Корисні властивості екстракту насіння виноградної лози та його вплив на окремі біохімічні маркери в крові, печінці та нирках Rattus Norvegicus

edmund.chen@wecistanche.com

Анотація:Кадмій (Cd) є важким металом, який зустрічається в усіх сферах навколишнього середовища, включаючи харчовий ланцюг. В організмі він викликає окислювальний стрес, виробляючи вільні радикали, які є шкідливими для клітин. Екстракт виноградних кісточок (GSE) містить широкий спектр біологічно активних компонентів, які допомагають нейтралізувати негативний вплив вільних радикалів. У цьому дослідженні спостерігали вплив GSE, отриманого з напівстійкого сорту виноградної лози Season, який багатий фенолами, на біохімічні маркери бурих щурів, які зазнали впливу кадмію. GSE підвищив антиоксидантну активність плазми і, вниркиі печінки, вміст Cd був значно знижений при спільному введенні GSE. Відповідно, підвищення вмісту креатиніну та активності аланінамінотрансферази та зниження активності каталази та супероксиддисмутази, спричинене кадмієм, сповільнювалося при одночасному застосуванні GSE. Результати цієї роботи показують, що екстракт виноградних кісточок має захисну дію проти надходження важких металів в організм.

1. Введення

Кадмій (Cd) є важким металом, який зустрічається в усіх сферах навколишнього середовища; входить до складу земної кори, міститься у воді, накопичується в рослинах, є в організмах. Окрім харчового ланцюга (щодо рослин джерелами є більшість злаків, коренеплодів, овочів, а серед органів тварин, перш за все, печінка таниркиє джерелом), важливим джерелом кадмію для людини є сигаретний дим, виділення від різних видів горіння, металургійних виробництв, деяких електроустановок [1,2]. В організмі кадмій зв’язується переважно з металотіонеїном, альбуміном та іншими білками плазми крові. Кадмій є небезпечним токсичним металом, який викликає окислювальний стрес, утворюючи вільні радикали, шкідливі для клітин. Вільні радикали можуть пошкоджувати білки, ліпіди, ферменти та ДНК, і тому повинні бути нейтралізовані антиоксидантами, перш ніж проникнути в клітини [3].

Якщо Cd не нейтралізується, він викликає розпад еритроцитів [4], накопичується в організмі, особливо в печінці танирки— а завдяки схожості з цинком, який є незамінним елементом, легко вступає у ферментативні реакції та бере участь у біохімічних процесах [5]. Виводиться з організму дуже повільно і важко [6]. Добре відомо, що антиоксиданти можуть мати захисну дію проти окислювального стресу та пошкодження важкими металами, і ця експериментальна робота була заснована на цьому факті. Екстракт виноградних кісточок (GSE) містить у своїй матриці широкий спектр біологічно активних компонентів [7], які допомагають нейтралізувати несприятливу дію вільних радикалів. GSE захищає клітини від пошкодження, регулюючи окисне пошкодження клітин, зменшуючи пошкодження органів, покращуючи баланс між оксидантами та антиоксидантами та зменшуючи вивільнення медіаторів запалення. Він також має протизапальну, антиапоптотичну та проліферативну дію [8]. Особливо значущим є високий вміст конденсованих флаван-3-олів або проціанідинів, які досліджуються як альтернативний метод лікування важких захворювань [9,10]. Однак на вміст і склад фенольних речовин виноградних кісточок, а також на антиоксидантну активність екстракту насіння можуть впливати сорт виноградної лози, підщепа, кліматичні умови чи технології вирощування [11–13] і, отже, антиоксидантні властивості, як а також захисні ефекти конкретного екстракту не можна легко передбачити. Метою роботи було вивчити захисну дію ГСЕ, отриманого з напівстійкого винограду сорту Церазон, на біохімічні маркери крові, плазми, печінки таниркибурих щурів, які зазнали впливу кадмію.

Ключові слова:екстракт виноградних кісточок; антиоксиданти; кадмій; rattus norvegicus; біохімічні маркери; захисний ефект; нирки, Ренал

CISTANCHE ПОКРАЩАЄ ФУНКЦІЮ НИРОК

2. Результати та їх обговорення

2.1. Антиоксидантна активність і фітохімічний склад екстракту виноградних кісточок

Екстракт виноградних кісточок, отриманий із напівстійкого сорту Cerason, перевіряли на антиоксидантну активність, загальний вміст поліфенолів та відбирали окремі антиоксиданти. Антиоксидантну активність визначали спектрофотометрично за допомогою чотирьох методів, заснованих на різних принципах (DPPH•, ABTS• plus, FRAP, FR), а загальну кількість поліфенольних сполук визначали методом Фоліна–Чокальтеу. Залежно від використовуваного методу антиоксидантна активність коливалася від 7 до 31 мг/г еквіваленту галової кислоти (GAE), а загальний вміст поліфенолів становив 9,3 мг/г GAE (табл. 1). Результати цієї частини експерименту вказали на високий антиоксидантний потенціал виноградних кісточок.

2.2. Визначення in vivo ефекту екстракту виноградних кісточок у щурів

2.2.1. Визначення вмісту кадмію в крові, печінці та ниркахКадмій є найбільш поширеним токсичним металом у кормах. Після перорального прийому він абсорбується з кишечника, транспортується в печінку і кон’югується з тіоловими групами металотіонеїну (МТ). Окрім цього, Cd також може зв’язуватися з альбуміном або іншими білками крові [14]. Згодом Cd накопичується в організмі, повільно виводиться з організму через сечу та кал і має біологічний період напіврозпаду близько 20 років. Найбільша кількість (близько третини) кадмію міститься вниркакора. У крові більшість кадмію (близько 90 відсотків) міститься в еритроцитах. Він токсичний для широкого кола органів, і головними цілями єнирки, кістки та легені [15–17]. Повідомлялося, що GSE знижує концентрацію кадмію в еритроцитах і внирки,тоді як повідомлялося про підвищення його вмісту в печінці [14]. Результати для вмісту кадмію в крові в цьому дослідженні показані на малюнку 1A. На початку експерименту в крові тварин було виявлено 3,2 мкг/кг кадмію. Під час експерименту через 14 днів середнє значення кадмію в групі з додаванням GSE та кадмію було значно вищим, ніж в інших групах (10,8 мкг/кг, р=0.023). Через 28 днів мінливість даних була занадто високою, щоб спостерігати статистичну значущість.

