Гіпоферемія, опосередкована гепсидином, порушує імунні відповіді на вакцинацію та інфекцію. Частина 2

ДИСКУСІЯ

Залізо та імунометаболізм

Індукована гепсидином гіпоферемія є добре збереженим компонентом вродженої імунної відповіді у хребетних.8 Ми демонструємо, що гіпоферемія може погіршити численні аспекти адаптивного імунітету, якщо вона виникає в період експансії лімфоцитів, з потенціалом подальшого тривалого інгібування Т-клітинна пам'ять навіть після зникнення гіпоферемії. Ми показуємо, що відповідна регуляція поглинання клітинним залізом, контрольована IRP1/2, є важливою для ефекторних функцій Т-клітин, а опосередковане TFRC придбання заліза є внутрішньо необхідним клітинам для відповідей В- і Т-клітин in vivo.

Помітне зростання експресії TFRC активованими Т-клітинами, збільшення на ~1 мільйон копій білка на клітину протягом 24 годин, разом із зростанням трансмембранних імпортерів заліза, вказує на значне посилення зусиль щодо отримання заліза з позаклітинних джерел. Хоча ми показали, що окислювальний метаболізм і дослідження синтезу ДНК є двома залізозалежними процесами, які пригнічуються в Т-клітинах через низьку доступність заліза, багато інших клітинних шляхів, важливих для біології Т-клітин, включаючи епігенетичне перепрограмування та відчуття гіпоксії, також вимагають заліза і повинні бути досліджені.

Крім того, знижена експресія CD25 і нездатність відчувати IL-2 можуть сприяти погіршенню якості ефекторних/пам'яті CD8 Т-клітин, що спостерігається при дефіциті заліза.27 Оскільки прискорена метаболічна активність активованих лімфоцитів особливо чутлива до наявності заліза, фізіологічні коливання концентрації заліза сильно впливають на імунну відповідь. Таким чином, залізо можна вважати поживною речовиною, що має відношення до концепцій імунометаболізму.28

Під імунітетом розуміється здатність організму захищатися від різних шкідливих факторів зовнішнього світу. Хороший імунітет має великий вплив на організм людини, зокрема: 1. Стійкість до хвороб: імунітет може ідентифікувати та знищувати патогени та запобігати зараженню людського організму хворобами. 2. Сприяти одужанню: якщо організм людини був інфікований патогенами, імунітет може прискорити одужання від хвороби та сприяти фізичному одужанню. 3. Антистаріння: погана імунна функція спричинить старіння організму, а хороший імунітет може затримати старіння організму. 4. Запобігайте раку: хороша імунна система може знищити ракові клітини та запобігти раку. 5. Захист серцево-судинного здоров’я: хороший імунітет може зменшити виникнення серцево-судинних захворювань.

Тому нам потрібно зміцнювати свій імунітет у повсякденному житті. Дослідження показали, що цистанхе може підвищити імунітет. Цистанхе також містить деякі антиоксидантні речовини, такі як флавоноїди, вітамін С тощо, які можуть допомогти видалити вільні радикали в організмі, зменшити окисне пошкодження клітин і, таким чином, опосередковано підвищити імунітет. Різноманітні поживні компоненти та активні речовини цистанхи можуть діяти синергетично, підвищувати імунітет організму та відігравати позитивну роль у зміцненні здоров’я людини.

Клацніть на переваги цистанчі для здоров’я

Гепсидин, гіпоферемія та вірусні інфекції

Контрольований гепсидином перерозподіл заліза захищає від деяких бактеріальних інфекцій і малярії у мишей.29,30 У людей підвищення рівня гепсидину та гіпоферемія виникають після експериментальних інфекцій норовірусу, черевного тифу та малярії,31–33, а також під час початкової появи вірусемії у ВІЛ{ {5}}інфікованих донорів крові.34 Хоча запальна гіпоферемія може бути корисною в контексті інфекцій одноклітинними організмами, які повинні отримувати залізо від свого хазяїна, відсутні докази того, що низький вміст заліза в сироватці є захисним у контексті вірусних інфекцій. Фактично, у наших експериментах з вірусом грипу, накладення гіпоферемії, спричиненої гепсидином, призвело до порушення адаптивної імунної відповіді, персистенції вірусу та важкого легеневого захворювання, що свідчить про те, що низький вміст заліза в сироватці крові іноді може бути некорисною реакцією на інфекцію.

Останні звіти показують, що гіпоферемія присутня у пацієнтів з коронавірусною хворобою 2019 (COVID-19) при надходженні до відділення інтенсивної терапії (ВІТ).35 Низький рівень сироваткового заліза корелює з лімфопенією та надзвичайно низьким вмістом сироваткового заліза (~3 ммоль/л). ) виявили пацієнтів із COVID-19 із важкою респіраторною гіпоксемією, ймовірно вторинною внаслідок ураження легень. Ця гіпоферемія є глибшою, ніж у раніше зареєстрованих когортах пацієнтів у відділенні інтенсивної терапії без COVID-19, включаючи тих із сепсисом,36,37 що вказує на те, що екстремальна гіпоферемія може бути особливою ознакою тяжкого захворювання COVID-19. IL-6 стимулює експресію гепсидину, а незбалансована запальна відповідь із високим IL-6 і відносно низьким IFN типу I та III типу пов’язана з тяжким перебігом COVID-19 і поганими результатами.38,39 IL -6-зумовлена ​​та опосередкована гепсидином гіпоферемія може погіршити противірусну адаптивну імунну відповідь, сприяючи тяжкості інфекції. Тоцилізумаб, який націлено на IL-6R, досліджується як засіб для лікування COVID-19 і може протидіяти гіпоферемії. Моніторинг сироваткового заліза у пацієнтів з COVID-19 може бути корисним для оцінки тяжкості захворювання та ефекту лікування.

Компроміс заліза — наслідки для адаптивного імунітету та вакцинації

Попередні характеристики ролі заліза в контексті інфекції описують спроби збудника захопити залізо господаря, яке господар захищає, що призводить до еволюційної гонки озброєнь.40 Ми припускаємо, що гіпоферемія інфекції також є компромісом для хазяїн, який намагається зменшити вірулентність вторгнення патогенів шляхом утримування заліза, але при цьому одночасно утримує залізо від адаптивних імунних реакцій.

Результат цього компромісу залежатиме від природи викликаної інфекції, величини та типу запальної відповіді та основного статусу заліза в хазяїні. У всьому світі гіпоферемія поширена в популяціях, у яких поширений дефіцит заліза в харчуванні, а також у них є тягар інфекцій і запалень, які підвищують гепсидин, комбінація, яка, ймовірно, впливає на сотні мільйонів людей.4, 10 Крім того, що впливає на реакцію на безпосередню інфекцію, гіпоферемія може опосередковано впливати на інфекційний тягар, погіршуючи відповідь на вакцинацію. Ефективність та імуногенність деяких вакцин є неоптимальними в популяціях, у яких дефіцит заліза є ендемічним41, і в таких популяціях дитяча смертність від інфекцій, яким можна запобігти за допомогою вакцинації, залишається неприйнятно високою.42 Тут ми демонструємо на моделі поросят, що заліза підсилює реакцію на вакцинацію. в контексті природного дефіциту заліза.

Нещодавно ми показали в ретроспективному аналізі кенійських немовлят, що анемія пов’язана з порушенням гуморальної відповіді на деякі вакцини і що додавання заліза може посилити гуморальну відповідь на вакцину проти кору.43 Однак залізо також може збільшити ризик деяких інфекцій і негативно впливають на кишкову мікробіоту.4 Отже, потрібні індивідуальні випробування, щоб визначити, чи цільове харчове залізо, що вводиться приблизно під час вакцинації, покращує ефективність імунізації в популяціях із дефіцитом заліза, включаючи дітей і людей похилого віку.

Підвищений гепсидин і гіпоферемія у пацієнтів з IRIDA з мутаціями в TMPRSS6 можуть бути пов’язані з порушенням гуморального імунітету, принаймні проти деяких патогенів. Постійно високий рівень гепсидину та гіпоферемія також є ознаками неінфекційних хронічних запальних розладів, таких як хронічна хвороба нирок,9 і запалення та дефіцит заліза спостерігаються при раку.44 Адаптивний імунітет у цих популяціях і станах може бути порушений гіпоферемією. Слід зазначити, що фармакологічна або генетична маніпуляція активністю гепсидину, призначена як терапевтичне втручання для розладів, пов’язаних із залізом, відносно добре розроблена.45 Таким чином, гепсидин вже є потенційно доступною мішенню і може бути досліджений як спосіб контролю імунної відповіді в багатьох контексти.

