Позаклітинний ацидоз обмежує одновуглецевий метаболізм і зберігає стовбурові Т-клітини

Накопичення кислих метаболічних відходів у мікрооточенні пухлини пригнічує ефекторні функції лімфоцитів, що роздувають пухлину (TIL). Однак залишається незрозумілим, як кисле середовище впливає на метаболізм і диференціювання Т-клітин. Тут ми показуємо, що тривалий вплив кислоти перепрограмує внутрішньоклітинний метаболізм Т-клітин і мітохондріальну придатність і зберігає стовбурові Т-клітини. Механічно підвищений позаклітинний ацидоз порушує поглинання та метаболізм метіоніну через зниження регуляції SLC7A5, таким чином змінюючи відкладення H3K27me3 на промоторах ключових генів стовбурових Т-клітин. Ці зміни сприяють підтримці стану "пам'яті, подібної до стовбура", і покращують довгострокову стійкість in vivo та протипухлинну ефективність у мишей. Наші висновки не тільки виявляють неочікувану здатність позаклітинного ацидозу підтримувати стовбурові властивості Т-клітин, але й покращують наше розуміння того, як метаболізм метіоніну впливає на стовбурові Т-клітини.

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Адоптивний перенос Т-клітин, специфічних для пухлинного антигену, є великим прогресом у галузі лікування раку, оскільки він призвів до повної регресії деяких злоякісних новоутворень. Його терапевтична ефективність значною мірою залежить від персистенції та статусу диференціювання перенесених Т-клітин1,2. Менш диференційовані Т-клітини пам’яті є кращою популяцією для адоптивного перенесення Т-клітин (ACT) через їхні властивості самовідновлення та мультипотентності, подібні до стовбурових клітин3,4. Дійсно, було показано, що використання стовбурових Т-клітин пам’яті для ACT досягає кращих протипухлинних відповідей5. У порівнянні з кінцево диференційованими ефекторними Т-клітинами, стовбурові Т-клітини демонструють чіткі ознаки6. Як людські, так і мишачі стовбурові Т-клітини характеризуються своєю експресією молекул, пов’язаних з антигеном, і молекул, пов’язаних з самонаведенням, включаючи високі рівні CD62L і CCR7 (посилання 7). Наше розуміння профілів транскрипції, епігенетичних модифікацій і метаболічних шляхів, які регулюють стовбурові Т-клітини, різко просунулося за останні роки8–10. Повідомлялося, що кілька факторів транскрипції, таких як TCF1, KLF2 і LEF1, відіграють важливу роль у керуванні або підтримці стовбурових Т-клітин9. Примітно, що TCF1 є ключовим фактором транскрипції, який сприяє утворенню довгоживучих Т-клітин пам’яті11. Під час хронічних інфекцій невелика частка TCF1+ стовбурових Т-клітин підтримує відповідь Т-клітин проти вторинної інфекції1,12. Епігенетичні зміни надають Т-клітинам засіб як ініціювати транскрипційні зміни, які лежать в основі набуття характеристик клітини пам’яті, так і підтримувати ці моделі транскрипційної експресії13. Численні дослідження показали, що триметилювання гістону H3 у K4 (H3K4me3), модифікації, пов’язаної з активацією, відбувається в локусах генів, пов’язаних із пам’яттю, включаючи TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 і SELL, під час диференціювання наивних CD{{47 }} Т-клітини в Т-клітини пам’яті, тоді як триметилювання H3 у K27 (H3K27me3), репресивна модифікація, втрачається в цих локусах 13–15. Навпаки, ефекторно-асоційовані гени (GZMB, PRF1, IFNG і TBX21) демонструють знижені репресивні та підвищені активаційні епігенетичні модифікації в цих локусах ефекторних Т-клітин13,16. Нарешті, накопичення рядів доказів свідчить про те, що метаболічні схеми диктують рішення щодо долі Т-клітин і формують їхні епігенетичні та функціональні стани17. Короткоживучі ефекторні Т-клітини мають високий рівень гліколізу та залежать від одновуглецевого метаболізму18,19, тоді як стовбурові Т-клітини пам’яті демонструють чіткі метаболічні профілі, що характеризуються підвищеним окисленням жирних кислот (FAO) і резервною дихальною здатністю мітохондрій (SRC), кардинальним характеристики, що беруть участь у довгостроковій стійкості20–22. Таким чином, метаболічне перепрограмування є важливим для ефективного набуття стовбурової форми та довгострокового виживання Т-клітин.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Імуносупресивне мікрооточення пухлини (TME), що характеризується низьким рН, гіпоксією, дефіцитом глюкози та збагаченням молочною кислотою, є ключовим бар’єром, що перешкоджає правильному розширенню, диференціації та функціональності Т-клітин23,24. Дійсно, метаболічний стрес, викликаний ТМЕ, погіршує ємність і придатність мітохондрій, викликаючи внутрішньопухлинну метаболічну недостатність і дисфункцію Т-клітин25–28. Цікаво, що більшість лімфоцитів, що інфільтрують пухлину (TIL), є дисфункціональними, але невелика частка має пам’ять, подібну до стебла, або властивості попередника7,29. Ця підгрупа TIL, схожа на стовбур, зберігає проліферативний потенціал і стійкість і пов’язана зі сприятливою відповіддю на блокування імунної контрольної точки (ICB) і TIL-ACT у людей з раком11,30. Попередні дослідження показали, що підвищений позаклітинний ацидоз (↑[H+ ]) пригнічує цитолітичну активність Т-клітин як in vitro, так і in vivo31–33. Крім того, кислий TME має значний вплив на активність і диференціацію мієлоїдних клітин, що інфільтрують пухлину, таких як дендритні клітини (DC) і асоційовані з пухлиною макрофаги (TAM)34–36. Однак вплив ↑[H+ ] на стовбурові Т-клітини та метаболічну придатність залишається в основному невідомим. Тут ми повідомляємо, що тривалий вплив in vitro ↑[H+ ] сприяє диференціації стовбурових CD8+ Т-клітин людини та миші за рахунок кінцевих ефекторних CD8+ Т-клітин. Ми виявили, що тривале лікування ↑[H+] змінює метаболізм Т-клітин і підтримує дихальну здатність мітохондрій. Крім того, постійний вплив ↑[H+] погіршує поглинання та метаболізм метіоніну, що згодом призводить до зменшення відкладення H3K27me3 генів, пов’язаних із пам’яттю, таким чином сприяючи підтримці статусу «стволової пам’яті». Нарешті, адоптивне перенесення Т-клітин, культивованих в ↑[H+]-умовах, демонструє потужну протипухлинну активність in vivo відповідно до їхнього менш виснаженого фенотипу. Таким чином, наше дослідження показує несподівану роль позаклітинного ацидозу в збереженні стовбурової Т-клітини через ремоделювання клітинного метаболізму та епігенетичних моделей.

Результати

↑Вплив [H+ ] сприяє формуванню стовбурових Т-клітин CD8+

Щоб визначити, чи впливає позаклітинний ↑[H+ ] на диференціацію стовбурових Т-клітин, ми провели проточний цитометричний аналіз ключових стовбурових фенотипів Т-клітин людини, культивованих протягом 12 днів у контрольному середовищі, ↑[H+] середовищі, що містить 10 мМ молочної кислоти. (імітуючи концентрацію лактату в патофізіологічних ситуаціях 23, 35) або кислому середовищі (~pH 6,6, соляною кислотою) (рис. 1a). Вищу частку стовбурових CD8+ Т-клітин, включаючи ранню пам’ять (CD45RO− CD27+ ) і центральну пам’ять (CD45RO+ CD27+), спостерігали в Т-клітинах, кондиціонованих у ↑ [H+] порівняно з контрольним середовищем (розширені дані, рис. 1а). Крім того, ми виявили, що Т-клітини, культивовані в середовищі ↑[H+], мали вищий відсоток стовбурових клітин (CCR7+ CD62L+) (рис. 1b). Варто відзначити, що ми помітили помітно підвищену експресію TCF1, ключовий фактор, що сприяє диференціації стовбурової та центральної пам’яті, на рівні білка як у людських, так і в мишачих CD8+ Т-клітинах, які зазнали впливу ↑[H+] (рис. 1c і Розширені дані рис. 1b). Крім того, спостерігався [H+]-залежний від концентрації вплив на експресію CCR7 і TCF1 (розширені дані, рис. 1c). Відповідно до стовбурового фенотипу ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітин, продукція внутрішньоклітинного інтерферону- (IFN-) і фактора некрозу пухлин (TNF-) була значно знижена в цих клітинах (рис. 1d).