На початку експерименту в печінці піддослідних тварин кадмій не виявлено (рис. 1Б). Відповідно, кадмій у печінці тварин контрольної та ГСЕ груп під час експерименту не виявлено. З іншого боку, через 14 днів експерименту середнє значення кадмію в групі з додаванням кадмію становило 5,8 мг/кг, а в групі з додаванням кадмію та GSE середнє значення становило 5,2 мг/кг. Обидва ці значення суттєво відрізнялися від контрольної групи (p=0.002 і p=0.018 для групи, яка отримувала лише кадмій, і групи з кадмієм і GSE відповідно). Через 28 днів середнє значення в групі з додаванням кадмію зросло до 6,7 мг/кг, що суттєво відрізнялося від рівня кадмію в групі з додаванням кадмію та GSE, який трохи знизився до 4,8 мг/кг. (p=0.008).

На початку експерименту кадмій не виявленонирки(Рис. 1C) експериментальних тварин. Відповідно, кадмію вниркитварин контрольної та GSE груп під час експерименту. З іншого боку, через 14 днів середнє значення кадмію в групі з додаванням кадмію становило 9,5 мг/кг, а в групі з додаванням кадмію та GSE середнє значення становило 6,5 мг/кг. Обидва ці значення значно відрізнялися від контрольної групи (p < 0.001="" для="" обох="" груп).="" через="" 28="" днів="" середнє="" значення="" в="" групі="" з="" додаванням="" кадмію="" зросло="" до="" 16,6="" мг/кг,="" що="" суттєво="" відрізнялося="" від="" рівня="" кадмію="" в="" групі="" з="" додаванням="" кадмію="" та="" gse,="" який="" лише="" незначно="" зріс="" до="" 10,4="" мг/кг.="" кг="" (p="0.009)." таким="" чином,="">ниркиа в печінці вміст Cd був значно знижений при введенні GSE. GSE містить фенольні сполуки, які можуть хелатувати Cd, таким чином зменшуючи накопичення Cd. Утворення цих хелатів, ймовірно, призвело до зниження здатності білків зв’язувати Cd, який, таким чином, міг бути більш ефективно виведений з організму [18].

2.2.2. Визначення вмісту креатиніну та сечовини

Стосовно накопичення кадмію внирки,ниркає одним із найважливіших органів-мішеней для індукованої Cd токсичності. Томуниркау плазмі визначали маркери креатинін і сечовина. Визначення креатиніну є хорошим показником клубочкової фільтрації і використовується в основному для моніторингу перебігухвороба печінки. Зв'язок між концентрацією креатиніну і клубочкової фільтрацією є гіперболічним; у міру зниження клубочкової фільтрації секреція креатиніну також знижується [19]. Підвищене споживання важкого металу кадмію призводить доураження нирокі, отже, знижує ефективність секреції креатиніну. Як наслідок, підвищений рівень креатиніну в крові свідчить про aнирковийрозлад [20].

У нашому дослідженні рівень креатиніну підвищувався за допомогою Cd, відповідно до раніше опублікованих результатів [21]. Середнє значення вмісту креатиніну (рис. 2А) у піддослідних тварин на початку експерименту становило 3.0 мг/л. У групі, яка отримувала кадмій, спостерігалося значне підвищення контрольованих значень до 5,1 мг/л (через 14 днів, p=0.015) і до 6,2 мг/л (через 28 днів, p < 0.001).="" у="" групі,="" для="" якої="" gse="" вводили="" разом="" з="" кадмієм,="" підвищення="" цього="" маркера="" було="" нижчим="" (4,2="" мг/л="" через="" 14="" днів="" і="" 5,5="" мг/л="" через="" 28="" днів)="" і="" статистично="" значущим="" лише="" через="" 28="" днів="" порівняно="" з="" контролем="" (="" р=""><0,001). таким="" чином,="" підвищення="" концентрації="" креатиніну="" сповільнювалося="" при="" одночасному="" введенні="" gse,="" що="" свідчить="" про="" зменшення="" токсичного="" ефекту,="" викликаного="" кадмієм.="" у="" групі,="" яка="" отримувала="" лише="" gse,="" були="" нормальні="">

Сечовина є кількісно найважливішим продуктом розпаду амінокислот і білків. Він утворюється в печінці з аміаку, що виділяється в результаті реакцій дезамінування під час обміну амінокислот. Виводиться з організму переважно шляхомниркишляхом клубочкової фільтрації та канальцевої резорбції [22]. У випадкузахворювання нирок, швидкість продукції сечовини перевищує швидкість її кліренсу, що призводить до підвищення рівня сечовини в крові. Крім того, кадмій пригнічує включення амінокислот у білки, викликаючи уремію [21]. З іншого боку, при порушенні функції печінки знижується синтез сечовини, а отже, і її концентрація в плазмі [20]. Таким чином, концентрація сечовини в крові залежить від вмісту в їжі білка,нирковийвиділення та метаболічну функцію печінки.