Обмеження дослідження

У той час як наше дослідження виявило, що обмеження заліза погіршує аеробний метаболізм Т-клітин, як оцінюють за споживанням кисню та потенціалом мітохондріальної мембрани, ширші підходи без гіпотез можуть забезпечити більш цілісну оцінку механізму, за допомогою якого обмеження доступності заліза порушує функцію Т-клітин. Відповіді як Т-, так і В-клітин порушуються дефіцитом заліза в сироватці in vivo, але ми не досліджували, як фізіологія ізольованих В-клітин порушується дефіцитом заліза або як залізо впливає на диференціацію Т-клітин. Крім того, ми не запитували, якою мірою порушення пам’яті Т-клітин CD8 через дефіцит заліза поширюється на пам’ять CD4 та В-клітин і як ці спостереження можуть вплинути на відповідь на вакцини та захист від інфекції.

Резюме

Ми виявили, що спричинена гепсидином гіпоферемія погіршує первинну реакцію та реакцію пам’яті на імунізацію, і ми виявили глибокий попит на активовані Т-клітини для опосередкованого залізом принаймні частково IRP1/2 та TFRC. Високий рівень гепсидину може пригнічувати адаптивні імунні відповіді на патогени, тоді як на фоні низького вмісту заліза в сироватці додаткове залізо може покращити імунну відповідь. Ці результати вказують на те, що сироваткове залізо, яке регулюється гепсидином, є важливою та потенційно цільовою точкою контролю імунітету.

СТАР плюс МЕТОДИ

Детальні методи наведені в онлайн-версії цього документа та включають наступне:

ПОДЯКА

Автори дякують співробітникам Департаменту біомедичних послуг Оксфордського університету тваринництва, Алірезі Мороват (Клінічна біохімія, Траст Фонду NHS Hospitals Oxford University) за допомогу в біохімічних вимірюваннях, Девіду Паттінсону (Інститут Дженнера, Оксфордський університет) і Biobest Laboratories , Единбург, за допомогу в аналізах ELISA, а також установі проточної цитометрії Інституту молекулярної медицини Weatherall і членам Cantrell Lab, Університет Данді, за багато корисних обговорень.

Цю роботу підтримала Рада медичних досліджень Великобританії (основне фінансування відділу імунології людини MRC для HD, нагорода № MC_UU_12010/10), а також стипендія Крістофера Велча та короткострокова стипендія EMBO JNFSJ Дрейпер є дослідником Дженнера, науковим співробітником Інституту Лістера та старшим науковим співробітником Wellcome Trust (106917/Z/15/Z).

Ми дякуємо Інституту Дженнера, Оксфордському університету та Viral Vector Core Facility за виробництво рекомбінантних вірусних вакцин. Робота, проведена в i3S, була підтримана регіональною операційною програмою Norte 2020 Portugal (грант № Norte-01-0145- FEDER-000012); автори також висловлюють подяку за підтримку i3S Scientific Platform HEMS, члена національної інфраструктури PPBI-Португальської платформи біовізуалізації (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). OB фінансується стипендією сера Генрі Велкома (105654/Z/14/Z). TKT фінансувався благодійним фондом Townsend-Jeantet Charitable Trust (благодійна організація № 1011770). MS та UG були підтримані відділом імунології людини MRC. Основне фінансування VCBK фінансується грантом NIHR Research Capability Funding, наданим Оксфордським центром біомедичних досліджень. SJ Dunachie є дослідником Jenner і фінансується Фондом Флемінга при Департаменті охорони здоров’я та соціального забезпечення Великобританії. MDF і DRC підтримуються професорським званням С. Берта Волбаха Гарвардської медичної школи. SKW було підтримано докторською програмою з інфекцій, імунології та трансляційної медицини Wellcome Trust (грант № 108869/Z/15/Z). BG отримала гранти від Deutsche Forschungsgemeinschaft (гранти № GA2075/3-1 та GA2075/5-1). Магістратура була профінансована Міжнародною дослідницькою студентською програмою Університету Редінга. Наразі AS підтримується стипендією NIHR Doctoral Research Fellowship (NIHR-DRF-2017-10-094). Це дослідження присвячене Марії де Соузі та Вінченцо Серундоло.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

Концепція та дизайн роботи, JNF, TKT, MA, TLD, AEA, ARMT, BG, MCL та HD Збір та аналіз даних, JNF, TKT, MA, AS, SKW, MB, NS, KW, BK, GS, DRC, TLD, JML, AEA, JA, PJL, AEP, DA, MT, CN, MS, UG, FRMvdK, ARMT, BG, MDF, MCL та HD Збір, фенотипування та генотипування пацієнтів із дефіцитом заліза, MDF та Інтерпретація даних DRC, JNF, NS, TLD, OB, SCA, SJ Dunachie, MZ, FRMvdK, VC, SJ Draper, ARMT, BG, MDF, MCL і запис HD, JNF і HD

ДЕКЛАРАЦІЯ ПРО ІНТЕРЕСИ

HD був членом консультативної ради Kymab, отримав фінансування досліджень від Pfizer і La Jolla Pharmaceutical Company, а також отримав гонорари від Pharmacosmos і Vifor. Інші автори заявляють про відсутність конкуруючих інтересів.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Фан, А.Т., Голдрат, А.В., та Гласс, К.К. (2017). Метаболічна та епігенетична координація імунітету Т-клітин і макрофагів. Імунітет 46, 714–729.

2. Андрейні К., Путіньяно В., Розато А. та Банчі Л. (2018). Залізо-протеом людини. Металоміка 10, 1223–1231.

3. Джабара, Х.Х., Бойден, С.Е., Чоу, Дж., Рамеш, Н., Массаад, М.Дж., Бенсон, Х., Бейнтер, В., Фрауліно, Д., Рагімов, Ф., Сіфф, К. та ін. al. (2016). Місенс-мутація в TFRC, що кодує рецептор трансферину 1, викликає комбінований імунодефіцит. Нац. Жене. 48, 74–78.

4. Pasricha, SR, Armitage, AE, Prentice, AM, and Drakesmith, H. (2018). Зменшення анемії в країнах з низьким рівнем доходу: контроль над інфекцією є важливим. BMJ 362, k3165.

5. Muckenthaler, MU, Rivella, S., Hentze, MW, and Galy, B. (2017). Червона доріжка для метаболізму заліза. Осередок 168, 344–361.

6. Немет, Е., Таттл, М. С., Повелсон, Дж., Вон, М. Б., Донован, А., Уорд, Д. М., Ганц, Т., і Каплан, Дж. (2004). Гепсидин регулює відтік заліза з клітин шляхом зв’язування з феропортином і індукування його інтерналізації. Наука 306, 2090–2093.

7. Лім, П.Дж., Дуарте, Т.Л., Арезес, Дж., ГарсіаСантос, Д., Хамді, А., Пасріча, С.Р., Армітаж, А.Е., Мехта, Х., Уайдмен, С., Сантос, А.Г., та ін. (2019). Nrf2 контролює гомеостаз заліза при гемохроматозі та таласемії через Bmp6 та гепсидин. Нац. Метаб. 1, 519–531.

8. Drakesmith, H., and Prentice, AM (2012). Гепсидин і залізо-інфекційна вісь. Наука 338, 768–772.

9. Ганц Т. (2019). Анемія запалення. Н. англ. J. Med. 381, 1148–1157.

10. Армітаж А.Е., Агбла С.К., Беттс М., Сісе Е.А., Джаллоу М.В., Самбу Е., Дарбо Б., Ворвуі А., Вайнсток Г.М., Антоніо М. та ін. (2019). Швидке зростання є домінуючим предиктором пригнічення гепсидину та зниження рівня феритину у немовлят Гамбії. Haematologica 104, 1542–1553.

11. Прентіс А.М., Бах А., Джеллоу М.В., Джеллоу А.Т., Саньянг С., Сісе Е.А., Сісей К., Дансо Е., Армітаж А.Е., Пасріча С.-Р. та ін. (2019). Респіраторні інфекції викликають опосередковану гепсидином блокаду всмоктування заліза, що призводить до залізодефіцитної анемії в африканських дітей. Sci. Досягнення 5, eaav9020.