Щоб краще дослідити статус диференціювання Т-клітин, ми провели аналіз секвенування РНК (RNA-seq) і виявили, що довгострокова експозиція in vitro ↑[H+] призвела до чіткого транскрипційного профілю (розширені дані, рис. 1d). Вплив ↑[H+] призвело до значного зниження експресії генів, що кодують ефекторні молекули, такі як PRF1, GZMB і IFNG, і ко-інгібіторний рецептор BTLA (рис. 1e,f і розширені дані, рис. 1e). Навпаки, ↑[H+]-культивовані Т-клітини продемонстрували більш високу експресію BACH2, CCR7, LEF1 і TCF7, які корелюють зі стовбуровими Т-клітинами (рис. 1e,f і розширені дані, рис. 1e). Аналіз збагачення набору генів (GSEA) показав, що транскрипційний патерн, індукований впливом ↑[H+], був подібний до Т-клітин пам’яті (рис. 1g і розширені дані, рис. 1f). Крім того, аналіз кількісної полімеразної ланцюгової реакції (qPCR) підтвердив підвищення експресії мРНК BACH2, KLF2, LEF1 і TCF7 після обробки ↑[H+] (рис. 1h). У сукупності ці спостереження підтверджують той факт, що лікування ↑[H+ ] значною мірою формує профілі транскрипції Т-клітин для встановлення стовбурової приналежності. Слід зазначити, що ми виявили, що лікування ↑[H+] пригнічувало проліферацію Т-клітин і спотворювало розподіл клітинного циклу в бік фази G1 і від S-фази (додаткова рис. 1a–c). Далі ми перевірили активацію Т-клітин після обробки ↑[H+ ] під час стимуляції TCR і виявили, що експозиція ↑[H+] не має суттєвого впливу на експресію маркерів активації Т-клітин або розмір клітин (додаткова рис. 2a,b). Крім того, ми додатково підтвердили, що вплив ↑[H+] після активації Т-клітин все ще може індукувати стовбуровий стан Т-клітин (додатковий рис. 2c–f). Ці висновки виключають можливість того, що Т-клітини, піддані впливу ↑[H+], просто стійкі до стимуляції, на відміну від прийняття стовбурового стану.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Попередні звіти показали, що кисле середовище різко пригнічує цитолітичну активність Т-клітин як in vitro, так і in vivo 23,31. Ми також виявили, що короткочасний вплив ↑[H+] погіршує вироблення цитокінів, але мало вплив на стовбуровий фенотип у Т-клітинах (розширені дані, рис. 1g–i та додаткові рис. 3a–c). Крім того, гальмівні ефекти виробництва цитокінів під впливом ↑[H+ ] є тимчасовими та оборотними, оскільки видалення ↑[H+ ] швидко відновлює вироблення цитокінів Т-клітинами (розширені дані, рис. 1h). Таким чином, інгібування ефекторної функції Т-клітин кислим середовищем відбувається дуже швидко, тоді як перепрограмування стовбурових Т-клітин вимагає тривалого впливу ↑[H+]. Оскільки лактат присутній у розчині або у своїй недисоційованій формі (молочна кислота), або у вигляді іонної солі (лактат натрію), ми потім намагалися визначити, чи виявляє лактат натрію подібний вплив на стовбурові Т-клітини, і виявили, що лактат натрію також сприяє виникненню ознак стеблування, хоча його ефективність була набагато нижчою, ніж при обробці молочною кислотою (10 мМ) (розширені дані, рис. 1j,k і додаткова рис. 4a–f). Ці результати вказують на важливість ↑[H+] і його відмінність від обробки іонами лактату в індукції стовбурового фенотипу CD8+ Т-клітин.

Рис. 1|↑Вплив [H+ ] полегшує диференціацію стовбурових CD8+ Т-клітин. a Схема активації Т-клітин людини в зазначених умовах: pH 7,4 (–↑[H+ ], контроль), pH 6,6 (+↑[H+ ], соляна кислота) або 10 мМ молочної кислоти (+↑[H+ ]). PBMCs, мононуклеарні клітини периферичної крові. b, Репрезентативні профілі експресії CCR7 та CD62L у CD8+ Т-клітинах людини за різних умов на 12-й день. n=3 незалежні зразки. c, Репрезентативні гістограми та кількісне визначення експресії TCF1 у CD8+ Т-клітинах людини за різних умов на 12-й день. n=3 незалежні зразки. MFI, середня інтенсивність флуоресценції. d, Т-клітини людини розмножували, як у a, протягом 12 днів і стимулювали форбол 12-міристат 13-ацетатом (PMA), що містить брефелдин A (BFA), протягом 4,5 годин. Внутрішньоклітинний профіль експресії IFN- і TNF- зображено для Т-клітин за умов pH 7,4 (ліворуч), 10 мМ молочної кислоти (посередині) або pH 6,6 (праворуч). n=3 незалежних зразків. e, f, РНК-seq аналіз Т-клітин людини, які були розмножені в контролі (pH 7,4) або молочною кислотою (10 мМ). Теплова карта вибраних генів (e) і графік вулкана всіх генів, у яких гени, пов’язані з пам’яттю, ефектором і виснаженими Т-клітинами, були помічені (f). На графіку вулкана вісь х представляє логарифмічні2-значення зміни кратності (FC) для клітин, оброблених молочною кислотою, порівняно з контролем на 12-й день, а вісь ординат представляє скориговані значення P. n=4 незалежних зразків. g, графік GSEA, що порівнює контроль з Т-клітинами, кондиціонованими молочною кислотою, для ефектора проти збагачення пам’яті. NES, нормалізований показник збагачення. h, кількісна експресія мРНК транскрипційних факторів, пов’язаних зі стовбуровою Т-клітиною (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) у Т-клітинах за вказаних умов. n=3 незалежних зразків. Дані представлені як середнє ± sem. Статистичний аналіз визначався за допомогою непарного двобічного t-критерію Стьюдента (b–d,h). Номінальні значення P і частоту помилкових виявлень (FDR) були розраховані за стандартним методом програмного забезпечення GSEA (g).

Підвищений [H+] запускає перепрограмування метаболізму

Крім окремих транскрипційних програм, стовбурові Т-клітини також переважно набувають унікальних метаболічних атрибутів, включаючи підвищений ФАО та обмежений гліколітичний метаболізм17,20,37. Щоб дослідити метаболічні особливості Т-клітин, які довгостроково зазнавали ↑[H+ ]-експозиції, ми провели аналіз збагачення генної онтології (GO) і виявили значні відмінності в експресії генів, пов’язаних з метаболічними шляхами, такими як метаболізм малих молекул і гліколіз (рис. 2а). Дійсно, довготривалі ↑[H+]-кондиціоновані Т-клітини демонстрували знижений гліколіз і метаболізм амінокислот на відміну від посиленого метаболізму довголанцюгових жирних кислот (розширені дані, рис. 2a,b). На відміну від тривалого впливу ↑[H+ ], короткочасне лікування ↑[H+ ] пригнічувало лише гліколіз, але не мало істотного впливу на FAO (додаткова рис. 5a). Кількісний ПЛР-аналіз додатково підтвердив, що гени гліколізу SLC2A1, SLC2A3 і LDHA були значно знижені в ↑[H+]-експонованих Т-клітинах (розширені дані, рис. 2c). І навпаки, кондиціонування ↑[H+] сприяло експресії карнітинпальмітоілтрансферази 1 (кодується CPT1A), ферменту, що обмежує швидкість, залученого до FAO (розширені дані, рис. 2c). Для подальшого з’ясування метаболічних змін, викликаних ↑[H+], ми провели об’єктивний метаболомічний аналіз і виявили 285 різних проміжних продуктів у Т-клітинах, культивованих з ↑[H+], порівняно з контрольними (розширені дані, рис. 2d). Зокрема, вплив ↑[H+] значно зменшив гліколітичні проміжні продукти та певні незамінні амінокислоти замість збільшення кількох видів карнітину, активованої форми жирних кислот, яка переноситься в мітохондрії для окислення (розширені дані, рис. 2e–g). Аналіз метаболічного потоку з використанням [13C6]глюкози або [13C16]пальмітату продемонстрував, що вплив ↑[H+ ] різко перешкоджає введенню [13C6]глюкози в проміжні продукти TCA та молочну кислоту, одночасно сприяючи введенню [13C16]пальмітату в ацетил-КоА та цитрат, підтверджуючи тезу що позаклітинний ацидоз пригнічує гліколіз і посилює ФАО в Т-клітинах (рис. 2b–e). Ці ↑[H+]-кондиціоновані Т-клітини демонструють обмеження щодо поглинання поживних речовин, про що свідчить зниження споживання [13C6]глюкози та поглинання аналогів ліпідів (BODIPY FL C16), результатом якого може бути підвищений електрохімічний градієнт (Розширені дані, рис. 2h, i).