У нашому дослідженні рівень сечовини був підвищений за допомогою Cd відповідно до раніше опублікованих результатів [21]. Середнє значення вмісту сечовини (рис. 2Б) у піддослідних тварин на початку досліду становило 207 мг/л. У групі, яка отримувала кадмій, спостерігалося значне підвищення контрольованих значень до 329 мг/л (через 14 днів) і 425 мг/л (через 28 днів). У групі, для якої GSE вводили разом з кадмієм, підвищення цього маркера було лише трохи нижчим — 325 мг/л через 14 днів і 381 мг/л через 28 днів. Обидві групи, які отримували лише кадмій та кадмій разом із GSE, суттєво відрізнялися від контрольної групи через 14 (p=0.001 та p=0.002 відповідно) та 28 днів експерименту (p < 0.001).="" для="" обох).="" у="" групі,="" яка="" отримувала="" лише="" gse,="" були="" виявлені="" нормальні="">

2.2.3. Визначення антиоксидантної активності плазми

Кадмій викликає низку ефектів, пов'язаних головним чином з окисним стресом. Оскільки Cd не є редокс-активним, він не генерує активні форми кисню безпосередньо. Тим не менш, про їх виробництво після впливу кадмію повідомлялося в багатьох дослідженнях і було розглянуто Cuypers et al. [23]. Механізми, що призводять до окислювально-відновних порушень під час впливу Cd, включають виснаження відновленого глутатіону, спричинене спорідненістю Cd до тіолових груп, заміну Fe на Cd у білках, що призводить до підвищення концентрації окисно-відновного вільного Fe, мітохондріальну дисфункцію та індукцію НАДФН-оксидази, які каталізують утворення супероксидних радикалів [23]. Під час окислювального стресу антиоксидантні сполуки, такі як феноли, можуть припинити виробництво нових реакційноздатних видів шляхом їх перетворення в стабільні радикальні форми. Таким чином, рослинні екстракти, багаті фенолами, можуть забезпечувати захисну дію проти Cd або Cd-вмісних сполук [24].

У цьому дослідженні середнє значення антиоксидантної активності плазми (рис. 3) у піддослідних тварин на початку експерименту становило 0,71 мг/л. Незначне підвищення спостерігалося в усіх дослідних групах порівняно з контрольною групою. Однак єдиною значущою різницею була різниця між групою, що отримувала GSE, і контрольною групою через 28 днів (p=0.012), що підтверджувало позитивний вплив GSE на антиоксидантну активність плазми. Повідомлені раніше результати неоднозначні; іноді було виявлено підвищення антиоксидантного потенціалу плазми, спричинене GSE [25], а іноді ні [14].

2.2.4. Визначення активності АЛТ і АСТ

Окислювальний стрес пов’язаний із втратою функціональної цілісності мембранної архітектури, спричиненою підвищеним перекисним окисленням ліпідів. У свою чергу, підвищена проникність цитоплазматичної мембрани призводить до витоку печінкових ферментів-маркерів (АЛТ і АСТ) у кров [14]. Дійсно, АЛТ і АСТ є діагностично значущими навіть при обмеженому ураженні печінки внаслідок інтоксикації, і про їх підвищення в сироватці крові, спричинене кадмієм, повідомлялося раніше [14] і було підтверджено цим дослідженням. Середнє значення активності АЛТ (рис. 4А) у піддослідних тварин на початку експерименту становило 0,84 мккат/л. У групі, яка отримувала кадмій, було зареєстровано значне збільшення контрольованих значень до середнього 1,52 мккат/л через 14 днів (p < 0.001)="" і="" 1,87="" мккат/л="" через="" 28="" днів="" (p="" {{="" 13}}.004).="" у="" групі,="" для="" якої="" gse="" вводили="" разом="" з="" кадмієм,="" підвищення="" цього="" маркера="" було="" значно="" повільніше,="" ніж="" у="" групі,="" яка="" отримувала="" лише="" кадмій="" (1,23="" мккат/л="" через="" 14="" днів="" і="" 1,92="" мккат/л="" через="" 28="" днів).="" після="" 14="" днів="" експерименту="" ця="" група="" відрізнялася="" як="" від="" контрольної="" групи="" (p="0.009)," так="" і="" від="" групи="" кадмію="" (p="0.026)," тоді="" як="" через="" 28="" днів="" вона="" значно="" відрізнялася="" лише="" з="" контрольної="" групи="" (p="0.003)." у="" групі,="" яка="" отримувала="" лише="" gse,="" значення="" також="" зросли="" до="" 1,17="" мккат/л="" через="" 14="" днів.="" це="" значення="" істотно="" відрізнялося="" від="" контрольної="" групи="" (p="0.024)" і="" було="" порівнянним="" зі="" значенням="" групи,="" яка="" отримувала="" як="" gse,="" так="" і="" кадмій.="" через="" 28="" днів="" значення="" групи="" лише="" gse="" нагадували="" контрольну="">

Середнє значення вмісту АСТ (рис. 4Б) у піддослідних тварин на початку експерименту становило 2,07 мккат/л. У групі, яка отримувала кадмій, статистично значуще збільшення спостережуваних значень було зафіксовано лише через 28 днів експерименту (3,52 мккат/л, p=0.001). Дивно, але в групі, для якої GSE вводили разом з кадмієм, підвищення цього маркера було швидшим і значно відрізнялося від контрольної групи як через 14 днів, так і через 28 днів (2,67 і 2,84 мккат/л, відповідно, p {{15 }}.043 для обох), хоча через 28 днів значення було трохи нижчим, ніж у групі, яка отримувала лише кадмій. Варіант лише з GSE мав нормальні значення.

У нашому експерименті введення GSE змогло уповільнити підвищення активності АЛТ. Цей ефект відповідає результатам, опублікованим раніше [14], і, можливо, спричинений поглинанням пероксидів ліпідів шляхом перенесення водню від фенольного з’єднання до пероксиду ліпідів, що містить вільні радикали. З іншого боку, у довгостроковій перспективі цей ефект був незначним. Підвищення активності АСТ, спричинене кадмієм, значно прискорювалося введенням ГСЕ. Однак у довгостроковій перспективі спостерігалося незначне зниження активності АСТ. Таким чином, GSE може частково компенсувати токсичну дію Cd на клітинні мембрани.