12. Доллман, PR (1987). Дефіцит заліза та імунна відповідь. Am. Дж. Клін. Nutr. 46, 329–334.

13. Оппенгеймер, SJ (2001). Залізо та його зв'язок з імунітетом та інфекційними захворюваннями. J. Nutr. 131 (2S-2), 616S–633S, обговорення 633S–635S.

14. Ван З., Інь В., Чжу Л., Лі Дж., Яо Ю., Чень Ф., Сунь М., Чжан Дж., Шен Н., Сонг Й. ., і Чанг, X. (2018). Залізо стимулює патогенність Т-хелперних клітин, сприяючи РНК-зв’язувальному білку PCBP1-опосередкованому виробленню прозапальних цитокінів. Імунітет 49, 80–92.e7.

15. Цзян Ю., Лі К., Ву К., Ан П., Хуанг Л., Ван Дж., Чен Ч., Чень X., Чжан Ф., Ма Л. ., та ін. (2019). Залізозалежне деметилювання гістону 3 лізину 9 контролює проліферацію В-клітин і гуморальну імунну відповідь. Нац. Комун. 10, 2935.

16. Преза, Г. К., Ручала, П., Пінон, Р., Рамос, Е., Цяо, Б., Перальта, Массачусетс, Шарма, С., Варінг, А., Ганц, Т., і Немет, Е. (2011). Мінігепцидини — це раціонально розроблені малі пептиди, які імітують активність гепсидину у мишей і можуть бути корисними для лікування перевантаження залізом. Дж. Клін. Інвестувати. 121, 4880–4888.

17. Хоуден, А. М., Хукельманн, Дж. Л., Бренес, А., Спінеллі, Л., Сінклер, Л. В., Ламонд, А. І., і Кантрелл, Д. А. (2019). Кількісний аналіз протеомів Т-клітин і сенсорів середовища під час диференціювання Т-клітин. Нац. Immunol.20, 1542–1554. 

18. Hentze, MW, Muckenthaler, MU, Galy, B., and Camaschella, C. (2010). Два до танго: регуляція метаболізму заліза у ссавців. Осередок 142, 24–38.

19. Хукельман, Дж.Л., Андерсон, К.Е., Сінклер, Л.В., Гжес, К.М., Мурільо, А.Б., Хокінс, П.Т., Стівенс, Л.Р., Ламонд, А.І., і Кантрелл, Д.А. (2016). Цитотоксичний Т-клітинний протеом і його формування кіназою mTOR. Нац. Immunol. 17, 104–112.

20. Найт З.А., Шмідт С.Ф., Бірсой К., Тан К. та Фрідман Дж.М. (2014). Критична роль mTORC1 в еритропоезі та анемії. eLife 3, e01913.

21. Gerlach, C., Moseman, EA, Loughhead, SM, Alvarez, D., Zwijnenburg, AJ, Waanders, L., Garg, R., de la Torre, JC, and von Andrian, UH (2016). Рецептор хемокіну CX3CR1 визначає три субгрупи Т-клітин CD8, які мають різні ролі в імунному нагляді та гомеостазі. Імунітет 45, 1270–1284.

22. Хіконо Х., Кольмаєр Д.Є., Такамура С., Віттмер С.Т., Робертс А.Д., Вудленд Д.Л. (2007). Фенотип активації, а не фенотип центральної або ефекторної пам’яті, передбачає ефективність відкликання пам’яті CD8 плюс Т-клітин. J. Exp. Мед. 204, 1625–1636.

23. Ритич Дж.Л., Елмор М.Р., Бертон М.Д., Конрад М.С., Донован С.М., Ділгер Р.Н. та Джонсон Р.В. (2012). Дефіцит заліза в ранньому віці порушує просторове пізнання у новонароджених поросят. J. Nutr. 142, 2050–2056.

24. Maes, D., Segales, J., Meyns, T., Sibila, M., Pieters, M., and Haesebrouck, F. (2008). Контроль інфекцій Mycoplasma hyopneumoniae у свиней. вет. мікробіол. 126, 297–309.

25. Файнберг, К.Е., Хіні, М.М., Кампанья, Д.Р., Айдінок, Ю., Пірсон, Г.А., Хартман, К.Р., Мейо, М.М., Семюел, С.М., Строус, Дж.Дж., Маркіанос, К. та ін. (2008). Мутації в TMPRSS6 викликають стійку до заліза залізодефіцитну анемію (IRIDA). Нац. Жене. 40, 569–571.

26. Харбо, З. Б., Бенфілд, Т. Л., Валентінер-Брант, П., Хьюлер, Т., Ламбертсен, Л., Калтофт, М., Крогфельт, К., Слотвед, Х. К., Крістенсен, Дж. Дж., і Конрадсен, Х. Б. ( 2010). Тимчасові тенденції інвазивних пневмококових захворювань і пневмококових серотипів за 7 десятиліть. Clin. Інфікувати. дис. 50, 329–337.

27. Калія, В., Саркар, С. (2018). Регуляція ефекторної та пам’ятної диференціації Т-клітин CD8 за допомогою IL-2 — акт балансування. Фронт. Immunol. 9, 2987.

28. Лі Ю.С., Воллам Дж. та Олефскі Дж.М. (2018). Інтегрований погляд на імунометаболізм. Осередок 172, 22–40.

29. Арезес Дж., Юнг Г., Габаян В., Валоре Е., Рухала П., Гуліг П.А., Ганц Т., Немет Е. та Булут Ю. (2015). Індукована гепсидином гіпоферемія є критичним механізмом захисту організму від гідрофільної бактерії Vibrio vulnificus. Cell Host Microbe 17, 47–57.

30. Португалія, С., Каррет, К., Рекер, М., Армітаж, А.Е., Гончолвес, Луїзіана, Епіфаніо, С., Салліван, Д., Рой, К., Ньюболд, К.І., Дрейксміт, Х. , та ll ВІДКРИТИЙ ДОСТУП 178 Med 2, 164–179, 12 лютого 2021 р. Клінічна та трансляційна стаття Mota, MM (2011). Осередкова регуляція суперінфекції при малярії. Нац. Мед. 17, 732–737.

31. Дартон, Т.К., Бломке, К.Дж., Джаннулату, Е., Уоддінгтон, К.С., Джонс, К., Стерджес, П., Вебстер, К., Дрейксміт, Х., Поллард, А.Дж., і Армітаж, А.Е. (2015) . Швидка ескалація гепсидину та пов’язане з ним голодування сироваткового заліза є особливостями гострої відповіді на черевний тиф у людей. ПЛОС Негл. Троп. дис. 9, e0004029.

32. Споттісвуд, Н., Армітаж, А.Е., Вільямс, А.Р., Файф, А.Дж., Бісвас, С., Ходжсон, С.Х., Ллевелін, Д., Чоудхарі, П., Дрейпер, С.Дж., Даффі, П.Е., і Дрейксміт, Х. (2017). Роль активінів у регуляції гепсидину під час малярії. Інфікувати. Імунна. 85, e00191-e17.

33. Вільямс А.М., Ладва К.Н., Леон Дж.С., Лопман Б.А., Тангпріча В., Уайтхед Р.Д., Армітаж А.Е., Рей К., Мороват А., Пасріча С.Р. та ін. (2019). Зміни в концентраціях мікроелементів і біомаркерів запалення в сироватці після зараження людини норовірусом. Am. Дж. Клін. Nutr. 110, 1456–1464.

34. Армітаж, А.Е., Стейсі, А.Р., Джаннулату, Е., Маршалл, Е., Стерджес, П., Чата, К., Сміт, Н.М., Хуанг, X., Сю, X., Пасріча, SR та ін. . (2014). Різні моделі регуляції гепсидину та заліза під час інфекцій ВІЛ-1, ВГВ та ВГС. Proc. Natl. акад. Sci. США 111, 12187–12192.

35. Шах, А., Фрост, Дж. Н., Аарон, Л., Донован, К., і Дрейксміт, Х.; Співробітники (2020). Системна гіпоферемія та тяжкість гіпоксемічної дихальної недостатності при COVID-19. Крит. Догляд 24, 320.