Обмежене поглинання поживних речовин і перемикання клітинного метаболізму можуть призвести до змін сигнальних мереж у Т-клітинах. Аналіз збагачення GO Т-клітин, оброблених молочною кислотою, показав, що більшість уражених генів в основному залучені до передачі сигналів PI3K–AKT, mTOR і TCR (розширені дані, рис. 3a). Передача сигналів mTOR відіграє центральну роль в інтеграції імунних сигналів і метаболічних сигналів для належної активації Т-клітин, а інгібування сигналізації mTOR спонукає клітини до утворення CD8+ Т-клітин пам’яті замість ефекторної диференціації38–40. Наш аналіз GSEA показав, що активність передачі сигналів AKT–mTOR і NF-кB у ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітинах була знижена порівняно з такою в контрольних Т-клітинах (рис. 2f і розширені дані, рис. 3b). Це було додатково підтверджено зниженим фосфорилюванням S6 (на Ser235 і Ser236), 4EBP1 (на Thr37 і Thr46), AKT (на Ser473) і NF-кB (на Ser536) у ↑[H+]-кондиціонованих Т-клітинах (рис. 2g,h та розширені дані рис. 3c). Відомо, що mTOR є критично важливим регулятором різноманітних біологічних процесів, включаючи розмір клітини, виробництво енергії та синтез білка41. Дійсно, ми виявили, що розмір клітин ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітин був зменшений порівняно з розміром контрольних Т-клітин (розширені дані, рис. 3d). Далі ми оцінили залежний від біоенергії синтез білка в ↑[H+]-кондиціонованих Т-клітинах за допомогою SCENITH, нещодавно розробленого методу, який використовує включення пуроміцину як зчитування рівнів синтезу білка42. Як і очікувалося, вплив ↑[H+] пригнічував енергоємний синтез білка (рис. 2і), що свідчить про те, що енергетичний метаболізм у CD8+ Т-клітинах був змінений. Ці результати узгоджуються з попередніми висновками про те, що інгібування активності mTOR рапаміцином збільшувало експресію транскрипційних факторів, пов’язаних зі стеблом (розширені дані, рис. 3e,f). Взявши разом наші результати, ми робимо висновок, що тривалий вплив ↑[H+] керує метаболічним перемиканням і пригнічує активність mTOR, тим самим полегшуючи придбання та підтримку стовбурової Т-клітини.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

↑[H+]-опосередковане обмеження метаболізму метіоніну зберігає епігенетичну стовбурність

Накопичення доказів свідчить про те, що метаболізм одного вуглецю диктує рішення щодо долі Т-клітин і формує їхні функціональні стани43,44. Наш аналіз RNA-seq показав слабке збагачення одновуглецевого метаболічного процесу та сигнатури циклу метіоніну в Т-клітинах, які піддавалися тривалому, а не короткочасному лікуванню ↑[H+] (рис. 3a, розширені дані, рис. 4a, і додатковий рис. 5b). Відповідно, вплив ↑[H+] пригнічував експресію генів, що кодують ферменти, пов’язані з циклом метіоніну (MTR, AHCY і BHMT), а також метаболізм фолієвої кислоти (SHMT1 і SHMT2) (розширені дані, рис. 4b). Подальший метаболомічний аналіз показав, що Т-клітини, культивовані в молочній кислоті, показали помітне зниження внутрішньоклітинних метаболітів, залучених у цикл метіоніну, включаючи метіонін, S-аденозилметіонін (SAM) і S-аденозилгомоцистеїн (SAH), але підвищені рівні серину та гомоцистеїну (розширений Дані рис. 4в). Відстеження [13C5]метіоніну додатково підтвердило, що поглинання та вміст у клітинах метіоніну, міченого 13C внутрішньоклітинного SAM (m+5), SAH (m+4) та 5′-метилтіоаденозину (MTA, m +1) були значно знижені в ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах (рис. 3b–d і розширені дані, рис. 4d). Слід зазначити, що добавки екзогенного метіоніну відновили поглинання та внутрішньоклітинну кількість [13C5]метіоніну, а також відповідних проміжних продуктів у ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах (рис. 3c, d та розширені дані, рис. 4d), що свідчить про те, що екзогенний метіонін добавка може відновити поглинання метіоніну та метаболізм Т-клітин, які зазнали впливу ↑[H+]. Далі ми досліджували, чи може обмеження метіоніну викликати стовбурові Т-клітини. Ми виявили, що дефіцит метіоніну справді сприяв індукції популяції Т-клітин TCF1+ CD8+, але не вплинув на експресію CD62L і CD44 (розширені дані, рис. 4e,f). Для подальшого вивчення ролі метаболізму метіоніну в стовбурових Т-клітинах, індукованих ↑[H+], ми культивували Т-клітини в середовищі ↑[H+], доповненому метіоніном, SAM або SAH. Фенотип стовбурових Т-клітин, викликаний позаклітинним ацидозом, справді був частково заборонений додаванням метіоніну або SAM, але не SAH (рис. 3e та розширені дані, рис. 4g–i). Внутрішньоклітинний метіонін перетворюється на SAM, важливий донор метильної групи для реакцій метилювання ДНК і гістонів (розширені дані, рис. 5а). Таким чином, ми охарактеризували моделі метилювання гістонів і виявили, що підвищений [H+] значно знижує загальні рівні H3K27me3 в Т-клітинах, але не має значного впливу на експресію інших маркерів метилювання гістонів (рис. 3f і розширені дані, рис. 5b). Як і очікувалося, додавання метіоніну до Т-клітин під впливом ↑[H+] відновило загальний рівень експресії H3K27me3 (рис. 3f). Специфічне зниження рівня H3K27me3, що спостерігається в Т-клітинах, які пройшли тривале лікування ↑[H+ ], спонукало нас до гіпотези, що вплив ↑[H+ ] вибірково регулює метилтрансферазу, специфічну для відкладення H3K27me3. Дійсно, ми спостерігали значно знижену експресію EZH2, ключової метилтрансферази для H3K27me3, як на рівні мРНК, так і на рівні білка в ↑[H+]-експонованих Т-клітинах (розширені дані, рис. 5c,d). Крім того, пригнічення активності EZH2 високоспецифічним інгібітором GSK126 збільшило експресію TCF1, а також відсоток CCR7+ CD62L+ CD8+ Т-клітин (розширені дані, рис. 5e,f) , що відповідало попередньому звіту про те, що EZH2 може регулювати потенціал Т-клітин пам’яті за допомогою вибіркових епігенетичних модифікацій45. Щоб ідентифікувати загальногеномні зміни в епігенетичних моделях ↑[H+ ]-індукованої стовбурової Т-клітини, ми виконали аналіз CUT&Tag-seq і виявили мінімальні зміни в пропорційності відкладення H3K4me3 і H3K27me3 серед різних оброблених груп уздовж промотору, тіла гена та міжгенні області (розширені дані, рис. 5g). Зокрема, епігеномне профілювання виявило знижений рівень репресивного гістонового маркера H3K27me3 у локусах генів, пов’язаних із пам’яттю (наприклад, TCF7, CCR7, ID3, LEF1 та KLF2) у довгостроково оброблених ↑[H+] Т-клітинах (рис. 3g) . Важливо, що додавання метіоніну під впливом ↑[H+] частково відновило рівень H3K27me3 у вищевказаних локусах, а також експресію їх генів, що свідчить про важливу роль метіоніну в епігенетичній модуляції цих генів, пов’язаних з пам’яттю (рис. 3g і Розширені дані (рис. 5h). Згідно з попереднім дослідженням14, ефекторні гени, такі як PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 і NR4A2, сприятливо набули активуючої моделі метилювання гістонів (H3K4me3hi і H3K27me3lo) (рис. 3g). Варто відзначити, що зайнятість H3K4me3 в промоторних областях цих ефекторних генів була порушена в Т-клітинах, культивованих під впливом ↑[H+], і була відновлена ​​добавками метіоніну (рис. 3g). Загалом ці результати вказують на те, що опосередковане ↑[H+] порушення циклу метіоніну сприяє епігенетичному збереженню стовбурової Т-клітини.