2.2.5. Визначення активності SOD і CAT в печінці

Окрім безпосередньої участі в окислювальних реакціях, кадмій пригнічує активність антиоксидантних ферментів, таких як СОД і КАТ, ферментів, здатних детоксикувати супероксидні радикали та пероксид водню відповідно [14]. СОД є ферментом, який ефективно гасить супероксидний радикал і перетворює його на менш токсичний пероксид водню, який може далі розкладатися каталазою або пероксидазою [26]. CAT - це фермент, який міститься майже в усіх живих організмах, які піддаються впливу кисню. Він діє як каталізатор розкладання перекису водню на воду та кисень [27]. Він має один із найвищих показників конверсії серед ферментів [28] і, будучи антиоксидантним ферментом, є одним із захисних механізмів, що веде до підтримки балансу в організмі людини [29]. Механізм індукованого Cd зниження активності ферментів, ймовірно, полягає в прямому зв’язуванні Cd з активними центрами ферментів [30].

У цьому дослідженні також спостерігалося зниження активності SOD і CAT. На початку експерименту середня активність ферменту СОД у печінці (рисунок 5А) піддослідних тварин становила 18,4 Од/мг білка. Через 14 днів експерименту активність СОД була значно вищою в групі, яка отримувала GSE (21,1 Од/мг), ніж в обох групах, які отримували кадмій (p < 0.001="" і="" p="" {{="" 9}}.009="" для="" груп,="" які="" отримували="" лише="" кадмій="" і="" кадмій="" з="" gse="" відповідно),="" але="" лише="" в="" групі,="" яка="" отримувала="" лише="" кадмій,="" активність="" сод="" була="" значно="" нижчою="" (16,7="" од/мг),="" ніж="" у="" контрольній="" групі="" (p="0" .005).="" через="" 28="" днів="" експерименту="" обидві="" групи,="" які="" отримували="" кадмій,="" суттєво="" відрізнялися="" від="" контрольної="" групи="" (16,4="" од/мг,="" р="0.002" та="" 17,6="" од/мг,="" р="0.023" для="" кадмію="" лише="" та="" кадмій="" з="" gse,="" відповідно)="" та="" група,="" яка="" отримувала="" лише="" gse="" (p=""><0,001 та="" p="0.005" лише="" для="" кадмію="" та="" кадмію="" з="" gse,="">

На початку експерименту середня активність ферменту CAT у печінці (рис. 5B) становила 32,7 ОД/мг білка. Після 14 днів експерименту активність CAT була значно вищою в групі, яка отримувала GSE (33,5 ОД/мг), ніж в обох групах, які отримували кадмій (p=0.002 і p=0.031 для тільки кадмій і кадмій з групами GSE, відповідно), але лише в групі, яка отримувала тільки кадмій, активність CAT була значно нижчою (23,8 Од/мг), ніж у контрольній групі (p=0.005). Однак через 28 днів активність CAT у групі, яка отримувала GSE разом з кадмієм, ще більше знизилася до 27,1 Од/мг, досягла значень групи, яка отримувала лише кадмій (25,8 Од/мг), і значно відрізнялася від контрольної групи (p { {21}}.033). Група, яка отримувала лише GSE, суттєво відрізнялася від обох груп кадмію (p=0.026 і p=0.012 лише для кадмію та кадмію з GSE відповідно). Цікаво, що зниження, викликане кадмієм, сповільнювалося спільним введенням GSE. Для CAT ці ефекти GSE спостерігалися раніше [14]. Хелатуючий ефект фенольних сполук, що містяться в GSE, ймовірно, зменшує здатність кадмію зв’язуватися з активним центром ферменту.

2.2.6. Визначення вмісту МП

Кадмій не піддається прямим метаболічним перетворенням, але в усіх тканинах він в основному зв’язаний з металотіонеїном (МТ). МТ належить до групи внутрішньоклітинних низькомолекулярних білків, багатих цистеїном, з молекулярною масою 6–10 кДа. Основна роль МТ в організмі включає підтримку гомеостазу цинку, детоксикацію важких металів і захист від окислювального стресу. Експресія МТ індукується багатьма екзогенними та ендогенними факторами, такими як УФ-випромінювання, важкі метали, гормони стресу, вільні радикали кисню, медіатори запалення, інфекції, травми та онкогенезу [31,32]. МТ значною мірою синтезується в печінці іниркаі виділяється в кров. Незважаючи на те, що МТ відповідає за накопичення кадмію в тканинах шляхом зниження його виведення, МТ захищає від гострої та хронічної токсичності, спричиненої Cd [33]. У нашому дослідженні вміст МТ контролювали в крові, печінці танирка.

Середнє значення вмісту МТ у крові (рис. 6А) піддослідних тварин на початку досліду становило 23,9 нмоль/г. Через 14 днів зміни були мінімальними, а через 28 днів спостерігалася велика варіабельність між повторами, що спричиняло статистичну непереконливість (p=0,948). Середнє значення вмісту МТ длянирки(Рисунок 6В) піддослідних тварин на початку експерименту становила 21,46 нмоль/г. Значення істотно не змінилися в жодній експериментальній групі протягом експерименту (p=0.938). Середнє значення вмісту МТ у печінці (рис. 6В) піддослідних тварин на початку досліду становило 17,15 нмоль/г. Через 14 днів вміст МТ дещо підвищився в усіх експериментальних групах, а відмінності від контрольної групи були достовірними для групи, яка отримувала лише Cd, і групи, яка отримувала лише GSE (p=0.008 і p=0 .046 відповідно). Через 28 днів вміст МТ у групі GSE повернувся до значення контрольної групи, тоді як вміст МТ у групі Cd залишився підвищеним і відрізнявся як від контрольної, так і від групи GSE (p=0.046 і p=0.035 відповідно). У групі, яка отримувала GSE разом з кадмієм, вміст МТ суттєво не відрізнявся від контролю, що було узгоджено з нижчим вмістом кадмію в печінці цієї групи, порівняно з групою, яка отримувала лише Cd (різниця була значною після 28 днів експерименту).