36. Lan, P., Pan, KH, Wang, SJ, Shi, QC, Yu, YX, Fu, Y., Chen, Y., Jiang, Y., Hua, XT, Zhou, JC, and Yu, YS (2018). Високий рівень сироваткового заліза пов'язаний із збільшенням смертності пацієнтів із сепсисом. Sci. Відповідь 8, 11072.

37. Таке, Ф., Нуралдін, Р., Кох, А., Стратманн, К., Хатшенройтер, Г., Траутвайн, К., і Стрнад, П. (2016). Параметри заліза визначають прогноз тяжкохворих пацієнтів. Крит. Care Med. 44, 1049–1058.

38. Бланко-Мело, Д., Нільссон-Пайант, Б.Е., Лю, В.К., Уль, С., Хогланд, Д., Мьоллер, Р., Джордан, Техас, Ойші, К., Паніс, М., Сакс, Д. та ін. (2020). Незбалансована реакція організму на SARS-CoV-2 сприяє розвитку COVID-19. Комірка 181, 1036–1045.e9.

39. Цао, X. (2020). COVID-19: імунопатологія та її значення для терапії. Нац. Rev. Immunol. 20, 269–270.

40. Барбер, М. Ф. та Елде, Північна Кароліна (2014). Втеча від бактеріального піратства заліза завдяки швидкій еволюції трансферину. Наука 346, 1362–1366.

41. Олоту, А., Феган, Г., Вамбуа, Дж., Ньянгвесо, Г., Ліч, А., Лівенс, М., Каслоу, округ Колумбія, Ньюгуна, П., Марш, К., і Бейон, П. (2016). Семирічна ефективність вакцини проти малярії RTS, S/AS01 серед маленьких африканських дітей. Н. англ. J. Med. 374, 2519–2529.

42. Грінвуд, Б. (2014). Внесок вакцинації у глобальне здоров’я: минуле, теперішнє та майбутнє. Філос. пер. R. Soc. Лонд. B біол. Sci. 369, 20130433.

43. Stoffel, NU, Uyoga, MA, Mutuku, FM, Frost, JN, Mwasi, E., Paganini, D., van der Klis, FRM, Malhotra, IJ, LaBeaud, AD, Ricci, C. та ін. (2020). Залізодефіцитна анемія під час вакцинації передбачає зниження відповіді на вакцину, а додавання заліза під час вакцинації збільшує гуморальну відповідь на вакцину: когортне дослідження при народженні та рандомізоване випробувальне дослідження у кенійських немовлят. Фронт. Immunol. 11, 1313.

44. Лопес, А., Какуб, П., Макдугал, І.С., і Пейрен-Біруле, Л. (2016). Залізодефіцитна анемія. Lancet 387, 907–916.

45. Кацару, А., Пантопулос, К. (2018). Гепсидин Терапевтика. Pharmaceuticals (Базель) 11, 127.

46. ​​Шульман, Дж.Л., і Кілборн, Е.Д. (1969). Незалежні зміни в природі антигенів гемаглютиніну та нейрамінідази вірусу грипу: відмінність антигену гемаглютиніну гонконгського -68 вірусу. Proc. Natl. акад. Sci. США 63, 326–333.

47. Пауелл, Т.Дж., Сілк, Дж.Д., Шарпс, Дж., Фодор, Е., та Таунсенд, А.Р. (2012). Псевдотипований вірус грипу А як вакцина для індукції гетеротипічного імунітету. Ж. Вірол. 86, 13397–13406.

48. Wang C., Hart M., Chui C., Ajuogu A., Brian IJ, de Cassan SC та ін. (2016). Реакція В-клітин зародкового центру та Т-фолікулярних хелперних клітин на вірусний вектор та білок-в ад’ювантних вакцинах. J. Immunol. 197, 1242–1251.

49. Галі, Б., Феррінг, Д., і Генце, М.В. (2005). Генерація умовних алелів генів мишачого регуляторного білка заліза (IRP) -1 і -2. Буття 43, 181–188.

50. Badea, TC, Wang, Y., and Nathans, J. (2003). Неінвазивна генетична/фармакологічна стратегія для візуалізації клітинної морфології та клональних зв’язків у миші. J. Neurosci. 23, 2314–2322.

51. Хіні М.М., Гуо Д., Де Фалько Л., Кампанья Д.Р., Олбіна Г., Као П.П., Шміц-Абе К., Рахімов Ф., Гутшоу П., Вестерман К. ., та ін. (2018). Нормалізація гепсидину передбачає статус мутації TMPRSS6 у пацієнтів з хронічним дефіцитом заліза. Кров 132, 448–452.

52. Найк, С.Х., Пройетто, А.І., Вілсон, Н.С., Дакіч, А., Шноррер, П., Фуксбергер, М., Лахуд, М.Х., О'Кіф, М., Шао, К.Ю., Чен, В.Ф., та ін. . (2005). Передовий край: генерація еквівалентів дендритних клітин селезінки CD8 plus і CD8- у культурах кісткового мозку Fms-подібного ліганду тирозинкінази 3. J. Immunol. 174, 6592–6597.

53. Сяо Б., Ден X., Чжоу В. та Тан Е.К. (2016). Оцінка мітофагії на основі проточної цитометрії за допомогою MitoTracker. Фронт. Стільниковий. Неврологія. 10, 76.

54. Армітаж А.Е., Лім П.Дж., Фрост Дж.Н., Пасріча С.Р., Сойле Е.Дж., Еванс Е., Мороват А., Сантос А., Діас Р., Біггс Д. та ін. (2016). Індуковане порушення гормону гепсидину, що регулює залізо, пригнічує гостру запальну гіпоферемію. J. Innate Immun. 8, 517–528.

55. Бухвейц, Дж.П., Кармаус, П.В., Харкема, Дж.Р., Вільямс, К.Дж., і Камінські, Н.Е. (2007). Модуляція реакції дихальних шляхів на грип A/PR/8/34 дельта9-тетрагідроканабінолом у мишей C57BL/6. J. Pharmacol. Exp. Тер. 323, 675–683.

56. Efstratiou, A., and Maple, PAC (1994). Лабораторна діагностика дифтерії (Європейське регіональне бюро Всесвітньої організації охорони здоров'я).

57. Хефеле Л., Сіфан С., Шаявон Д., Хомсана А., Кляйне Д., Чантавілай П., Нуантхонг П., Ксайдаласук К., Фатхаммавонг О., Білламей С. ., та ін. (2019). Серопротекція на різних рівнях системи охорони здоров’я після планової вакцинації проти дифтерії, правця, кашлюку, цільноклітинного гепатиту B, Haemophilus influenzae типу B у Лаоській Народно-Демократичній Республіці. Clin. Інфікувати. дис. 69, 2136–2144.

58. Всесвітня організація охорони здоров'я (2005). Рекомендації щодо виробництва та контролю пневмококових кон’югованих вакцин. Всесвітній орган охорони здоров'я. техн. Представник Сер. 927, 64–98.

59. Chen, RT, Markowitz, LE, Albrecht, P., Stewart, JA, Mofenson, LM, Preblud, SR, and Orenstein, WA (1990). Антитіла проти кору: переоцінка захисних титрів. Ж. Інфікувати. дис. 162, 1036–1042.

СТАР плюс МЕТОДИ

ТАБЛИЦЯ ОСНОВНИХ РЕСУРСІВ

НАЯВНІСТЬ РЕСУРСІВ

Провідний контакт

Подальшу інформацію та запити на ресурси та реагенти слід надсилати головному контактному особі Хелу Дрейксміту (alexander.drakesmith@ imm.ox.ac.UK), який виконуватиме його.

Наявність матеріалів

Цей проект не створив нових унікальних реагентів.

Наявність даних і коду

Цей проект не створив жодного нового коду чи нових наборів даних.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА МОДЕЛЬ ТА ДЕТАЛІ СУБ'ЄКТУ Миші

Якщо не зазначено інше, процедури з тваринами проводилися згідно з проектом Міністерства внутрішніх справ Великобританії та особистими ліцензіями відповідно до Закону про тварин (наукові процедури) 1986 року та були схвалені етичним комітетом Оксфордського університету. Мишей утримували в індивідуальних вентильованих клітках і годували необмежено стандартною дієтою, що містила 188 ppm заліза (SDS Dietex Services, дієта 801161), або опроміненою дієтою з низьким вмістом заліза (2 ppm Fe, TD.99397, Teklad Envigo), або опроміненою дієтою зі скоригованим вмістом заліза (контроль дієти з низьким вмістом заліза, 200 ppm Fe, TD.07801, Teklad Envigo). Мишей евтаназували при зростаючих концентраціях CO2.