Кілька транспортерів метіоніну (SLC), включаючи SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 і SLC43A2, можуть опосередковувати транспорт метіоніну46. Щоб дослідити, як вплив ↑[H+ ] знижує поглинання та метаболізм метіоніну в Т-клітинах, ми проаналізували моделі експресії окремих SLC і виявили, що ↑[H+ ] різко знижує експресію SLC7A5 та SLC38A2, але мало впливає на експресію SLC38A1 (розширений Дані рис. 6а,б). Крім того, вплив ↑[H+] знижує експресію та активність MYC (розширені дані, рис. 6c,d), який, як повідомляється, регулює експресію транспортерів метіоніну, таких як SLC7A5 (посилання 47). Крім того, ми продемонстрували високу зайнятість MYC на промоторі SLC7A5 і в меншій мірі на промоторі SLC38A2 (розширені дані, рис. 6e). Важливо, що значно знижене зв’язування MYC з цими локусами спостерігалося в Т-клітинах, які довгостроково отримували ↑[H+] (розширені дані, рис. 6e). Відповідно до цих спостережень, надмірна експресія MYC помітно відновила експресію SLC7A5 і SLC38A2 у ↑[H+]-експонованих Т-клітинах (розширені дані, рис. 6f). Ці результати підтверджують важливу роль MYC у зниженні експресії транспортерів метіоніну при впливі ↑[H+]. Цікаво, що ми виявили, що додавання метіоніну також може відновити експресію MYC і SLC7A5 у Т-клітинах, які зазнали ↑[H+] (розширені дані, рис. 6g), що свідчить про те, що додавання метіоніну може відновити здатність Т-клітин поглинати метіонін шляхом підвищення експресії транспортера метіоніну SLC7A5 залежно від MYC. Попереднє дослідження показало, що SLC7A5 є найбільш поширеним транспортером метіоніну в активованих Т-клітинах47. Це, разом з нашими попередніми висновками, свідчить про те, що SLC7A5 може відігравати важливу роль у ↑[H+]-індукованому обмеженні метіоніну та підтримці стовбурового стану. Дійсно, ми виявили, що надмірна експресія SLC7A5 частково порушує ↑[H+ ]-індукований стовбуровий фенотип (Розширені дані, рис. 6h, i), додатково підтверджуючи участь транспортера метіоніну SLC7A5 у ↑[H+ ]-індукованій Т-клітинній пам’яті -подібний фенотип. Аналізуючи різні субпопуляції Т-клітин CD8+, що інфільтрують пухлину, ми виявили знижену експресію як MYC, так і SLC7A5 у подібних до пам’яті CD8+ TIL (розширені дані, рис. 7a,b), що відповідає з нашими результатами in vitro. Таким чином, ці знахідки свідчать про те, що вісь MYC–SLC7A5–метіонін потенційно може сприяти збереженню статусу пам’яті TIL.

Рис. 2|Вплив ↑[H+] запускає метаболічне перепрограмування та пригнічує передачу сигналів mTOR. a, аналіз GO з використанням даних RNA-seq, що демонструє репрезентативні диференційовано експресовані метаболічні гени в контрольних і кондиціонованих молочною кислотою Т-клітинах людини (скориговане значення P < 4,23 × 10–2). b, Схема схем маркування [13C6]глюкози або [13C16]пальмітату. c, Відсоток зазначеного m+3 лактату від загального лактату або m+3 пірувату від загального пірувату в Т-клітинах. n=3 незалежних зразків. d, Відсоток ізотопомерів для проміжних продуктів TCA, таких як цитрат (m+2), малат (m+2) і сукцинат (m+2), отримані з [13C6]глюкози. n=3 незалежних зразків. e, відсоток зазначеного m+2 ацетил-КоА від загального ацетил-КоА або m+2 ізотопу цитрату від загального цитрату в Т-клітинах з [13C16]пальмітату. n=4 незалежних зразків. f, GSEA зі статистичним аналізом набору генів, пов’язаного з передачею сигналів mTORC1 у контролі, порівняно з Т-клітинами людини, кондиціонованими молочною кислотою (ліворуч) або pH 66-(праворуч). g,h, Проточний цитометричний аналіз і кількісне визначення S6, фосфорильованого за Ser235 і Ser236 (g), і 4EBP1, фосфорильованого за Thr37 і Thr46 (h) у CD8+ Т-клітинах людини за вказаних умов. n=3 незалежних зразків. I, Проточний цитометричний аналіз і кількісне визначення енергоємного синтезу білка в контрольних або кондиціонованих Т-клітинах людини з молочною кислотою чи pH 66-. n=3 незалежних зразків. Дані представлені як середнє значення ± sem. Статистичний аналіз визначався однобічним точним критерієм Фішера з тестом множинних порівнянь Бенджаміні–Хохберга (a) або непарним двобічним t-критерієм Стьюдента (c–e,g–i). Номінальні значення P і FDR були розраховані за стандартним методом у програмному забезпеченні GSEA (f).

Рис. 3|Підвищення [H+] змінює метаболізм метіоніну в Т-клітинах, щоб зберегти епігенетичну стовбурність. діаграма GSEA набору генів, пов’язаного з одновуглецевим метаболізмом і метаболізмом цистеїну та метіоніну в контролі проти Т-клітин людини, кондиціонованих молочною кислотою. b, Схема схем маркування [13C5]метіоніну. c, Відсоток внутрішньоклітинного SAM (m+5), SAH (m+4) і MTA (m+1), отриманих з [13C5]метіоніну, від їх відповідних загальних пулів, у Т-клітини, культивовані в контрольних умовах або з 10 мМ молочної кислоти або 10 мМ молочної кислоти з додаванням метіоніну (10 мМ + Met). n=3 незалежних зразків. d, Відносна кількість [12C5]метіоніну та [13C5]метіоніну в Т-клітинах. д, репрезентативна гістограма та кількісне визначення TCF1 у CD8+ Т-клітинах людини, культивованих у різних умовах. n=3 незалежних зразків. f, Вплив добавок метіоніну на метилювання гістону в Т-клітинах людини. H3K4me3, гістон H3 триметильований у K4; H3K79me2, H3 диметильований на K79; H3K27me3, H3 триметильований на K27; H3K9me2, H3 диметильований у K9. n=3 незалежних зразків. g, Відстеження генома репрезентативних генних локусів, що показує піки H3K27me3 (червоний, над лінією) або H3K4me3 (синій, під лінією). Дані CUT&Tag-seq взято з двох незалежних зразків. Дані представлені як середнє значення ± sem номінальних значень P і FDR були розраховані за стандартним методом програмного забезпечення GSEA (a). Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з тестом множинних порівнянь Тьюкі (c–f).