Загалом статистично значущі зміни вмісту МТ, викликані Cd, спостерігалися лише в печінці. Раніше повідомлялося про підвищення МТ в крові експериментальних тварин, які отримували кадмій [34]. У цьому випадку результати свідчать про те, що детоксикація Cd через МТ може відбуватися в печінці.

3. Матеріали та методи

3.1. Дизайн експериментуБурі щури роду Wistar (8 тижнів, 235 ± 3 г) були розділені на чотири групи по шість особин: А) контрольна група щурів, які дотримувалися звичайної дієти (n=6); B) група щурів, до раціону яких додали GSE (200 мг GSE/день) (n=6); C) групі, якій давали кадмій (2 мг Cd/день – конкретно CdCl2, розчинений у воді) (n=6); і D) групі, яка отримувала дієту, що містила кадмій (2 мг Cd/день), до якого додавали GSE (200 мг GSE/день) (n=6). Екстракт брали з насіння сорту виноградної лози Cerason; його приготування та характеристика описані в розділі 3.2. (Екстракт кісточок винограду). Екстракт зважували щодня в дозі 200 мг перед введенням піддослідним бурим щурам (200 мг GSE кожному щуру; 0,85 г/л кг маси тіла). GSE вводили з водою. Щурам досхочу давали вологі кормові суміші та нешкідливу (дитячу) воду. Один раз на тиждень тваринам міняли підстилку. Через 14 і 28 днів експерименту три тварини з кожної групи були піддані евтаназії, а їхня кров була зібрана за допомогою пункції серця. Перед забором призначали внутрішньочеревно препарат Фраксипарин (0,01 мл/кг), після чого тваринам вводили діетиловий ефір під інгаляційним наркозом. Потім відбирали зразок крові в покриті гепарином мікропробірки (або пробірки з ЕДТА — для аналізу МТ і кадмію; без подальшого центрифугування), після чого проводили обережне центрифугування (800 г/10 хв) і збирали кров. плазми для подальшого аналізу. Печінка і справаниркабули вилучені для подальшого аналізу. Дослідження проводилося відповідно до Гельсінської декларації, а протокол був схвалений Експертною комісією із забезпечення добробуту експериментальних тварин Університету Менделя в Брно (для проекту IGA-ZF/2016-AP011).

3.2. Екстракт кісточок винограду

Насіння виноградної лози (сорт Cerason—Merlot × Seibel 13 666) було відсортовано, очищено, висушено та подрібнено. Сортування відбувалося через вижимки на сепарувальній машині, де насіння відділялося від шкірки. Відокремлене таким чином насіння згодом промивають, порожні насіння видаляють, а насіння, що залишилося, очищають. Очищені та промиті насіння сушили в сушарці при 50 ◦С протягом 12 год. Після цього проводилося подрібнення насіння за допомогою лабораторного подрібнювача IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Штауфен-ім-Брайсгау, Німеччина). Подрібнене насіння екстрагували 75% етанолом протягом 120 год (22 ◦C, струшування при 50 об/хв; IKA KS 260 Basic, виробник: IKA Werke, Штауфен-ім-Брайсгау, Німеччина) у співвідношенні одна частина подрібненого насіння на десять частин. етанолу (м/м). Після цього екстракт поміщали в пробірки на 25 мл (Eppendorf, Гамбург, Німеччина) і центрифугували (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Вестфалія, Німеччина) при 4 ◦C і RCF 25,000×g. Центрифугований зразок брали з пробірки та переносили у вакуумну дистиляційну колбу (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Німеччина), де етанол випаровувався. Випаровування відбувалося у вакуумі при 90 ◦C, а екстракт переносили в чашки Петрі та ліофілізували у вакуумі при 53 ◦C (ліофілізатор Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, Чехія). Після приготування екстракт вводили піддослідним тваринам.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ІНФЕКЦІЮ НИРОК/НИРОК

3.3. Визначення антиоксидантної активності та загального вмісту поліфенолів

Для забезпечення об’єктивності результатів було використано чотири принципово різні методи визначення антиоксидантної активності. Зразки аналізували на автоматичному спектрофотометрі BS-400 (Mindray, Shenzen, Китай). Усі зразки аналізували в трьох повторах, отримане значення відповідало середньому значенню цих вимірювань. Ці аналізи проводили відповідно до Sochor et al. [35].

3.3.1. Визначення антиоксидантної активності методом ABTS

Розчин для визначення антиоксидантної активності методом ABTS готували шляхом змішування двох розчинів — розчину 1: 7 мМ розчину ABTS, отриманого шляхом зважування m=9,60 мг на 5 мл дистильованої води; і розчин 2: 4,95 мМ розчин персульфату калію, отриманий шляхом зважування m=1,67 мг на 5 мл дистильованої води. Отриманий розчин розбавляють дистильованою водою у співвідношенні 1:10 і залишають у темряві на холоді на 12 год. Потім 150 мкл реагенту R1 (7 мМ ABTS і 4,95 мМ персульфату калію) піпетували в пластикові кювети, потім додавали 3 мкл зразка та вимірювали на спектрофотометрі (λ=660 нм) протягом 12 хв. За калібрувальною кривою абсорбцію перераховували в еквівалентний вміст галової кислоти; антиоксидантну активність розраховували за калібрувальною кривою з використанням галової кислоти як стандарту (10–200 мг·л1), а результати виражали як еквіваленти галової кислоти.