Миші WT C57BL/6JOlaHsd були замовлені в Envigo. WT B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (конгенічні миші, що експресують C57BL/6 CD45.1) були розведені в Оксфордському університеті. Мишей WT утримували на стандартній дієті з вмістом заліза 188 частин на мільйон принаймні 2- тижнів у приміщенні, перш ніж проводити порівняння з трансгенними. Миші TfrcY20H/Y20H на гомогенному фоні C57BL/6 були добрим подарунком від Райфа Гехи, Бостонської дитячої лікарні, Гарвардської медичної школи.3 OT-I CD45.1: Трансгенний C57BL/ 6.Tg(TcraTcrb)1100Mjb (OT-I) мишей, схрещених з конгенічним штамом B6 BL6. Внутрішній проект SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ був доброю пожертвою від Майка Богетофте Барнкоба та Вінченцо Серундоло (MRC HIU). OT-II CD45.1/CD45.2 гетерозиготні миші.

Трансгенні B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OT-II) миші були подарунком від Олівера Беннарда та спочатку з лабораторії Джексона, Бар-Харбор, ME, і схрещені з конгенічними гомозиготними B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ (CD45.1) для створення мишей, гетерозиготних за трансгеном Tg(TcrbaTcrb)425Cbn, Pepc і Pepb алелі: OT-II CD45.1/CD45.2 гетерозиготні.

Під час окремих експериментів усіх мишей порівнювали за статтю та віком (протягом 2- тижнів). Для експериментів з імунізацією in vivo використовували мишей віком від 6-9 тижнів, на момент початку експерименту всі миші мали вік від 6-12 тижнів. У кожному експерименті мишей випадковим чином розподіляли по групах лікування таким чином, щоб однакова кількість мишей у кожній клітці отримувала кожне лікування. Для експериментів з дієтою мишей випадковим чином розподіляли по групах дієти на початку експерименту.

Т-клітини з умовною втратою функції IRP були отримані від тварин, отриманих шляхом схрещування ліній мишей, що несуть floxed Irp1 (Aco1) та Irp2 (Ireb2) алелі49, з нокаутним штамом, що несе тамоксифен-індуковану послідовність рекомбінази CRE (CreERT2) з дозволеною Rosa26 locus.50 Aco1flox/flox, Ireb2flox/flox, Rosa26 plus / plus (CRE-негативний, названий IRP1/2flox/flox Cre –ve) та Aco1flox/flox, Ireb2flox/flox, Rosa26 plus /CreERT2 однопомітники (CRE-позитивний, названий IRP1/ 2flox/flox Cre plus ve) були на однорідному фоні C57BL/6. Розведення та процедури, проведені на мишах у DKFZ, проводилися відповідно до інституційних вказівок. Мишей генотипували за допомогою послідовностей праймерів Aco1 та Ireb2 у таблиці ключових ресурсів.

Введені речовини

Мінігепцидин: відповідну масу мінігепсидину PR7329 (da-TH-Dpa-bhProRCR-bhPhe-Ahx-Ida(гексадециламін)-NH2) розчиняють у 80% етанолі, а потім змішують із 60 мг Purebright SL220/Sunbright DSPE{{13 }}CN (NOF). Контрольним розчином був Purebright SL220, розчинений в етанолі. Етанол випарювали за допомогою вакуумної камери, нагрітої до 50°С. Отриманий гель зберігали протягом 24 годин при 4°C і повторно розчиняли у відповідному об’ємі води, щоб отримати концентрацію mHep 1 мМ: 100 нМолей міні-гепсидину в 100 мл води вводили миші на дозу.

Цитрат заліза амонію (FAC) (F5879 Sigma Aldrich) розчиняли в 3 мг/мл PBS. 100 мл вводили мишам внутрішньочеревно. Декстран заліза (Sigma, D8517) доводили до 20 мг/мл у PBS і 100 мл вводили мишам внутрішньочеревно.

Імунізації

Модифікований вірус коров’ячої віспи Ankara, що експресує овальбумін: MVA-OVA, був добрим подарунком від Viral Vector Core Facility, Jenner Institute, University of Oxford. Вірус розводили до 10^7 бляшкоутворюючих одиниць (PFU)/мл у PBS і 100 мл вводили підшкірно в бік мишей.

Серотип 5 аденовірусу людини, який експресує овальбумін: AdHu5-OVA, був добрим подарунком від Viral Vector Core Facility, Jenner Institute, University of Oxford. Вірус розводили до 10^10 вірусних частинок (VP)/мл у PBS і 100 мл вводили підшкірно в бік мишей.

Для первинної імунізації білком OVA миші отримували 200 мкг (для відповідей OT-I або OT-II) або 800 мкг (ендогенні відповіді) OVA (кінець Овальбумін vac-pov, Invivogen), 25 мкг MPLA (vac-mpla, Invivogen) і 1 мкг альфа-галактозилцераміду (подарунок від GS Besra, Університет Бірмінгема, Великобританія або KRN7000 Enzo Life Sciences). Для вторинної імунізації білком OVA миші отримували 200 мкг OVA і 25 мкг MPLA підшкірно в бік.

Усиновителі

Для експериментів, пов’язаних із реакцією OT-I CD8 або OT-II CD4 T-клітин, отримували суспензії селезінки, лізованої еритроцитами, і частоту OT-I CD8 T-клітин або OT-II CD4 T-клітин оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Концентрацію суспензії цілої селезінки доводили до 50,000 OT-I CD8 T-клітин/мл або 500,000 OT-II CD4 T-клітин/мл, і 100 мкл клітинної суспензії в PBS вводили внутрішньовенно

Змішані химери кісткового мозку

Для експериментів із змішаним химеризмом кісткового мозку суміш 60 відсотків TfrcY20H/Y20H CD45.2 (або WT CD45.2) кісткового мозку поєднували з 40% CD45.1 кісткового мозку, щоб перевірити ємність клітин TfrcY20H/Y20H для відновлення та сприяння імунній відповіді відносно клітин дикого типу. Чоловічі реципієнти CD45.2 у віці 8 тижнів отримували смертельне опромінення 4,5 Гр протягом 300 с, потім 3-годинний відпочинок і подальша доза 4,5 Гр протягом 300 с. Миші отримали 2 мільйони клітин кісткового мозку від зазначених мишей після 9-тижнів відпочинку. Для аналізу відновлення за допомогою проточної цитометрії було взято периферичну кров. Для запобігання бактеріальної інфекції миші-реципієнти отримували антибіотики в питній воді (0,16 мг/мл енрофлоксацину (Байтріл), Bayer Corporation).

Вірусна інфекція грипу

Вірус грипу (A/X-31 (H3N2) A/Aichi/2/1968)46 розмножували в клітинах MDCK-SIAT1 і кількісно визначали за допомогою аналізів гемаглютинації та TCID50, як описано раніше.47

Мишей анестезували аерозолем ізофлурану та інфікували 0.08 одиницями гемаглютинації (HAU) вірусу грипу X-31 інтраназально. Вірусну суспензію капали піпеткою на ніздрі так, щоб вірус вдихався.

Титри специфічних проти грипу антитіл у сироватці інфікованих мишей вимірювали за допомогою аналізів мікронейтралізації in vitro інфікування клітин MDCK-SIAT1 H3N2 (X31) GFP, що експресує псевдотипований репортерний вірус (S-FLU), як описано47 з незначними модифікаціями. Коротше кажучи, зібрану мишачу сироватку інактивували нагріванням при 56°C протягом 30 хвилин. Розведення сироваток (початкове розведення 1:40) інкубували з H3N2 (X31) S-FLU протягом 2 годин при 37°C перед додаванням 3e4 індикаторних клітин MDCK-SIAT1. Планшети інкубували протягом ночі при 37°C. Потім пластини промивали і фіксували в 10% формаліні. Експресію GFP вимірювали на планшетному рідері Clariostar, а розведення сироваток, що призвело до 50-відсоткового зниження інфікування вірусом (визначено через 50-відсоткове зниження сигналу GFP), повідомили як нейтралізуючий титр (EC50).