Вплив ↑[H+] підтримує придатність мітохондрій 

Враховуючи знижений енергоємний синтез білка в ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітинах, ми припустили, що тривалий вплив ↑[H+ ] може призвести до значних змін клітинного енергетичного метаболізму. Як контрольні, так і ↑[H+]-кондиціоновані Т-клітини аналізували за допомогою SCENITH42, щоб обчислити залежність від глюкози, мітохондріальну залежність, гліколітичну здатність, а також здатність до окислення FAO та амінокислот (рис. 4a та розширені дані, рис. 8a). Відповідно до нашої метаболоміки та результатів ізотопного відстеження, ми спостерігали посилення мітохондріального метаболізму в ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах, тоді як швидкість гліколізу була знижена (рис. 4b,c і розширені дані, рис. 8b), що вказує на перепрограмування внутрішньоклітинного енергетичний метаболізм у ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітинах. Аналіз морського коника також показав, що ↑[H+ ]-кондиціоновані Т-клітини демонструють вищу швидкість споживання кисню (OCR), а також SRC, основну особливість довгоживучих CD{20}} Т-клітин пам’яті22 та нижчу швидкість позаклітинного підкислення ( ECAR) (рис. 4d–h та розширені дані, рис. 8c–f). Оскільки збільшення мітохондріальної маси/злиття та зниження потенціалу мітохондріальної мембрани (Δψm) важливі для підтримки стовбурових Т-клітин48–50, ми додатково дослідили кількість і якість мітохондрій ↑[H+ ]-кондиціонованих Т-клітин і виявили, що ↑[H+ ] лікування збільшило мітохондріальну масу як у Т-клітинах людини, так і в миші (рис. 4i,j і розширені дані, рис. 8g,h), які також зберігають нижчий Δψm (рис. 4k і розширені дані, рис. 8i). Ультраструктурний аналіз за допомогою електронної мікроскопії (ЕМ) показав, що ↑[H+ ]-експоновані Т-клітини мали великі, щільно упаковані мітохондрії, дисперговані в цитоплазмі, і мали багато тісних, вузьких крист порівняно з контрольними Т-клітинами, що відповідає опублікованим результатам, пов’язаним з до морфології мітохондрій у Т-клітинах пам’яті (рис. 4l,m). Відповідно до цього висновку ми також спостерігали підвищену експресію генів кількох критичних регуляторів злиття мітохондрій у ↑[H+]-кондиціонованих Т-клітинах (Розширені дані, рис. 8j), які, як припускають, відіграють необхідну роль для генерації Т-клітин пам’яті50. Загалом ці результати вказують на те, що вплив ↑[H+] посилює мітохондріальну масу/злиття та здатність сприяти утворенню стовбурових Т-клітин.

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

↑Вплив [H+ ] посилює протипухлинну активність Т-клітин CD8+ 

Стовбурові Т-клітини сприяють приживленню, розширенню та протипухлинній ефективності в адоптивній імунотерапії51. Щоб дослідити, чи довгостроково in vitro ↑[H+ ]-підтримувані CD8+ Т-клітини демонструють посилене розширення або стійкість після перенесення, CD45.1+ OT-I Т-клітини, які були розмножені в контролі або ↑[ H+ ]-кондиціоноване середовище було адаптовано перенесено в мишей CD45.2+C57BL/6N без імплантованої пухлини (рис. 5а). Хоча дещо збільшена кількість апоптичних клітин була виявлена ​​під час кондиціонування ↑[H+ ] (Розширені дані, рис. 9а), був значно вищий відсоток Т-клітин у периферичній крові мишей, яких перенесли з Т-клітинами, розширеними в стані ↑[H+ ]. порівняно з тими, що розрослися в контрольному середовищі (контрольні Т-клітини) (рис. 5b). Подібним чином було виявлено значно вищі частоти Т-клітин у селезінці та лімфатичних вузлах (ЛВ) (Розширені дані, рис. 9b,c). Крім того, ми виявили значно підвищене накопичення Т-клітин у пухлинах, селезінці та дренуючих лімфатичних вузлах у мишей із пухлиною B16-OVA, у яких ↑[H+]-розширені клітини були адоптивно перенесені порівняно з мишами, які отримали контрольні клітини, що свідчить про те, що Т-клітини CD8+, які зберігаються в ↑[H+ ], мають покращену стійкість (рис. 5c–e та розширені дані, рис. 9d). Згідно з цими висновками, відсоток Т-клітин пам’яті був значно збільшений у селезінках і LN мишей, які отримували ↑[H+ ]-кондиціоновані Т-клітини (рис. 5f і розширені дані, рис. 9e). Примітно, що ↑[H+ ]-розширені OT-I Т-клітини продемонстрували значно сповільнений ріст пухлини порівняно з контрольними Т-клітинами (рис. 5g). Далі ми досліджували терапевтичну ефективність ↑[H+ ]-розширених Т-клітин, модифікованих рецептором химерного антигену CD19 (CAR) на моделі пухлини in vivo, в якій пухлинні клітини CD19-K562 вводили підшкірно в боки Миші NCG (рис. 5h). Ми виявили, що експозиція ↑[H+ ] також сприяє стовбуровій клітині CAR-T, але не впливає на апоптоз (Розширені дані, рис. 9f), про що свідчить значно підвищений відсоток CCR7+ CD62L+ стовбурових CAR-T клітин, а також підвищену експресію TCF1 (Розширені дані, рис. 9g,h). Крім того, спостерігався вищий рівень накопичення CAR-T-клітин у ділянках пухлини та селезінці мишей NCG після інфузії ↑[H+]-кондиціонованих Т-клітин (рис. 5i). Як і очікувалося, миші NCG, які були адаптовано перенесені з клітинами CAR-T, які були розмножені в ↑[H+ ], показали більший кліренс імплантованої пухлини CD19+ порівняно з тими, які отримали клітини CAR-T, які були розширені в контрольному середовищі (рис. 5j). У сукупності ці дані продемонстрували, що обробка ↑[H+] сприяє персистенції in vivo та протипухлинній активності Т-клітин.

Вплив ↑[H+] обмежує виснаження Т-клітин

Для подальшого вивчення впливу постійного впливу ↑[H+ ] на виснаження Т-клітин in vitro ми виміряли експресію LAG-3 і TIM-3 у ↑[H+]-праймованих Т-клітинах людини, які пройшли кілька раундів подальшої стимуляції антитілами до CD3 і кондиціонували в контрольному середовищі (рис. 6а). Ми виявили, що експресія LAG-3 і TIM-3 була знижена в ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах (рис. 6b і розширені дані на рис. 10a), що вказує на те, що лікування ↑[H+ ] призводить до зниження Виснаження Т-клітин. Крім того, ми виявили, що висока концентрація метіоніну призводить до збільшення експресії інгібіторних маркерів, таких як PD-1, LAG-3 і TIM-3, тоді як лікування з низьким вмістом концентрація метіоніну дещо знижувала експресію цих маркерів (додаткова рис. 6a–c). Примітно, що після тривалого впливу in vitro ↑[H+ ] частота TIM-3+ LAG-3+, що проникає в OT-I T-клітини та CD19-CAR T-клітини всередині пухлин, була значною зменшується після адоптивної передачі (рис. 6c–e та розширені дані, рис. 10b), що узгоджується з їх меншим виснаженням in vitro та покращеною здатністю контролю пухлини in vivo. Крім того, ми продемонстрували, що довгострокові ↑[H+]-кондиціоновані Т-клітини показали значно знижену експресію TOX як in vitro, так і in vivo (рис. 6f,g і розширені дані, рис. 10c,d). Як описано раніше, виснажені Т-клітини можна загалом розділити на підмножину виснажених прогеніторів або термінально виснажених, як визначено експресією TCF1 і TIM-352,53. Таким чином, ми виміряли модель експресії TCF1 і TIM-3 в CD45.1+ TIL і помітили, що частота TCF1− TIM-3+ остаточно виснажених Т-клітин була значно знижена, з значно збільшився відсоток TCF1+ TIM-3– прогениторних Т-клітин за умов ↑[H+] (рис. 6h). Крім того, ми продемонстрували збільшення популяції Т-клітин-попередників LY108+ TIM-3 (Розширені дані, рис. 10e), а також збільшення частоти IFN- + TNF- + T клітин (Розширені дані, рис. 10f), що ще більше підтверджує той факт, що довгострокові in vitro ↑[H+ ]-розширені адаптивно перенесені Т-клітини обмежують виснаження та зберігають стовбурові.