3.3.2. Визначення антиоксидантної активності методом DPPH

Спочатку було зважено m {{0}},35 мг радикала DPPH. Цю кількість переносили в мірну колбу на 250 мл і доводили метанолом. Потім 150 мкл реагенту R1 (0,095 мМ DPPH) піпетували в пластикові кювети з подальшим додаванням 15 мкл зразка для вимірювання. Тест DPPH заснований на здатності стабільного вільного радикала 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразилу реагувати з донорами водню. DPPH демонструє сильне поглинання в спектрі ультрафіолетової видимої області (UV-VIS). Поглинання вимірювали протягом 12 хв при λ=505 нм. Відповідно до калібрувальної кривої оптичну густину перетворювали на еквівалентний вміст галової кислоти.

3.3.3. Визначення антиоксидантної активності за допомогою методу антиоксидантної потужності заліза

Три розчини використовували для визначення антиоксидантної активності за допомогою методу відновлення антиоксидантної сили заліза (FRAP)—(1) розчин TPTZ: 10 мМ TPTZ (m=78,02 мг), розчинений у 25 мл 40 мМ HCl; (2) Розчин FeCl3: 20 мМ FeCl3 (m=135,13 мг) розчиняють у 25 мл дистильованої води; і (3) ацетатний буферний розчин: 0,02 М ацетатний буфер, рН 3,6 (м=775 мг ацетату натрію, розчиненого в 250 мл дистильованої води, рН доводять оцтовою кислотою). Три розчини змішували у співвідношенні 1:1:10 (TPTZ:FeCl3:ацетатний буфер). Потім 150 мкл реагенту піпетували в пластикові кювети і додавали 3 мкл зразка. Поглинання вимірювали протягом 12 хв при λ=605 нм. Антиоксидантну активність розраховували за калібрувальною кривою з використанням галової кислоти як стандарту (10–200 мг·л1). Результати виражали як еквівалент галової кислоти.

3.3.4. Визначення антиоксидантної активності за допомогою вільнорадикального методу хлорофіліну

Загалом 200 мкл реагенту R1 (0,1 М HCl, екстракт хлорофілу, реакційний буфер, каталізатор) піпетували в пластикові кювети, а потім додавали 8 мкл зразка. Цей метод використовує здатність хлорофіліну (натрієво-мідної солі хлорофілу) приймати і віддавати електрони, стабільно змінюючи максимум поглинання. Цей процес обумовлений лужним середовищем і додаванням каталізатора. Поглинання вимірювали протягом 12 хв при λ=450 нм. Для розрахунку були використані останні вимірювані значення. Результати виражали як еквівалент галової кислоти.

3.3.5. Визначення загальної концентрації поліфенолів

Для визначення сумарних поліфенольних сполук використовували метод Фоліна–Чокальтеу. Усі зразки аналізували в трьох повторах, і отримане значення було отримано як середнє значення цих вимірювань. Зразок об’ємом 40 мкл вносили піпеткою в кювету (3 мл) і розбавляли 1960 мкл дистильованої води. Після цього в кювету додали 50 мкл реактиву Фоліна-Чокальтеу. Суміш ретельно збовтували і через 3 хв додавали 300 мкл 20% розчину декагідрату Na2CO3. Реакційну суміш струшували та інкубували при 22 ◦C протягом 120 хв. Після цього виміряли абсорбцію (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Єна, Німеччина) при λ=750 нм проти холостого зразка. Результати виражали як еквівалент галової кислоти.

3.4. Визначення антиоксидантів методом ВЕРХ

Визначення окремих антиоксидантних компонентів за допомогою високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометром. Аналіз зразків, використаних для оцінки флавоноїдів і проантоціанів, проводили в хроматографічній системі Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США), яка складається з наступні пристрої: резервуари для рухомої фази, дегазатор, бінарний насос, резервуар для зразків з автоматичним пробовідбірником та масовий детектор із Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Розділення зразків проводили на хроматографічних колонках Zorbax SB C18 з розмірами 50 × 2,1 мм і розміром частинок 2,7 мкм. Період аналізу завжди становив 6 хв. Швидкість газу-носія становила 0,6 мл·хв1. Органічний компонент рухомої фази був градієнтним метанолом (розчинник B), а водний компонент містив 0,05 М форміату амонію (розчинник A). Градієнт рухомої фази був таким: час 0 хв: 50 відсотків розчинника А і 50 відсотків розчинника В; час 2,5 хв: 100% розчинника А і 0% розчинника В; час 5 хв: 50% розчинника А та 50% розчинника В. Температуру термостата колонки встановили до 45 ◦C.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ БІЛЬ У НИРКАХ/НИРКАХ

3.5. Визначення окремих біохімічних маркерів

Біохімічні маркери в крові, плазмі, печінці таниркатварин спостерігали для визначення захисного ефекту GSE проти негативного впливу кадмію. Були проведені такі аналізи: (1) Аналіз плазми: загальна антиоксидантна активність плазми, креатинін, сечовина, АЛТ, АСТ. (2) Аналізи крові: МТ. (3) Аналізи печінки: СОД, КАТ, МТ. (4)ниркааналізи: МТ.