Дослідження поросят

Утримання поросят і експериментальні процедури проводилися в Центрі досліджень молочної промисловості (CEDAR) Університету Редінга відповідно до місцевих етичних правил. Усі експерименти були схвалені Редінгським органом з питань добробуту тварин та етики (AWERB) і проводилися згідно з ліцензією Міністерства внутрішніх справ Великобританії.

Щоб оцінити вплив дефіциту заліза на відповідь на вакцинацію, 18 великих білих гібридних поросят F1 із 6 послідів були рівномірно розподілені між 2 групами лікування відповідної статі у віці 1 дня. Лікування було таким: група 1: контрольна група без добавки заліза, яку годували замінником молока свиноматок (SMR), подібним до молочної суміші для немовлят на основі бичачого молока; група 2: отримували добавку заліза (150 мг/кг маси тіла) SMR, половина цієї групи також отримувала внутрішньом’язову ін’єкцію заліза (200 мг Fe) у віці 1 дня (рис. S6). До прибуття в CEDAR поросята не отримували щеплень, антибіотиків або внутрішньом’язових ін’єкцій заліза. Спочатку поросят утримували у 2 групах (пероральні препарати заліза та без пероральних добавок заліза), щоб вони навчилися пити з мисок, а у віці 2 днів були окремо.

Протягом усього випробування поросят утримували при 30°C на тирсі та соломі, забезпечували нагрівальними лампами з 12-годинним циклом світла та темряви та мали вільний доступ до свіжої питної води. Спочатку поросята отримували 10-відсоткову концентрацію SMR (з добавками заліза або без добавок) кожні 4 години (5 годувань/день), а на 4-й день цю дозу було збільшено до 15 відсотків і зрештою до 20 відсотків (4 годування/день, стандартна концентрація). щоб зменшити ризик подряпин. Після вимірювання ваги двічі на тиждень кількість SRM і сульфату заліза (пероральна добавка заліза) була відповідно збільшена для досягнення 150 мг/кг маси тіла протягом усього дослідження. Всі поросята отримали внутрішньом’язову вакцинацію проти Mycoplasma hyopneumoniae (2 мл, Suwaxyn MH-One, Zoetis Ltd, Leatherhead, UK) у віці 2 тижнів, а зразки крові були зібрані за допомогою венепункції з використанням вакутейнерів без EDTA через 2 тижні (перед вакцинацією), 3 і 4 тижні (поствакцинальні). Кров негайно охолоджували протягом 3-4 годин перед центрифугуванням для отримання сироватки, яка зберігалася при 80°C. Через 28 днів поросят було вбито передозуванням пентобарбіталу натрію ВР 20% (Dolethal, Vetoquinol Ltd, Нортгемптоншир, Великобританія).

Пацієнти IRIDA

Збір, генотипування та гематологічне фенотипування IRIDA та контрольних пацієнтів були описані раніше.51

Культура клітин

Усі клітини культивували при 37°C, 20% O2 і 5% CO2. ЗМІ. Виконайте R10. RPMI з 10% FCS (сигма), глутамін (2 мМ), пеніцилін (100 ОД/мл), стрептоміцин (0,1 мг/мл) і бета-меркаптоетанол (55 мМ). Живильне середовище, модифіковане залізом. Було замовлено замінник сироватки Pannexin NTS (P04-95080; Pan Biotech) без заліза. Замінник сироватки Pannexin NTS, що не містить заліза, був доданий у концентрації 10 об’ємних відсотків до RPMI разом із глутаміном (2 мМ), пеніциліном (100 ОД/мл), стрептоміцином (0,1 мг/мл) і бета-меркаптоетанолом (55 мМ), щоб повністю звільнити залізо. середній. Для зміни вмісту заліза в повному середовищі без заліза додавали голотрансферин (T0665 Sigma Aldrich) у вказаній концентрації. Апотрансферин (T1147 Sigma Aldrich) також додавали до повного середовища без заліза, щоб підтримувати загальну концентрацію трансферину в середовищі на рівні 1,2 мг/мл.

Т-клітини CD8. Одноклітинні суспензії виготовляли з шийних, пахових, пахвових і плечових лімфатичних вузлів шляхом механічної дисоціації через 40 мм клітинний фільтр. Під час аналізу проліферації суспензії лімфатичних вузлів ресуспендували в 500 мл PBS з 5 мМ Invitrogen Cell Trace Violet (C34557) і фарбували при 37°С протягом 8 хвилин перед гасінням 12 мл повного середовища, промиванням і переходом до виділення Т-клітин. CD8 T-клітини були виділені з лімфатичних вузлів WT C57BL/6, TfrcY20H/Y20H, OT-I CD45.1 за допомогою набору для виділення CD8 T-клітин Stem Cell Technologies (19853, Stem Cell Technologies) і Easy Plate Magnet, а також з IRP1 /2flox/flox Cre -/ plus ve з використанням набору для виділення негативних Т-клітин CD8 Miltenyi Biotech (130-104-075, Miltenyi Biotech) відповідно до інструкцій виробника.

Планшети з плоским дном, оброблені культурою тканини, покривали 5 мг/мл антимишачого CD3 (145-2C11) протягом 2 годин при 37°C, а потім промивали PBS. Т-клітини CD8 поміщали в повне середовище з кінцевою концентрацією 100 ОД/мл мишачого IL-2 та 1 мг/мл антимишачого CD28 (37,51). Культури за участю клітин TfrcY20H/Y20H, WT C57BL/6 або IRP1/2flox/flox Cre -/ plus ve проводили в повному середовищі R10. Культури для вивчення впливу зниженої концентрації заліза на WT Т-клітини мишей C57BL6/ або OT-1 CD45.1 проводили в повному середовищі без заліза. Т-клітини CD8 висівали в чашки в кінцевій концентрації 500000/мл для аналізу через 72 години після активації для аналізу проліферації або 700000/мл для аналізу через 24 години після активації для аналізу активації.

Для культури IRP1/2flox/flox Cre -/ plus 5 клітин обробляли 4-гідрокситамоксифеном (4-OHT) (H6278, Sigma/Merck) при 100 нМ або порівнянним об’ємом чистого етанолу одночасно з активаційною сумішшю розчинного анти-CD28, IL-2 і анти-CD3, пов’язаного з планшетом. Коли потрібно було проаналізувати проліферацію клітин, після 24 годин культивування клітини збирали, центрифугували та ресуспендували у свіжому середовищі з 100 ОД/мл мишачого ІЛ-2 та 1 мг/мл антимишачого CD28 для видалення {{19} }OHT або EtOH і замінено в лунки, вкриті антимишачим CD3. Клітини культивували протягом додаткових 48 годин і проліферацію оцінювали за допомогою проточної цитометрії.

Для експериментів із збереженням заліза сульфат заліза (FeSO4) (F8633, Sigma Aldrich) або цитрат заліза амонію (FAC) (F5879, Sigma Aldrich) додавали у вказаній концентрації з початку культивування та поповнювали у випадку експериментів IRP1/2flox/flox Cre -/ plus через 24 години після видалення 4-OHT/EtOH.

BMDC культивували, як описано52, з незначними модифікаціями. Коротше кажучи, клітини кісткового мозку мишей C57BL/6, лізовані еритроцитами, ресуспендували при 1 мільйоні клітин/мл у повному середовищі R10 із 100 нг/мл FLT3L (550702, Biolegend) і культивували протягом 7 днів перед використанням.

ДЕТАЛІ МЕТОДУ

Проточна цитометрія

Одноклітинні суспензії лімфатичних вузлів або селезінки виготовляли шляхом механічної дисоціації через 40 мм клітинний фільтр. Еритроцити лізували в суспензіях селезінки з використанням трис-амоній хлориду (ACT). Буфер для лізису еритроцитів (2,06 г/л трис-основи та 7,47 г/л NH4Cl, 1 л H2O, доведений до pH 7,2)

Щоб виділити лімфоцити з легенів, легені подрібнювали ножицями та перетравлювали протягом 30 хвилин у 4 мл травного середовища: RPMI, 40 ОД/мл ДНКаза I (Sigma-Aldrich, номер за каталогом: D5025) і 0,4 мг/мл. мл Collagenase IV (Sigma-Aldrich, каталожний номер: C5138). Одноклітинні суспензії виготовляли шляхом подрібнення через 70-клітинний фільтр. Клітини осаджували і еритроцити лізували буфером для лізису еритроцитів ACT. Потім для збагачення лімфоцитів у легеневій суспензії використовували шаровий ізоляційний шар 40%/80% Percoll (GE Healthcare 17-0891-02). Збагачені лімфоцити потім промивали та підраховували перед фарбуванням потоку.