Обговорення

Пухлиноспецифічна ACT є багатообіцяючим підходом для лікування осіб з рефрактерними пухлинами, але терапевтичні ефекти значною мірою обмежені дисфункцією Т-клітин у TME. Останнім часом значна увага приділяється попередньому кондиціонуванню Т-клітин з тимчасовим голодуванням глюкози, обмеженням глютаміну або підвищеним позаклітинним калієм (↑[K+ ]) під час культивування in vitro, щоб зберегти стовбурові Т-клітини та покращити терапевтичні результати54–56. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що культивування Т-клітин CD8+ під високим рівнем [H+] під час праймування несподівано сприяло придбанню стовбурових Т-клітин і підвищенню стійкості до виснаження Т-клітин, значно покращуючи протипухлинні ефекти адоптивно перенесені Т-клітини.

Надмірне накопичення молочної кислоти в TME давно вважалося ключовим фактором імунного порятунку пухлини. Наприклад, було продемонстровано, що молочна кислота та кислий ТМЕ пригнічують цитолітичну активність CD{{0}} Т-клітин і продукцію цитокінів31–33,57. Згідно з цими висновками ми також виявили, що короткочасного впливу ↑[H+ ] in vitro було достатньо для глибокого пригнічення вироблення ефекторних цитокінів, але не вплинуло на експресію TCF1 або метаболічні особливості, пов’язані зі стеблом. Проте тривале лікування ↑[H+] несподівано сприяло експресії TCF1 і підтримувало фенотип стовбурових Т-клітин за допомогою метаболічного перепрограмування та епігенетичного ремоделювання. Вплив ↑[H+] на Т-клітини після їх повної активації також може індукувати фенотип, подібний до стовбура, таким чином виключаючи можливість того, що Т-клітини, піддані впливу низького рН, просто стали стійкими до стимуляції, а не прийняли стан, подібний до стовбура. Фізіологічна концентрація молочної кислоти в крові здорових людей становить приблизно 1,5–3,0 мМ, але вона може підвищуватися до 10–40 мМ у TME35,58. Використовуючи стійку модель стимуляції анти-CD3/CD28, Feng et al. нещодавно повідомили, що висока концентрація лактату натрію підвищує рівні H3K27ac у локусі суперенхансера TCF7 через інгібування активності гістондеацетилази, що призводить до посилення експресії TCF1 та стимулювання стовбурових клітин CD8+ Т-клітин59. Навпаки, ми виявили, що тривалий вплив відносно низької концентрації молочної кислоти (10 мМ), але не лактату натрію, може легко викликати стовбурові ознаки Т-клітин через обмеження метаболізму метіоніну та регуляцію H3K27me3 відкладення в локусах генів, асоційованих зі стеблом, що чітко підтримує чітку епігенетичну регуляцію лактатом натрію та молочною кислотою. Однак лікування низькою кислотністю (pH 6,9) не має значного впливу на експресію TCF1 за постійної стимуляції анти-CD3/CD28, що свідчить про те, що стовбурові ознаки CD8+ Т-клітин, індуковані ↑[H+] вплив може перекриватися стимуляцією TCR. Активація TCR може посилити поглинання метіоніну та перепрограмувати метаболізм метіоніну для сприяння активації Т-клітин19,60. Ми припустили, що стимуляція TCR може підсилити поглинання метіоніну в ↑[H+ ]-оброблених Т-клітинах, які мали обмежений метаболізм метіоніну, отже, порушуючи ↑[H+ ]-індуковану епігенетичну стовбурність. Крім того, Т-клітини можуть використовувати іони лактату як джерело позаклітинного вуглецю для сприяння набуттю стовбура за наявності або відсутності стійкої стимуляції TCR. Метаболічна активність тісно пов’язана з диференціюванням Т-клітин, і певні метаболічні втручання можуть значною мірою сприяти утворенню довгоживучих Т-клітин пам’яті21,37,61,62. Відповідно, наші метаболомічні та ізотопні аналізи підтверджують уявлення про те, що тривалий вплив ↑[H+ ] призводить до вражаючого метаболічного перепрограмування, такого як зниження поглинання глюкози та зниження гліколізу та метаболізму циклу TCA. Декілька досліджень показали, що CD8+ T-клітини пам’яті використовують FAO для задоволення своїх енергетичних потреб, хоча це, ймовірно, адаптація для диференціації лінії пам’яті, а надмірна експресія Cpt1 сприяє довговічності Т-клітин21,22,63,64. Однак у своїй моделі Т-клітинно-специфічної генетичної делеції Cpt1a Raud et al. нещодавно продемонстрували, що LC-FAO в основному необхідний для активації Т-клітин і формування CD8+ Т-клітин пам’яті65. Залишається проблемою пояснити таку невідповідність. У контексті нашого дослідження ми припускаємо, що перепрограмування метаболізму жирних кислот, викликане позаклітинним ацидозом, ймовірно, пов’язане з генерацією Т-клітин пам’яті, хоча точний механізм, що лежить в основі цієї гіпотези, потребує подальшого дослідження. Крім того, ми виявили, що вплив ↑[H+] пригнічує активність mTOR, яка може бути викликана гліколітичним інгібуванням. Примітно, що придушення сигналізації mTOR також може сприяти метаболічному переходу від гліколізу до мітохондріального дихання. Дійсно, ці ↑[H+]-розширені Т-клітини продемонстрували покращену мітохондріальну пристосованість, про що свідчить помітне збільшення SRC і мітохондріальної маси та зниження Δψm. Ці мітохондріальні сигнатури, які збагачені стовбуровими Т-клітинами і пов’язані з довголіттям і чудовою протипухлинною активністю in vivo, тісно модулюються мітохондріальним злиттям і динамікою поділу22,48,50. Злитий білок внутрішньої мембрани мітохондрій OPA1 відіграє незамінну роль у генерації Т-клітин пам’яті50. Відповідно, ми виявили, що позаклітинний ацидоз також сприяє експресії OPA1 в Т-клітинах, що в кінцевому підсумку призводить до морфологічної рівноваги в напрямку злиття в Т-клітинах. Було показано, що багато клітинних метаболітів безпосередньо сприяють епігенетичним модифікаціям. Наприклад, одновуглецевий метаболізм може генерувати універсальний донор метилу SAM для метилювання гістонів66.

Рис. 4|Фітнес мітохондрій підтримується в Т-клітинах, які піддаються впливу ↑[H+]. аналіз SCENITH Т-клітин людини в контрольних або кондиціонованих молочною кислотою Т-клітинах. Представлений рівень перекладу (анти-Puro) показано (n=3 незалежних зразків). Пунктирна лінія представляє фоновий рівень, отриманий після обробки 2-дезокси-d-глюкозою + олігоміцином (2-DG+O). b,c, Кількісний аналіз гліколітичної здатності (b) і мітохондріальної залежності (c) в межах a. n=3 незалежних зразків. d–f, OCR (d) контрольних і кондиціонованих молочною кислотою Т-клітин вимірювали в режимі реального часу в базальних умовах у відповідь на вказані інгібітори. FCCP, карбонілціанід-п-трифторметоксифенілгідразон; ROT/AA, ротенон і антиміцин А. Репрезентативний статистичний аналіз базального OCR (e), максимального дихання (e) і SRC (f). n=9 тести; Було проаналізовано 3 незалежні зразки, і кожен зразок вимірювався 3 рази. g,h, ECAR (g) контрольних або кондиціонованих молочною кислотою Т-клітин, виміряних у відповідь на вказані інгібітори. Репрезентативний статистичний аналіз базального ECAR і стресового ECAR (h). n=9 тести; Було виявлено 3 незалежні зразки, і кожен зразок вимірювали 3 рази. i, Імуноблот аналіз COXIV і TIM23 в Т-клітинах людини за вказаних умов. Актин використовували як контроль навантаження. j,k, репрезентативні гістограми або контурні графіки та статистичний аналіз мітохондріальної маси (MTG) (j) і мітохондріального мембранного потенціалу (TMRM) (k), відповідно, у контрольній або молочній кислоті, або pH 6.{{30} }кондиціонованих Т-клітин людини. n=3 незалежних зразків. l,m, репрезентативна мітохондріальна морфологія Т-клітин, культивованих у контрольних умовах, молочна кислота або умови pH 6,6 протягом 12 днів, проаналізована за допомогою ЕМ (масштабна шкала, 1 мкМ) (l). Площа окремих мітохондрій в Т-клітинах (m), n=45 клітин. Дані представлені як середнє ± sem. Статистичний аналіз проводили з використанням непарного двобічного t-критерію Стьюдента.

