Екстракція, фізико-хімічні властивості, антистаріння та антиоксидантна активність полісахаридів із залишків промислової коноплі. Частина 1
Jul 10, 2023
Анотація: Велика кількість полісахаридів коноплі залишається в залишках промислової коноплі (IHR) після екстракції каннабідіолу, що призводить до марної витрати ресурсів. Таким чином, систематичне вивчення полісахаридів коноплі є корисним для розвитку IHR у майбутньому. У цьому дослідженні екстракцію полісахаридів залишків промислової коноплі (IHRP) було оптимізовано за допомогою однофакторного експерименту та ортогонального плану експерименту. Оптимальними умовами екстракції при нагріванні були температура екстракції 98 ◦C, співвідношення тверда речовина–рідина 1:10, час екстракції 1 год, кількість послідовних екстракцій при 2 і pH при 4. Ступінь екстракції та вміст полісахаридів були 20.12 ± 0,55 відсотка та 12,35 ± 0,26 відсотка за умов відповідно. Крім того, найкращими умовами осадження спирту були відкачування зі швидкістю 2 л/год, безперервне перемішування та лазня з крижаною водою протягом 4 годин. Неочищені IHRP додатково очищали за допомогою колонкової хроматографії, і вміст полісахаридів/білка в очищених IHRP становив 34,44% і 1,61%. IHRP в основному складалися з десяти моносахаридів і деяких нецукрових компонентів, включаючи органічні кислоти, флавоноїди, стероїди та глікозиди. FT-IR продемонстрував полісахаридний скелет IHRP. Крім того, показники поглинання DPPH і ABTS IHRPs становили 76.00 відсотків і 99,05 відсотків при концентраціях 1 мг/мл. IHRP можуть сприяти проліферації епідермальних клітин і загоєнню клітинних подряпин. Тим часом IHRPs можуть сприяти експресії генів, пов'язаних із старінням. Загалом, IHRPs можуть бути бажаним природним джерелом антиоксидантів і продуктів проти старіння в багатьох аспектах.
Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають сильну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанхе має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і може поглинати активні форми кисню, запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.
Натисніть на переваги rou cong rong
【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Ключові слова: промислові коноплі; полісахарид; видобуток; антиоксидантна активність; антивікова активність
1. Введення
Коноплі (Cannabis sativa L.), однорічна трав’яниста рослина сімейства коноплевих, використовувалися протягом тисячоліть [1]. Вміст тетрагідроканабінолу (ТГК) у промисловій коноплі становить менше ніж 0,3 масових відсотка, що відрізняється від медичної та рекреаційної марихуани [2,3]. Тому промислові коноплі можна було легально вирощувати у великих масштабах. Хімічний склад технічної коноплі дуже складний, включає канабіноїди, терпеноїди, алкалоїди та флавоноїди [4]. Найбільш біологічно активними сполуками є канабіноїди, до складу яких входить понад 130 терпенових фенольних сполук, які переважно накопичуються у верхівках квітів [5]. Основними каннабіноїдами є THC, канабідіол (CBD), канабінол (CBN), канабігерол (CBG), канабідіварін (CBDV), канабідіол (CBT) і канабіциклол (CBL) [6]. Серед них THC, психоактивна сполука, заборонена в різних країнах, і CBD є найбільш вивченими канабіноїдами за їхню значну біоактивність [7], таку як нейропротекторна, протиепілептична, протипухлинна та імунорегуляторна активність [8]. Наявність цих сполук підвищує важливість промислових конопель. В даний час промислові коноплі широко використовуються в галузі побутової хімії, матеріалів, енергетики та медицини [9]. Сучасна обробка залишків промислових конопель (IHR) полягає в їх прямому викиданні, що не тільки забруднює навколишнє середовище, але й спричиняє марну витрату ресурсів [10].
Полісахарид – це полімер, який складається більш ніж з 10 моносахаридів [11]. Це одна з найважливіших біологічних макромолекул. В останні роки в багатьох статтях повідомлялося, що природні полісахариди з рослин мають хорошу біологічну активність, включаючи протиракову [12], протизапальну [13], антиоксидантну [14], імуномодулюючу [15], гіпоглікемічну [16] та противірусну дію. [17]. Молекулярний склад і просторова структура полісахаридів, як правило, істотно впливають на їхні властивості та активність [18]. З розвитком технології розділення, очищення та структурного аналізу полісахаридів загальновизнано, що полісахариди мають велике застосування в медицині, косметиці та харчових продуктах [19]. Вміст полісахаридів із залишків технічної коноплі становить приблизно 10–15 відсотків. Конопляні полісахариди мають багато чудових фізико-хімічних властивостей, оскільки вони містять багато гідрофільних гідроксилів, таких як сильна водопоглинаюча здатність, емульгуючі властивості та хороша плівкоутворююча здатність. Водночас полісахариди коноплі мають вологовтримувальну, антибактеріальну та нетоксичну дію. Тому вони мають широкі перспективи застосування в косметичній сфері. Продукти ферментації полісахаридів конопель (олігосахаридів або деяких цукрових спиртів), які, як повідомляється, мають хорошу антиоксидантну дію, діють проти старіння та втоми, використовувалися для розробки функціональних напоїв [20]. Склад полісахаридів коноплі відносно складний і коливається від моносахаридів до полісахаридів 5 × 104 Да.