3.5.1. Визначення загальної антиоксидантної активності плазми,Креатинін, сечовина, АЛТ і АСТ Автоматичний біохімічний аналізатор BS{{0}} (Mindray, Shenzen, Китай) використовувався для аналізу загальної антиоксидантної активності плазми, креатиніну, сечовини, АЛТ і АСТ. Визначення загальної антиоксидантної активності плазми Для визначення антиоксидантної активності плазми використовували вільнорадикальний метод [35]. Цей метод використовує здатність хлорофіліну (натрієво-мідної солі хлорофілу) приймати і віддавати електрони, стабільно змінюючи максимум поглинання. Цей процес обумовлений лужним середовищем і додаванням каталізатора. Всього 200 мкл реагенту R1 (0,1 М HCl, екстракт хлорофіліну, реакційний буфер і каталізатор) піпетували в пластикові кювети, після чого додавали 8 мкл зразка. Поглинання вимірювали протягом 12 хв при λ=450 нм, і для розрахунку використовували останнє вимірюване значення. Антиоксидантну активність розраховували за калібрувальною кривою з використанням галової кислоти як стандарту, а результати виражали як еквівалент галової кислоти.

Визначення вмісту креатинінуПринцип методу полягає у фотометричному визначенні кольорового комплексу креатиніну з лужним пікратом, швидкість утворення якого пропорційна концентрації креатиніну в зразку. Для визначення креатиніну використовували діагностичний набір фірми Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Німеччина). Загалом 180 мкл реагенту R1 (0,16 мМ гідроксиду натрію) було внесено піпеткою в кювету, після чого додано 10 мкл зразка та 30 мкл реагенту R2 (4 мМ пікринової кислоти). Поглинання вимірювали протягом шести хвилин при λ=505 нм. Для розрахунку використовували значення абсорбції реагенту R1 із зразком і значення абсорбції після 6 хв інкубації з реагентом R2.

Визначення аланінамінотрансферазиДля визначення АЛТ використовували діагностичний набір фірми Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Німеччина). Спочатку 150 мкл реагенту R1 (100 мМ трис-буфера рН 7,5; 500 мМ L-аланіну, 1200 ОД/л лактатдегідрогенази) і 15 мкл зразка плазми автоматично піпетували в кювети. Потім автоматично піпетували 30 мкл реагенту R2 (15 мМ 2-оксоглутарату, 0,18 мМ NADH) і суміш інкубували протягом 5 хв. Поглинання вимірювали при λ=340 нм. Для розрахунку використовували значення абсорбції реагенту R1 із зразком і значення абсорбції після 5 хв інкубації із зразком. Результат перераховували відповідно до калібрувальної кривої в активність ферменту в мккат/л.

Визначення аспартатамінотрансферазиДля визначення АСТ використовували діагностичний набір фірми Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Німеччина). Спочатку 150 мкл реагенту R1 (80 мМ Трис-буфер рН 7,8, 240 мМ L-аспартат, 1200 ОД/л малатдегідрогенази) і 15 мкл зразка плазми експериментальних тварин автоматично піпетували в кювети. Згодом змішування та інкубацію проводили при 37 ◦C протягом 270 с. Потім автоматично піпетували 30 мкл реагенту R2 (15 мМ 2-оксоглутарату, 0,18 мМ NADH) і суміш інкубували протягом 5 хв. Поглинання вимірювали при λ=340 нм. Для розрахунку використовували значення абсорбції реагенту R1 із зразком і значення абсорбції після 5 хв інкубації із зразком. Результат перераховували відповідно до калібрувальної кривої в активність ферменту в мккат/л.

Визначення сечовиниДля визначення сечовини використовували наступну процедуру: 200 мкл реагенту R1 (трис-буфер рН 7,8, АДФ, уреаза та GLDH) і 200 мкл реагенту R2 (2-оксоглутарат, NADH) автоматично піпетували в кювети, потім зразок об’ємом 4 мкл, після чого суміш перемішували та інкубували при 37 ◦C протягом 30 с. Згодом було виміряно поглинання при λ=340 нм і ще через 60 с знову виміряно поглинання. Значення абсорбції через 30 с і ще через 60 с використовували для розрахунку. Значення віднімали одне від одного і результат перетворювали відповідно до калібрувальної кривої на вміст сечовини.

Визначення загальних білків біуретовим методомВизначення загальних білків біуретовим методом детально описано в іншій публікації [9]. Загалом 180 мкл біуретового реагенту (15 мМ тартрату натрію калію, 100 мМ NaI, 5 мМ KI і 5 мМ CuSO4) було внесено піпеткою в кювету, а потім 45 мкл зразка. Після десяти хвилин інкубації при 37 ◦C було виміряно поглинання при довжині хвилі λ=546 нм. Принциповим тут є реакція пептидного зв'язку з Cu (II) в лужному середовищі з утворенням синьо-фіолетового забарвлення. Для розрахунку використовували значення абсорбції лише реагенту та значення абсорбції після десяти хвилин інкубації із зразком.

3.5.2. Визначення супероксиддисмутази (SOD) і каталази (CAT) Визначення активності SODДля визначення активності SOD (SOD, EC 1.15.1.1) використовували комерційний набір (19160 SOD, Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина). Вимірювання проводили в пластиковій кюветі на автоматичному аналізаторі BS 400 (Mindray, Shenzen, Китай). Спочатку в кювету внесли 200 мкл реагенту R1 (20× розведений буферним розчином WST) і реагент інкубували при 37 ◦C протягом 108 с (1 хв, 48 с). Потім піпеткою відбирали 20 мкл зразка і через 378 с (6 хв, 18 с) реакцію починали додаванням 20 мкл реагенту R2 (розчин ферменту, розведений буфером 167×). Суміш інкубували протягом 72 с (1 хв, 12 с), а потім виміряли абсорбцію при λ=450 нм. Кінетику реакції вимірювали протягом 180 с (3 хв), а абсорбцію зчитували кожні дев’ять секунд. Прилад розрахував середнє збільшення поглинання за хвилину (∆A) та активність SOD виміряних зразків відповідно до рівняння калібрування. Результати виражали в Од/мл і згодом конвертували в мг білка.