Рис. 5|↑[H+]-розширені Т-клітини демонструють підвищену протипухлинну активність. a,b. Контрольні або розширені молочною кислотою CD8+ Т-клітини аналізували на персистенцію після адаптивної передачі (n=6 мишей). Свіжоізольовані мишачі CD45.1+ Т-клітини OT-I активували мишачим IL-2 і антитілами до мишачого CD3 та антитіла до CD28 миші протягом 2 днів, а потім витримували в культуральному середовищі з миша IL-2 до прийомної передачі (CD3&CD28+IL-2). Схема експерименту на тваринах (a), а також репрезентативні графіки FACS і статистичний аналіз CD45.1+ і CD45.2+ Т-клітин у крові показані на (b). c–g, CD45.1+ Т-клітини OT-I розмножували в контрольному або молочнокислому середовищі протягом 7 днів і переносили в мишей із пухлиною B16-OVA, і оцінювали коефіцієнт інфільтрації (n=5 мишей). Схема експерименту на тваринах з використанням мишей із пухлиною B16-OVA (c), а також репрезентативні графіки FACS (ліворуч) і статистичні дані щодо кількості (праворуч) перенесеного CD45.1+ OT- I Т-клітини в пухлині (d). sc, підшкірна ін'єкція. Статистика для відсотка CD45.1+ Т-клітин (e) і репрезентативні дані (ліворуч) і статистика для відсотка (праворуч) CD62L+ CD44+ CD45.1+ Т-клітин (f ) в селезінці показані. Крива росту пухлини (g) (n=5 мишей, день 14). h–j, CD19-CAR Т-клітини розмножували в контрольному або молочнокислому середовищі протягом 12 днів і переносили в CD19-мишей NCG із надмірною експресією K562, що несуть пухлину, і коефіцієнт інфільтрації в пухлині та селезінці був оцінено (n=6 мишей). Показано схему експерименту на тваринах (h), репрезентативний відсоток перенесених Т-клітин у пухлину та селезінку (i) та криві росту пухлини (j) (n=6 мишей, день 10). Дані представлені як середнє ± sem. Статистичний аналіз проводили з використанням непарного двобічного t-критерію Стьюдента.

Рис. 6|↑Вплив [H+] обмежує виснаження Т-клітин. Схема хронічної стимуляції Т-клітин людини in vitro. b, репрезентативні графіки FACS для LAG-3 і TIM-3 у хронічно стимульованих Т-клітинах людини, культивованих у контрольних умовах або в умовах молочної кислоти. n=3 незалежних зразків. c, Експресія LAG-3 і TIM-3 у CD45.1+ TIL мишей C57BL/6N з пухлиною B16-OVA (n=5 мишей ). d, Кількісна оцінка експресії LAG-3, TIM-3 і PD-1 у CD45.1+ TIL з B16-OVA-пухлини C57BL/ 6N мишей (n=5 мишей). e, Експресія LAG-3 і TIM-3 в інфільтрованих пухлиною CD19-CAR Т-клітинах CD19-K562 мишей NCG із пухлиною, як визначено методом проточної цитометрії (n=6 мишей). f, Експресія TOX у CD45.1+ TIL мишей C57BL/6N з пухлиною B16-OVA (n=5 мишей). g, Гістограми та статистичний аналіз TOX у Т-клітинах CD19-CAR CD19-K562 із пухлиною NCG мишей (n=6 мишей). h, ліворуч, репрезентативні графіки проточної цитометрії для TIM-3 і TCF1 у CD45.1+ TIL від B16-OVA мишей C57BL/6N з пухлиною (n=5 мишей) . Правильно, відсоток популяції TCF1+ TIM-3– або TCF1– TIM-3+. Дані представлені як середнє ± sem. Статистичний аналіз проводили з використанням непарного двобічного t-критерію Стьюдента.

Повідомлялося, що такі метаболіти, як S-2-гідроксиглутарат і -гідроксибутират, функціонують як епігенетичні регулятори диференціювання Т-клітин пам’яті67,68. Наші результати показали, що постійне лікування ↑[H+] обмежує поглинання метіоніну та метаболізм метіоніну зі зниженням внутрішньоклітинного метіоніну, SAM та SAH через інгібування експресії транспортерів метіоніну. Ці результати можуть частково пояснити, чому Т-клітини не здатні випереджати пухлинні клітини за поглинання метіоніну в TME69. Механічно ми продемонстрували, що вплив ↑[H+] різко знижує експресію MYC та його зв’язування з промотором SLC7A5, що, як наслідок, призводить до зниження експресії SLC7A5 та порушення метаболізму метіоніну в Т-клітинах. Цікаво, що добавки метіоніну можуть відновити експресію MYC і SLC7A5, а також потік циклу метіоніну в ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах, що свідчить про те, що відновлення здатності поглинати метіонін, ймовірно, було пов’язане з регуляцією транспортера метіоніну. SLC7A5 залежно від MYC. Повідомлялося, що діяльність mTOR регулює переклад MYC70. Відповідно, ми припустили, що ↑[H+]-індуковане зниження регуляції MYC, ймовірно, пов’язане з трансляційною репресією через прогресуюче інгібування mTOR і порушення поглинання метіоніну. Таке придушення може бути скасовано екзогенним додаванням метіоніну, хоча точний механізм потребує подальшого вивчення. Вважається, що SAM, отриманий із циклу метіоніну, опосередковує метилювання гістону та епігенетичне ремоделювання під час диференціації ефекторних Т-клітин 8,71. Відповідно до зменшення внутрішньоклітинного SAM в ↑[H+ ]-розширених Т-клітинах, ми виявили, що загальна кількість H3K27me3 і його зайнятість на промоторі локусів стовбурових Т-клітин були значно знижені. H3K27me3 і H3K4me3 вибірково модифіковані таким чином, що корелює з експресією генів, центральних для ефекторної або стовбурової програми Т-клітин14. Дійсно, спостерігалося менше збагачення H3K4me3 в промоторах ефекторного гена в ↑[H+]-розширених Т-клітинах. Таким чином, знижені рівні SAM метилдонора внаслідок порушення поглинання та метаболізму метіоніну за умови ↑[H+] призводять до епігенетичних змін, які в кінцевому підсумку сприяють диференціації Т-клітин у стан пам’яті. Цікаво, що додавання метіоніну під впливом ↑[H+ ] не тільки рятує експресію MYC і SLC7A5 у ↑[H+ ]-експонованих Т-клітинах, але також відновлює загальний рівень експресії H3K27me3, підтримуючи важливу роль MYC–SLC7A5 – вісь метаболізму метіоніну в регулюванні ↑[H+ ]-індукованої епігенетичної стовбурності. Дійсно, ми виявили, що надмірна експресія SLC7A5 частково порушує ↑[H+ ]-індукований фенотип, схожий на стовбур, що додатково підтверджує критичну роль транспортера метіоніну SLC7A5 у придбанні Т-клітинного фенотипу, подібного до пам’яті, під впливом ↑[H+ ].

