептор CEACAM-1. Оскільки Name буде зв’язуватися з людиною, але не з мишачим CEACAM-1, ми схрестили мишей BAFF-Tg з мишами, які експресують людську форму CEACAM-1 (hC-Tg), щоб створити подвійних трансгенних мишей (B × hC- Tg). Трансгенних мишей та їхніх однопомітних контрольних тварин назально інфікували Nme, а сироватку та змиви з носа згодом збирали для аналізу. Як показано на малюнку 3A, хоча миші hC-Tgneg (WT) не були помітно колонізовані Nme, миші hC-Tg і B × hC-Tg продемонстрували однакові показники колонізації Nme (80% проти 100%, P {{ 15}} NS) та подібне бактеріальне навантаження (192,9 проти 116,7, P=NS) через 5 днів після інфікування. Ці дані вказують на те, що миші B × hC-Tg не мали змінених показників колонізації Nme порівняно з мишами WT.

Раніше ми показали, що для індукції імунітету проти наступної третьої носової інфекції у мишей hC-Tg необхідні 2 носові інфекції (12). Щоб визначити, чи показали миші B × hC-Tg покращений кліренс Nme порівняно з контролем hC-Tg, ми двічі назально інфікували мишей, на 1-й і 14-й дні. Через 24 години після вторинного інфікування швидкість інфікування hC-Tg мишей і B × hC-Tg мишей був подібним (85% проти 80%), що демонструє відсутність нейтралізуючого імунітету, викликаного 1 попереднім впливом Nme (Малюнок 3B). Це означає, що надмірна експресія BAFF не усуває потребу в 2 інфекціях, щоб індукувати захист від колонізації в нашій моделі миші.

Враховуючи, що не було явного впливу надмірної експресії BAFF на назальну чутливість до Nme, ми розглянули реакцію мишачих антитіл на колонізацію Nme. Спочатку ми оцінили місцеву відповідь IgA та IgG на Nme. Назальний Nme-специфічний IgG, як оцінено в назофарингеальній промивній рідині, не був виявлений у жодної миші, і назальні титри анти-Nme IgA були подібними як для B × hC-Tg, так і для hC-Tg мишей (рис. 3C). Далі ми вимірюємо системну відповідь антитіл на інфекцію Nme. Після другої назальної інфекції як миші hC-Tg, так і миші B × hC-Tg продемонстрували Nme-специфічну відповідь IgG у сироватці крові вище початкового рівня, при цьому миші hC-Tg демонстрували середній титр анти-Nme IgG 2-разів більше, ніж що у мишей B × hC-Tg (164 нг/мл проти 54,6 нг/мл) (рис. 3D). Навпаки, середній титр анти-Nme IgA у сироватці B × hC-Tg мишей був у 10-разів вищий, ніж у контрольних hC-Tg (321,7 нг/мл проти 33,09 нг/мл) (Малюнок 3E) . Взяті разом, наші висновки продемонстрували, що в той час як місцева відповідь IgA на Nme була порівнянною між мишами hC-Tg і B × hC-Tg, системна гуморальна імунна відповідь на назальний вплив Nme була IgA-зміщеною у мишей B × hC-Tg (рис. 3F).

Вплив колонізації Nme на IgA в нирках мишей BAFF-Tg. Враховуючи, що системні рівні Nme-специфічного IgA були значно підвищені у мишей BAFF-Tg, ми припустили, що комбінація трансгену BAFF та інфекції Nme може прискорити патологію нирок порівняно з неінфікованими мишами BAFF-Tg. Тому ми оцінювали мезангіальне розширення клубочків шляхом фарбування зрізів нирок періодичною кислотою-Шиффа (PAS). Використовуючи напівкількісну оцінку мезангіального розширення, ми спостерігали незначну тенденцію до збільшення мезангіального розширення у B × hC-Tg мишей (рис. 4, A і B).

Далі ми розглянули вплив інфекції Nme на відкладення IgA в нирках, діагностичну ознаку IgAN. За допомогою імуногістохімії відкладення мезангіального IgG не було виявлено в жодної миші (дані не показані). Крім того, ми не спостерігали мезангіального IgA в нирках мишей WT або hC-Tg. Навпаки, миші B × hC-Tg і BAFF-Tg демонстрували відкладення IgA в зонах розширення мезангіалу PAS+ (репрезентативний розділ на малюнку 4C). Для більш кількісного аналізу експресію мРНК, що кодує секретовану сплайс-форму IgA, оцінювали за допомогою кількісної ПЛР у нирках усіх груп мишей (рис. 4D). Була значна різниця в експресії секретованої сплайс-форми IgA між групами (Крускел-Уолліс 1-way ANOVA, P=0.01), з подвійними трансгенними мишами (B × hC-Tg), демонструючи значно вищі рівні експресії IgA порівняно з іншими експериментальними групами (тест множинного порівняння Данна скоригував P <0,05 для всіх порівнянь). Ці результати показали, що колонізація мишей BAFF-Tg Nme призвела до збільшення експресії IgA в самій нирці.

Нещодавно виявивши, що IgA-секретуючі клітини слизової оболонки мігрують у тканину мозку мишей з експериментальним енцефалітом (2), ми припустили, що внутрішньониркова експресія мРНК IgA може відображати наявність антикомменсальних клітин, що продукують IgA, які мігрували з місця первинне патобіонтне опромінення. Тому ми розробили спеціальний аналіз ELISPOT для виявлення Nme-специфічних клітин, що секретують антитіла. Планшети ELISPOT з високою афінністю покривали Nme, убитим теплом, і інкубували з одноклітинною суспензією імунних клітин, отриманих із нирок наших піддослідних мишей; Згодом додавали HRP-кон'юговані IgA антитіла для виявлення. Ми виявили, що Nme-специфічні IgA-секретуючі клітини були ідентифіковані в паренхімі нирок Nme-інфікованих мишей, переважно в умовах підвищених рівнів BAFF (миші B × hC-Tg, рис. 5).

Figure 1. Tonsil microbiota. (A) The most abundant genus (>2× відносна чисельність наступного найпоширенішого роду) у мазках з мигдалин у пацієнтів з IgAN були Neisseria. Кожен колір представляє окремий рід, а вісь y вказує на частку зразків із цим родом як найпоширенішим організмом (χ2, P=0.18). (B) Відносна чисельність представників роду Neisseria була значно вищою за IgAN порівняно з неспорідненими здоровими контрольними особами в домогосподарствах (2-кінцевий нескоригований t-тест P=0.002).