Є кілька повідомлень про розділення та екстракцію полісахаридів коноплі. Hillestad та ін. виділив два глікопротеїни з коноплі. Структуру зв'язку глюкозидного ланцюга та зв'язок між ланцюгом і білком аналізували за допомогою метилювання та деградації за Смітом [21]. JW Groce та ін. виміряли вміст вуглеводів у коноплі, вирощеній у Сполучених Штатах, Таїланді та В’єтнамі відповідно. Було зазначено, що існують великі відмінності в типі та вмісті сполук між сортами з різних районів [22]. Чжен та ін. проаналізували моносахаридний склад і структуру HSP0 і HSP0.2, двох компонентів полісахариду насіння конопель, за допомогою ВЕРХ та ІЧ-Фур’є. Було виявлено, що HSP0 і HSP0.2 містять сульфатні радикали [23]. Бі та ін. отримано два полісахариди насіння конопель HS1 і HS2 методом гель-фільтраційної хроматографії. Основними моносахаридами були D-арабіноза, D-ксилоза, D-маноза, D-галактоза та D-глюкоза, а їх молярні співвідношення становили 0.12, 0.09 , 0.15, 0.11 і 0,12 відповідно [24]. Гуо та ін. підготував полісахариди з листя промислової коноплі та вивчив вплив ультрафіолетового світла, температури та pH на їхню антибактеріальну активність. Було встановлено, що мінімальна бактерицидна концентрація та мінімальна інгібуюча концентрація полісахаридів проти S. aureus становили 6,25 та 3,125 мг/мл відповідно. Крім того, антибактеріальна активність була найвищою при рН 7.
У цьому дослідженні IHR після екстракції каннабідіолу використовували як сировину для екстракції полісахаридів. Було оптимізовано процес екстракції та очищення залишкових полісахаридів промислових конопель (IHRP). Потім було проаналізовано структуру та склад IHRPs. Крім того, була оцінена здатність IHRP поглинати ABTS і DPPH. Його активність проти старіння також вивчалася на клітинному рівні. Є надія, що IHRPs можуть бути широко використані в косметиці та сферах функціонального харчування.
2. Результати та їх обговорення
2.1. Однофакторні експерименти екстракції для IHRP
2.1.1. Вплив методів екстракції на екстракцію полісахаридів
Вплив перколяційної екстракції, екстракції нагріванням та екстракції за допомогою ультразвуку на екстракцію полісахаридів показано на малюнку 1а. Можна було побачити, що вміст полісахаридів під час перколяційної екстракції був близьким до 0 відсотків, що вказувало на те, що полісахарид майже не екстрагувався, а екстракт в основному складався з пігменту та інших водорозчинних компонентів. Результати були отримані завдяки тому, що перколяційна екстракція була дуже м’якою, а клітинна стінка IHR не була порушена. Таким чином, полісахариди не могли бути вилучені з клітин, що призвело до дуже низького вмісту полісахаридів і коефіцієнта екстракції перколяційної екстракції. Коефіцієнт екстракції при нагріванні був вищим, ніж при екстракції за допомогою ультразвуку. Однак вміст полісахаридів при нагріванні екстракції (11,27 відсотка) був нижчим, ніж при екстракції за допомогою ультразвуку (13,81 відсотка). Екстракція нагріванням є одним із найбільш часто використовуваних методів екстракції через простоту процесу та низьку вартість. Однак час екстракції нагрівання є відносно довгим, а коефіцієнт екстракції невисокий. Температура екстракції, як правило, має великий вплив на коефіцієнт екстракції. Вищий коефіцієнт екстракції при нагріванні в цій роботі пояснюється тим, що екстракцію при нагріванні виконували при 98 ◦C, тоді як екстракцію за допомогою ультразвуку виконували при 60 ◦C. Екстракція за допомогою ультразвуку може скоротити час екстракції, оскільки ефект кавітації та механічний вплив можуть руйнувати клітинні стінки, покращувати проникнення розчинника та прискорювати перенесення полісахаридів у розчинник [25]. Таким чином, вміст полісахаридів при ультразвуковій екстракції був вищим, ніж при нагріванні. Для наступних експериментів було обрано нагрівання, враховуючи простоту процесу та індустріалізацію.