Для аналізу лейкоцитів периферичної крові миші 100 мл цільної крові, зібраної шляхом кровотечі з хвоста в пробірку BD micro trainer EDTA, змішували з 1 мл буфера для лізису еритроцитів ACT та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Розчин крові центрифугували при 400 g протягом 5 хвилин, супернатант видаляли, а осад лейкоцитів переносили в круглодонний 96-лунковий планшет для фарбування проточною цитометрією.

Суспензії клітин тканин або клітини, активовані in vitro, у відповідні моменти часу після активації клітин переносили в 96-планшет із круглим дном із ямками, центрифугували та промивали 200 мл PBS. Клітини фарбували відповідними концентраціями блоку рецепторів FC, кон’югованих з флуорофором антитіл і фіксованого живого мертвого барвника в 40 мл PBS протягом 20 хвилин при 4°С у темряві. Клітини промивали та запускали безпосередньо на Invitrogen Attune або BD LSR Fortessa. Для деяких експериментів клітини фіксували протягом 10 хвилин у 100 мкл 4% параформальдегіду при 4°C у темряві перед промиванням і ресуспендуванням для аналізу або ресуспендуванням у буфері для хімічної завивки на основі сапоніну для фарбування внутрішньоклітинних антигенів.

Фарбування тетрамерів з використанням реагентів із установки тетрамерів NIH проводили при кімнатній температурі протягом 30 хвилин у буфері FACs (PBS з 2 відсотками FCS і 0,04 відсотками азиду натрію) перед фарбуванням антитіл.

Для мітохондріального аналізу клітини промивали та фарбували Mitotracker Green (M7514, Thermofisher Scientific) і Mitotracker Deep Red (M22426, Thermofisher Scientific) при 100 нМ у повному середовищі (залізодефіцитне середовище для рекапітуляції сироваткового дефіциту заліза або R10 для TfrcY20H/ культури Y20H) протягом 30 хвилин при 37°C згідно з інструкціями виробника. Ми виявили, що фарбування MTDR було чутливим до фармакологічного руйнування потенціалу мітохондріальної мембрани за допомогою карбонілціанід-п-трифторметоксифенілгідразону (FCCP), що відповідає опублікованій літературі.53 Співвідношення MTDR до MTG було розраховано, щоб вказати мембранний потенціал, нормований для об’єму мітохондрій. .

Для виявлення внутрішньоклітинних цитокінів спленоцити висівали з 2 мільйонами клітин/200мл у повне середовище в круглодонний 96-лунковий планшет із 0,1 мг/мл SIINFEKL (OVA 257-264)( Vac-sin Invivogen) пептид для OVA-специфічних відповідей, 0,5 мг/мл пептиду B8R для вакцинних специфічних відповідей (AS-64688, Anaspec) або 1 мкг/мл OVA (323-339), (Va-is, Invivogen), щоб індукувати виробництво цитокінів OT-II. Через 30 хвилин додавали 5 мг/мл брефелдину А і клітини культивували ще 4 години перед поверхневим/внутрішньоклітинним фарбуванням для проточної цитометрії.

Для виявлення MVA-специфічних відповідей CD4 за допомогою ICS, BMDC на 7-й день висівали в чашки з 0.3 мільйонами клітин на лунку 96-лункового планшета з 50нг/мл FLT3L. BMDC або залишали без стимуляції, або неспецифічно стимулювали 0,5 мМ CpG (ODN 1826) (Tlrl-1826, Invivogen), або інфікували MOI 1 MVA-OVA протягом ночі. Наступного дня клітини промивали і додавали 2 мільйони спленоцитів від неімунізованих або імунізованих MVA мишей. Через 30 хвилин додавали Brefeldin A до кінцевої концентрації 5 мг/мл і клітини культивували ще 4 години перед поверхневим/внутрішньоклітинним фарбуванням для проточної цитометрії. Т-клітини CD4, що секретують цитокіни, були визначені як CD154 плюс цитокін плюс (порівняно з нестимульованими CD4 на CpG-імпульсних DC або CD4 від неактивних мишей).

Перегляньте таблицю ключових ресурсів для використання антитіл.

Приклади схем стробування для ключових сукупностей зображені на рисунках 1–6 додаткових методів. CD8 плюс CD44 плюс тетрамер плюс CD8 Т-клітини (додаткові методи, рис. 1A) і вплив міні-гепсидину на тетрамер-позитивні CD8 (додаткові методи, рис. 1B). B220 плюс IgD-CD95 плюс В-клітини зародкового центру (додаткові методи, рис. 2A) і вплив міні-гепсидину на В-клітини зародкового центру (додаткові методи, рис. 2B). CD4 плюс CD44 плюс CXCR5 плюс PD-1 плюс Т-фолікулярні хелперні клітини (додаткові методи, рис. 3A) і вплив міні-гепсидину на Т-фолікулярні хелперні клітини (додаткові методи, рис. 3B). CD138 плюс IgD-плазматичні клітини (додаткові методи, рис. 4A) і вплив міні-гепсидину на плазму (додаткові методи, рис. 4B). CD8 плюс CD45.1 плюс OT-I CD8 (додаткові методи, рис. 5A) і вплив міні-гепсидину на ефекторні клітини OT-I (додаткові методи, рис. 5B). Гейтинг OT-I IFN-gamma, TNF-alpha або IL-2, що продукують CD8 T-клітини, за допомогою ICS (додаткові методи, рис. 6A) і вплив міні-гепсидину на цитокіни-продукуючі CD8 T-клітини (додаткові методи, рис. 6B).

Аналіз експресії генів за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR)

РНК екстрагували з експлантів печінки або легеневих часток, зібраних пізніше в РНК (AM7020 Thermofisher Scientific) і швидко заморожених клітинних гранул за допомогою набору RNeasy plus (QIAGEN, 74136) і зворотно транскрибували в кДНК (Life Technologies, 4387406) для кількісної ПЛР на Applied Швидка система ПЛР у реальному часі Biosystems 6500 із використанням аналізів TaqMan, перелічених у таблиці ключових ресурсів. згідно з протоколами виробника. Експресія гена представлена ​​як 2^([CT ендогенного контрольного гена] – [CT цікавого гена]). Hprt використав ендогенний контрольний ген для qRT-PCR печінки та легенів. B2m використовувався як контрольний ген для культур Т-клітин CD8, оскільки CT не змінюється під час активації Т-клітин.

Вимірювання вмісту заліза в тканинах і сироватці крові

Тканини сушили протягом 3 годин при 100C і вимірювали суху масу шматка тканини. Шматочки тканини переварювали в 10% трихлороцтової кислоти/30% соляної кислоти протягом 20 годин при 65°C. Вміст негемового заліза визначали реакцією розщепленої кислотою тканини з хромогенним реагентом, що містить 0,1 відсотка (маса/об’єм) батофенантроліндисульфонової кислоти (Sigma, 146617) і 0,8 відсотка тіогліколевої кислоти (Sigma, 88652), вимірювання поглинання при 535 нм і порівняння до стандартної кривої цитрату заліза (III) амонію, як описано.54

Для аналізу сироватки зразків мишей до 400 мл крові, отриманої шляхом пункції серця, поміщали в пробірку BD micro trainer SST (Beckton Dickinson). Сироватку отримували центрифугуванням. Зразок згорнутої крові обертали при 8,000 г протягом 5 хвилин і зберігали при 80°C. Рівень сироваткового заліза кількісно визначали за допомогою автоматичного аналізатора Abbott Architect c16000 (Abbott Laboratories) і набору MULTIGENT Iron Kit в Оксфордській лікарні Джона Редкліффа, Великобританія.