3.5.3. Визначення вмісту металотіонеїнуВизначення концентрації металотіонеїну в крові, печінці таниркикоричневих щурів проводили за допомогою техніки адсорбційного перенесення (AdTS) з диференціальною імпульсною вольтамперометрією (DPV). Для аналізу було взято 200 мкл досліджуваної супернатанту та змішано з 1 800 мкл реагенту Brdiˇcka в мірній ємності, після чого було виконано саме електрохімічне визначення. Аналіз проводили згідно з раніше описаним протоколом [37]. Використано класичне трьохелектродне підключення. Робочим електродом був висячий ртутний краплинний електрод (HMDE) з площею краплі 0,4 мм2, тоді як електродом порівняння був Ag/AgCl/3 M KCl, а допоміжним був платиновий електрод. Базовий електроліт (1 ммоль·л1 [CO(NH3)6]Cl3 і 1 моль·л1 амонійного буфера; NH3(водн.) плюс NH4Cl, pH 9,6) змінювали для кожного вимірюваного зразка. Параметри DPV були такими: початковий потенціал 0.7 В, кінцевий потенціал 1,75 В, кипіння 5 с, час осадження 240 с, час модуляції 0.0 5 с, час інтервалу 0,25 с, крок потенціалу 0,00105 В, швидкість сканування 0,0042 В/с та амплітуда модуляції 0,02505 В. Визначення MT проводилося на вимірювальному пристрої, що складається з автосамплера 695, підключеного до вимірювального блоку VA Stand 693 і контрольованого. блоком керування TraceAnalyser потужністю 693 ВА (усі Metrohm, Herisau, Швейцарія). Вся вимірювальна система була охолоджена до 4 ◦C за допомогою Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Німеччина). Отримані вольтамперограмми були експортовані в програму VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, Швейцарія), і проаналізовані зразки були деоксигеновані шляхом активного барботування аргону з чистотою 99,999 відсотків.

3.5.4. Визначення вмісту кадмію в крові, печінці та нирках Розкладання проб  Мікрохвильовий екстрактор Ethos One (Milestone, Sorisole, Італія) використовували для розкладання печінки танирказразків, а мікрохвильовий екстрактор Multiwave 3000 (Anton Paar Graz, Австрія) використовувався для розкладання зразків крові. Мінералізацію проводили вологим способом з використанням 65% азотної кислоти (HNO3 supra pure) (Merck KGaA, Дармштадт, Німеччина) та 30% перекису водню (H2O2 supra pure) (Merck KGaA, Darmstadt, Німеччина) Всього 0,4 г печінка абонирказразок був зважений у серії тефллонових контейнерів і до зразка додано 5 мл 65% HNO3, 3 мл 30% H2O2 і 2 мл Milli Q H2O. Контейнери закривали і прилад запускали відповідно до інструкцій виробника. Мікрохвильовий розклад тривав 40 хв при 210 ◦C. Згодом зразки охолоджували протягом 45 хв і зберігали при 4 ◦C у поліетиленових контейнерах. Загалом 0,01 г зразка крові було зважено в серію скляних контейнерів, і до зразка було додано 300 мкл 65% HNO3 і 200 мкл 30% H2O2. Контейнери закривали і прилад запускали відповідно до інструкцій виробника. Мікрохвильовий розклад тривав 40 хв за температури 140 ◦C. Згодом зразки охолоджували протягом 45 хв і зберігали при 4 ◦C до визначення за допомогою ААС.

Визначення кадмію методом атомно-абсорбційної спектрометріїКадмій визначали на приладі Agilent 280/240 Series AA Systems (Agilent Technologies). Печінка інирказразки аналізували в полум’ї ацетилен-повітря (Fa AAS), а зразки крові – електротермічним розпиленням (ETA AAS) при довжині хвилі 228,8 нм. Калібрувальну серію з концентраціями 0–20 мкг·л для аналізів на ETA AAS і 0–10 мг·л1 для Fa AAS було підготовлено зі стандартного розчину кадмію (Analytika Praha, Прага, Чехія), з концентрацією 1.000 ± 0,002 г·л1. Далі проводилося вимірювання калібрувальних серій розчинів і побудова калібрувальних кривих, після чого мінералізація крові, печінки танирказразки були виміряні.

3.6. Статистичний аналізУсі вимірювання проводили в трьох повторах. Викидні значення були визначені за допомогою тесту Граббса та виключені (загалом було виявлено два викидні значення). Перед статистичним аналізом дані були перетворені шляхом логарифмічного перетворення та проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (кожна точка часу окремо) за допомогою тесту Tukey HSD post-hoc. Поріг статистичної значущості було встановлено як p <>

4. Висновки

Нещодавно спостерігається фармацевтична та економічна тенденція пошуку нових ліків серед вторинних метаболітів рослин, які є речовинами, які можуть допомогти захистити від низки захворювань. Завдяки важливим біологічно активним компонентам, які містять у своїй матриці насіння виноградної лози, їх можна (і вже використовують) використовувати в медичних цілях. Відомо, що екстракти виноградних кісточок захищають тканини від ушкодження, пов’язаного з окислювальним стресом, викликаного токсичним важким металом кадмієм. Ймовірно, на цей захист впливає фенольний склад використаних виноградних кісточок. У цьому дослідженні екстракт виноградних кісточок, отриманий з напівстійкого сорту Cerason з досить високим вмістом фенолу, перевірявся на захисну дію проти змін, спричинених кадмієм. Досліджуваний GSE зміг підвищити антиоксидантну активність плазми при введенні окремо та знизити вміст кадмію в печінці таниркищурів при спільному введенні. Відповідно підвищується печінковий маркерний фермент АЛТ іниркамаркер креатинін, викликаний кадмієм, сповільнювався GSE. Крім того, зниження активності антиоксидантних ферментів SOD і CAT, викликане кадмієм, було уповільнено при одночасному застосуванні GSE. Ці результати показують, що GSE є потужним захисним агентом від впливу важких металів.