2.1.2. Вплив температури екстракції на екстракцію полісахаридів
Вплив температури екстракції на екстракцію полісахаридів показано на малюнку 1b, коли співвідношення тверда речовина–рідина становило 1:10, час екстракції становив 1 год, кількість послідовних екстракцій становила 2, а рН становив 7. Коефіцієнт екстракції та вміст полісахариду обидва збільшується з підвищенням температури. Коли температура становила 98 ◦C, найвищий коефіцієнт вилучення та вміст полісахаридів становили 14,99% і 12,03% відповідно.
2.1.3. Вплив співвідношення тверда речовина–рідина на екстракцію полісахаридів
Коли температура екстракції становила 98 ◦C, час екстракції становив 1 годину, кількість послідовних екстракцій становила 2, а pH становив 7, вплив співвідношення тверда речовина–рідина на екстракцію полісахаридів було показано на малюнку 1c. Коефіцієнт екстракції поступово збільшувався зі співвідношенням тверда речовина–рідина від 1:6 до 1:10, а потім став плавним. Однак на вміст полісахаридів майже не впливало співвідношення тверда речовина–рідина. Крім того, розчин міг просто занурити сировину, коли співвідношення тверда речовина–рідина було 1:5 через низьку щільність листя рослини. Тому в першу чергу вивчали співвідношення тверда речовина–рідина 1:6.
2.1.4. Вплив pH на екстракцію полісахаридів
Коли температура екстракції становила 98 ◦C, час екстракції становив 1 годину, кількість послідовних екстракцій становила 2, а співвідношення тверда речовина–рідина становило 1:10, вплив рН на екстракцію полісахаридів було показано на малюнку 1d. Коли розчин поступово підкислювався або підлужувався, коефіцієнт вилучення певною мірою покращувався. Однак вміст полісахаридів мав тенденцію до зменшення зі збільшенням рН, що вказувало на те, що кислий стан був сприятливим для екстракції IHRPs.
2.1.5. Вплив часу екстракції на екстракцію полісахаридів
Коли температура екстракції становила 98 ◦C, рН становив 7, кількість послідовних екстракцій становила 2, а співвідношення тверда речовина–рідина становило 1:10, вплив часу екстракції на екстракцію полісахаридів було показано на малюнку 1e. Коефіцієнт екстракції незначно знижувався, коли час екстракції перевищував 1 годину. Крім того, різний час екстракції майже не впливав на вміст полісахаридів.
2.1.6. Вплив кількості послідовних екстракцій на екстракцію полісахаридів
Коли температура екстракції становила 98 ◦C, час екстракції становив 1 годину, рН становив 7, а співвідношення тверда речовина–рідина становило 1:10, вплив кількох послідовних екстракцій на екстракцію полісахаридів було показано на малюнку 1f. Коефіцієнт вилучення впав до 5,11 відсотка, коли сировину було вилучено вдруге. Крім того, при третьому екстрагуванні сировини вміст полісахаридів був дуже низьким.
2.2. Ортогональний експериментальний план вилучення для IHRPs
It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>співвідношення тверда речовина–рідина > pH. Група 5 (співвідношення тверда речовина–рідина становила 1:8, кількість послідовних екстракцій становила 3, температура екстракції становила 80 ◦C, рН становив 4) мала найвищий вміст полісахаридів (12,79 відсотка), тоді як група 9 (співвідношення тверда речовина–рідина становила 1). :10, кількість послідовних екстракцій становила 2, температура екстракції становила 98 ◦C, а рН становив 4) мали другий найвищий вміст полісахаридів (12,26 відсотка). Враховуючи енергоспоживання та працездатність, було проведено перевірку порівняння між групами 5 та 9 для визначення найбільш відповідних умов екстракції. Як показано в таблиці 2, перевірені експерименти показали, що вміст полісахаридів у групах 5 і 9 був дуже близьким. Таким чином, щоб заощадити споживання енергії, умови екстракції групи 9 були обрані для екстракції IHRPs для її використання в наступних експериментах: співвідношення тверда речовина–рідина становило 1:10, температура екстракції становила 98 ◦C, кількість послідовних екстракцій становила 2, і pH був 4.
2.3. Екран умов осадження спирту IHRPs
Екстракційний розчин IHRPs був отриманий відповідно до умов екстракції, оптимізованих 2.2. Вплив різних умов осадження спирту було показано в таблиці 3. Порівняно з одноразовим додаванням і перемішуванням протягом 0,5 год, перекачування і безперервне перемішування може додатково підвищити вміст полісахаридів. Однак вплив швидкості охолодження на вміст полісахаридів не було очевидним. Тому для приготування IHRP були обрані умови осадження спирту групи 4.