Аналіз дослідження поросят

Рівень сироваткового заліза свиней вимірювали за допомогою автоматизованого аналізу на автоматизованому аналізаторі Abbott Architect c16000 (Abbott Laboratories) у відділі клінічної біохімії OUHNHS. Зразки сироватки тестували на антитіла до M. hyopneumoniae за допомогою комерційного моноклонального блокуючого ELISA (набір для виявлення M. hyopneumoniae, Thermo Scientific Oxoid, Великобританія, K004311) відповідно до інструкцій виробника в Biobest Laboratories Ltd, Единбург; Результати оптичної щільності зразка (OD) були скориговані з використанням середнього OD контрольних лунок буфера. Сироваткові титри нейтралізуючих антитіл (агностик ізотипу) розраховували як відсоток блокування сигналу, отриманого від зв'язування визначеного анти-М. hyopneumoniae HRP кон'юговане антитіло, включене в аналіз. Результати були представлені як покращення у відсотковому блокуванні на 28-й день (14 днів після імунізації) відносно 14-го дня (день імунізації), щоб виявити покращення відповіді антитіл у порівнянні з успадкованими материнськими антитілами. Поліпшення у відсотках блокування=(відсоток блокування на день 28) – (відсоток блокування на день 14).

Титри мишачих анти-OVA IgG

Титри антитіл проти білка OVA від імунізованих мишей визначали за допомогою ELISA. Коротше кажучи, планшети покривали білком OVA (InvivoGen Endofit, 50 мл/лунку при 10 мг/мл) протягом ночі. Розведення досліджуваних сироваток (у трьох примірниках) додавали до планшета. Планшети промивали 6 разів PBS-T (PBS, 0,05% Tween). Щоб виявити IgG, що зв’язує OVA, козяче антимишаче вторинне антитело зв’язує козячий антимишачий IgG, кон’югований з лужною фосфатазою (Sigma Aldrich A-3562), з наступним промиванням. OD405 після додавання субстрату pNPP кількісно визначали за допомогою пристрою для зчитування планшетів ELx800 (Bio-Tek). Розведення, при якому OD спочатку було нижчим від фонового плюс 3 SD, реєстрували в AU як титр кінцевої точки.

Вимірювання антитіл у сироватці крові людини у пацієнтів IRIDA

Концентрації антитіл (IgG) проти кору, епідемічного паротиту, краснухи, вітряної віспи, Ptx, FHA, PRN, Dtxd, Ttx, Hib і Streptococcus пневмонії серотипів 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F у сироватці крові пацієнтів із IRIDA з мутантними алелями TMPRSS6 і контрольних тварин дикого типу TMPRSS6 без дефіциту заліза вимірювали в Національному інституті громадського здоров’я та навколишнього середовища, Білтховен, Нідерланди. У жодному випадку середня концентрація антитіл не була значно вищою у пацієнтів з TMPRSS6.

гістологія

Щоб оцінити запалення дихальних шляхів, зразки легенів фіксували 4-відсотковим параформальдегідом у фосфатному буфері та заливали в парафін на базовому об’єкті HEMS в i3S, Португалія. Після депарафінізації ксилолом і гідратації пропусканням через спирти зрізи товщиною 3 мм фарбували гематоксилін-еозином. Гістопатологічні бали для легеневого запалення були призначені за допомогою модифікованих критеріїв55 таким чином: 0, норма, відсутність запалення; 1 — мінімальні, рідкісні вогнища запалення; 2, легкий запальний клітинний інфільтрат периваскулярного/перибронхіолярного відділу без альвеолярного розширення або з незначним розширенням; 3, помірний запальний клітинний інфільтрат периваскулярного/перибронхіолярного простору з помірним поширенням на альвеолярну паренхіму; і 4, важкий запальний клітинний інфільтрат периваскулярного/перибронхіолярного простору з більшою величиною запальних вогнищ, виявлених в альвеолярній паренхімі.

Нейтрофільну інфільтрацію класифікували як 0, без ознак поліморфноядерних лейкоцитів (PMN); 1 — наявність диспергованого ПМЯ; 2, частий PMN з вогнищевою агрегацією; 3, частий ПМН з мультифокальною агрегацією. Інфільтрацію нейтрофілів додатково оцінювали за допомогою фарбування хлорацетатестеразою (Ледер), що проводилося в службі анатомічної патології в Centro Hospitalar de Sa˜ o Joa˜o, Португалія. Фарбування орцеїном (виконано в IPATIMUP Diagnostics, Португалія) використовувалося для оцінки еластичних волокон альвеолярних перегородок і оцінки ступеня змін альвеолярної структури легенів, пов’язаної з наявністю запального інфільтрату. Зрізи оцінювали двома дослідниками, включаючи навченого патологоанатома, наосліп без попереднього знання груп лікування. Середній бал розраховували та порівнювали між групами лікування. Зрізи селезінки обробляли аналогічно, але фарбували берлінської блакитною реакцією Перлза на тривалентне залізо за допомогою стандартних процедур.

Швидкість виробництва АТФ за допомогою аналізу метаболічного потоку Seahorse

Швидкість виробництва АТФ і відносний внесок мітохондріального та гліколітичного метаболізму в це було розраховано згідно з протоколом виробника за допомогою набору для аналізу рівня АТФ у реальному часі Agilent Seahorse XF (103592-100) і приладу Aligent XF96. Коротко, CD8 Т-клітини збирали через 48 годин після активації в середовищі із зазначеною концентрацією трансферину, промивали та ресуспендували в середовищі для аналізу Seahorse (небуферизоване RPMI pH 7,40 з 1мМ пірувату, 2мМ L-глутаміну та 10мМ глюкози) і 150 000 життєздатних клітин/лунку розподіляли на мікропланшет XF96, покритий полі-D-лізином. Швидкість споживання кисню (OCR) і швидкість позаклітинного підкислення (ECAR) вимірювали після послідовного додавання 1,5 мМ олігоміцину та 0,5 мМ ротенону/антиміцину А.

Кількісне визначення АТФ за допомогою люмінесценції

Виробництво АТФ вимірювали за допомогою Cell Titer-Glo (Promega G7570) відповідно до інструкцій виробника. Коротко кажучи, Т-клітини CD8 культивували, як описано в «культурі клітин» протягом 24 годин (і, отже, аналізували перед ініціацією поділу клітин), центрифугували та ресуспендували в 50 мл середовища (без заліза для залізодефіцитних культур, нормальний RPMI з 10 відсотків FCS для культур TfrcY20H/Y20H), перенесли в непрозорий 96-лунковий планшет з білими стінками, придатний для вимірювань люмінесценції, і додали 50 мл Cell Titer-Glo. Лунки змішували і люмінесценцію, пропорційну вмісту АТФ, вимірювали на люмінометрі Promega GloMax.

КІЛЬКІСНИЙ ТА СТАТИСТИЧНИЙ АНАЛІЗ

Для експериментів in vivo з мишами одного віку та статі використовували стандартні процедури рандомізації (піддослідних і контрольних мишей вибирали випадковим чином із однопомітних). Дослідники не були закриті для розподілу під час експериментів та оцінок. Необхідну кількість мишей для кожного експерименту визначали з наявності племінних тварин, розрахунків потужності, попереднього досвіду проведення експериментів з тими ж лініями мишей та даних пілотних експериментів. Статистичний аналіз проводили за допомогою Prism версії 6 (програмне забезпечення GraphPad). Деталі конкретних статистичних тестів наведено в підписах до рисунків.

Для концентрації антитіл у пацієнтів із TMPRSS6 IRIDA ми провели статистичний аналіз за допомогою SPSS (IBM SPSS Statistics, версія 22). Дані були перевірені на нормальність тестами Смирнова-Колмогорова та візуальним оглядом гістограм. Дані з ненормальним розподілом були логарифмічно перетворені для статистичного аналізу. Ми визначили імунологічну відповідь як захисну, коли учасники мали концентрацію IgG проти дифтерії в сироватці R 0$1МО/мл,56 протиправцевий IgG > 0.5МО/мл,57 анти-Hib IgG >1. 0мг/мл, 57 анти-PCV IgG R 0$35 мг/мл58 і проти кору IgG R 0$12 МО/мл.59.

Захисна концентрація IgG проти кашлюку в сироватці не встановлена.57 Для ефектів між групами використовувалися t-тести незалежного зразка або непараметричні тести незалежного зразка. Ми провели коваріаційний аналіз (ANCOVA), щоб оцінити вплив групи (IRIDA проти контролю) на концентрацію IgG у сироватці крові. Групу було визначено як фіксований ефект, і ми послідовно додали до моделей відомі предиктори відповіді на вакцину: стать, вік, Hb і TSAT як коваріати. Ми виконали тест Пірсона хі-квадрат і точний тест Фішера, щоб порівняти сероконверсію між IRIDA та контрольною групами.

For more information:1950477648nn@gmail.com