2.4. Вихід полісахаридів і хімічний склад очищених IHRP
Неочищені IHRP були знебарвлені та очищені за допомогою адсорбції активованим вугіллям, мембранної фільтрації, колонкової хроматографії та методу севажу відповідно. Як показано на малюнку 2, обробка 8-відсотковою адсорбцією активованого вугілля мала найкращий ефект знебарвлення, а потім обробка колонковою хроматографією. Крім того, метод обшивки та мембранна фільтрація майже не мали знебарвлюючого ефекту. Враховуючи індустріалізацію та простоту процесу, колонкова хроматографія з аніонообмінною смолою була використана для очищення IHRPs у цьому рукописі. Крім того, як показано в таблиці 4, вага IHRP становила 15,26 г, коли очищення проводили після осадження спиртом, тоді як вага IHRP становила 12,74 г, коли очищення проводили безпосередньо після екстракції нагріванням. Однак фактична вага полісахариду двох процесів була дуже близькою (4,69 г і 4,38 г). Тому, щоб заощадити витрати, очищення колонковою хроматографією можна проводити безпосередньо після екстракції нагріванням.
2.5. FT-IR спектроскопія IHRPs
Деякі структурні характеристики полісахаридів можна зробити на основі характерних піків поглинання FT-IR [26]. Спектр FT-IR IHRP показаний на малюнку 3, і можна спостерігати типове поглинання полісахариду. Пік навколо 3378 см−1 був приписаний валентній вібрації -OH, що вказує на існування -OH [27]. Слабкий пік при 2932 см−1 був валентним коливанням CH, включаючи коливання -CH2 і -CH3 [28]. Сильний пік при приблизно 1600 см−1 був пов'язаний з валентними коливаннями -C=O [29], а пік близько 1413 см−1 був позначений для валентних коливань CO, що вказує на існування -COOH. Крім того, відносно сильний пік при 1080 см−1 дуже ймовірно відповідає згинальним коливанням OH. Спектр FT-IR IHRP показує багато характерних піків поглинання полісахаридів, демонструючи полісахаридний скелет IHRP.
2.6. Аналіз моносахаридного складу IHRP
Біоактивність полісахаридів часто пов'язана з моносахаридними композиціями. У цьому дослідженні моносахаридний склад IHRP був отриманий за допомогою іонної хроматографії, як показано на малюнку 4. Згідно зі стандартами моносахаридів, IHRP складалися з фукози, арабінози, рамнози, галактози, глюкози, ксилози, рибози, галактуронової кислоти, гулуронової кислоти, і глюкуронової кислоти. Їхні показники якості становили 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 і 2,37 відповідно. Можна було виявити, що арабіноза, рамноза, галактоза та глюкоза були основними моносахаридами в IHRP. Глюкоза була домінуючим моносахаридом у IHRPs, і результат узгоджувався з попереднім дослідженням [30]. Вміст уронової кислоти міг зробити полісахариди негативно зарядженими. Цей результат мав значний вплив на біоактивність полісахаридів [31]. Крім того, вміст полісахаридів у IHRP становив від 30 до 35 відсотків. Нецукровими компонентами були переважно органічні кислоти, флавоноїди, стероїди та глікозиди. Водночас вміст кожного нецукрового компонента був відносно низьким.
2.7. Дослідження антиоксидантної активності
Здатність ABTS і DPPH поглинати вільні радикали була широко вивчена для оцінки антиоксидантної активності полісахаридів [32]. Поглинальна здатність IHRP проти ABTS і DPPH відображена в таблиці 5. Як показано в таблиці 5, швидкість поглинання DPPH і ABTS збільшується зі збільшенням концентрації IHRP. Коли концентрація IHRP становила 1.0 мг/мл, швидкість очищення DPPH становила 76.00 відсотків, тоді як швидкість очищення ABTS становила 99.{{10}}5 відсотків . Після розрахунку значення EC50 для ABTS і DPPH були визначені як 0.34 і 0.47 мг/мл. Наскільки нам відомо, звітів про антиоксидантну активність IHRP немає. Досліджено антиоксидантну активність суцвіть 12 однодомних сортів Cannabis sativa L. [33]. Серед них ананас мав найсильнішу очисну здатність проти DPPH (EC50=60.00 мкг/мл), тоді як Kc-Virtus мав найсильнішу здатність поглинати ABTS (EC50=304.77 мкг/мл). мл). Що стосується антиоксидантної активності олії повного спектру каннабідіолу, було повідомлено, що її DPPH EC50 становила 158,0 мкг/мл [34]. Крім того, повідомляється, що DPPH EC50 CBD становить 0,937 мМ [35]. Також вивчалася здатність CBDV поглинати вільні радикали, тобто ABTS EC50 становила 406,3 мкМ, тоді як DPPH EC50 становила 3736 мкМ [36]. Наведені вище результати показали, що IHRPs показали високу антиоксидантну активність
【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