Історично вважалося, що більшість TIL були вичерпані через постійний вплив TCR на пухлини, але, як це не парадоксально, невелика підмножина клонотипів Т-клітин у TIL, які експресують фактор транскрипції TCF1, зберігають властивості, подібні до стовбурових клітин. Наші висновки показали, що експозиція ↑[H+] компенсує ефекторну функцію Т-клітин і зберігає стовбурові Т-клітини через вісь метаболізму MYC–SLC7A5–метіонін, що дає можливе пояснення поточного парадоксу щодо того, чому невелика частка TIL все ще містить стовбурові клітини. як пам'ять або властивості прекурсора. Насправді, повідомлялося про подібні висновки, згідно з якими іони калію в TME відіграють подвійну роль, впливаючи як на ефекторну функцію Т-клітин, так і на стовбурову функцію56,72, що додатково підтверджує комплексні ефекти імуносупресивних факторів TME (наприклад, хронічна стимуляція TCR, гіпоксія та низький рівень). глюкоза) на функцію та диференціацію Т-клітин. Крім того, кислі області всередині пухлин є дуже динамічними та регулюються як просторово, так і тимчасово, і придатність Т-клітин, адаптованих до позаклітинного ацидозу, ймовірно, затьмарюється, коли вони стикаються з іншими суворими факторами ТМЕ, які можуть впливати на внутрішньопухлинну ефекторну функцію та диференціювання Т-клітин. Крім того, ми спостерігали вищу експресію MYC у термінально виснажених Т-клітинах (LY108− TIM-3+), ніж у виснажених прогеніторних Т-клітинах (LY108+ TIM-3–), що згідно з попередніми звітами, Т-клітини MYClo переважно набувають долі пам’яті73. У відповідності зі зниженою експресією SLC7A5 і поглинанням метіоніну в Т-клітинах, які зазнали впливу ↑[H+ ], експресія SLC7A5 також була значно знижена в популяції Т-клітин-попередників, виснажених LY108+ TIM-3, у пухлинах, припускаючи, що регуляторна вісь MYC–SLC7A5–метіонін також може працювати in vivo. Зараз очевидно, що менш диференційовані стовбурові Т-клітини пам’яті мають кращий протипухлинний терапевтичний ефект завдяки їх довгостроковій стійкості та стійкості до розвитку дисфункції51,74. У цьому документі ми надали переконливі докази того, що довгострокові ↑[H+ ]-кондиціоновані CD8+ Т-клітини продемонстрували підвищену стійкість і чудову протипухлинну здатність in vivo зі зниженою термінально виснаженою популяцією Т-клітин (TCF1− TIM{ {39}} ) і збільшення підмножини стовбурових попередників (TCF1+ TIM-3– ) у пухлинах. На завершення, наше поточне дослідження дає уявлення про багатовимірні ефекти впливу ↑[H+] на пригнічення ефекторної функції Т-клітин та її одночасний вплив на стовбурові Т-клітини.

методи

Миші та клітинні лінії

Усі експерименти на тваринах проводилися зі схвалення Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) Інституту системної медицини Сучжоу (ISM-IACUC-0151-R), і тварин містили в спеціальних приміщеннях для мишей, вільних від патогенів. Мишей містили в стандартних умовах із 12-h/12-h циклами світла/темряви та контрольованою температурою 22–24° і вологістю 60%, з необмеженою їжею та водою наявність, і оглядалися щодня. Усі пухлинні навантаження не перевищували дозволу, схваленого Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Сучжоуського інституту системної медицини. CD45.1+ самок трансгенних мишей OT-I TCR на фоні C57BL/6N містили разом. CD45.2+ самки мишей C57BL/6N віком 6–8 тижнів були придбані в Vital River як реципієнти. Самки мишей NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) віком 6–8 тижнів були придбані у GemPharmatech. Для одного незалежного експерименту in vivo мишей CD45.1+ і CD45.2+ (6–12 тижнів) збігали за статтю. Клітини HEK-293T з Американської колекції типових культур (ATCC) підтримували в середовищі DMEM, доповненому 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) і 1% пеніцилін-стрептоміцину. Лінія клітин меланоми миші B16 з ATCC була трансдукована для експресії OVA та зберігалася в середовищі DMEM, доповненому 10% FBS та 1% пеніциліну-стрептоміцину. Клітини K562 з ATCC трансдукували для експресії CD19 людини та культивували в середовищі RPMI 1640, доповненому 10% FBS, 1% пеніциліну-стрептоміцину, 1% GlutaMAX, 0,1 М HEPES, 1% незамінних амінокислот, 1 мМ пірувату натрію та 50 мкМ -меркаптоетанол. Усі вищевказані реагенти були придбані у Gibco.

Первинна ізоляція Т-клітин, активація та ретровірусна трансдукція

Мишачі CD{{0}} Т-лімфоцити виділяли із селезінки 6–12-тижневих самців або самок мишей OT-I за допомогою набору для виділення наивних Т-клітин CD8 (BioLegend) і культивували в RPMI{{5} } середовище з додаванням 10% FBS, 1% пеніцилін-стрептоміцину, 1% незамінних амінокислот, 1% GlutaMAX, 1 мМ пірувату натрію, 0,1 М HEPES і 50 мкМ -меркаптоетанолу в присутності мишачого IL -2 (20 ОД/мл, Peprotech). Для одного незалежного експерименту in vitro самці та самки мишей (6–12 тижнів) були використані за статтю. Очищені клітини активували антитілами проти мишачого CD3 (2 мкг/мл, BioLegend) і проти мишачого CD28 (1 мкг/мл, BioLegend) протягом 48 годин. Мононуклеарні клітини периферичної крові людини (PBMC) від здорових донорів були придбані у Sailybio та культивовані в середовищі RMPI-1640 з додаванням 5% сироватки людини AB (Gemini), 1% пеніциліну-стрептоміцину, 1% незамінних амінокислот, 1% GlutaMAX, 1 мМ піруват натрію, 0,1 М HEPES і 50 мкМ -меркаптоетанол у присутності людського IL-2 (100 ОД/мл, Peprotech). Моноклональні антитіла проти CD3 людини (1 мкг/мл, BioLegend) і CD28 людини (1 мкг/мл, BioLegend) використовували для активації PBMC протягом 3 днів. Очищені мишачі та людські Т-клітини активували та розмножували у зазначених умовах культивування: pH 7,4, pH 6,6, молочна кислота (Sangon) або лактат натрію (Sangon). Наступні метаболіти використовувалися для доповнення середовища pH 6,6 або молочної кислоти (10 мМ): метіонін 800 мкМ (MCE), SAM 100 мкМ (MCE) або SAH 100 мкМ (Sigma). Для трансдукції вірусу активували 1 × 106 PBMC на лунку в 24-лункових планшетах. Після 48 годин активації більшу частину середовища замінили неконцентрованим ретровірусним супернатантом з 10 мкг/мл полібрену (Santa Cruz). Після центрифугування при 600 g протягом 90 хвилин при 30 градусах клітини культивували в інкубаторі протягом 24 годин зі свіжим середовищем. Трансдукцію повторювали через 24 години, а потім повертали в свіже середовище для культивування. Для кількісної оцінки ефективності інфекції використовували низькоафінний рецептор фактора росту нервів (LNGFR).

Проточна цитометрія

Клітини фарбували флуоресцентними антитілами, а потім аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для фарбування поверхневих маркерів клітини фарбували флуоресцентно кон’югованими антитілами та набором живих/мертвих фіксованих мертвих клітин (Invitrogen) у буфері FACS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS) з 2% FBS), потім фіксували 2% параформальдегідом (Casmart) протягом 20 хв при кімнатній температурі. Для внутрішньоклітинного фарбування фосфобілків попередньо пофарбовані клітини фіксували фіксуючим буфером (BioLegend), а потім фарбували фосфоспецифічними антитілами в пермеабілізаційному буфері (Invitrogen). Для виявлення внутрішньоклітинних цитокінів клітини стимулювали форболміристат ацетатом (PMA) у присутності брефельдину A (BFA) (BioLegend) протягом 4,5 годин. Потім попередньо пофарбовані клітини фіксували та фарбували антитілами до цитокінів у пермеабілізаційному буфері. Для фарбування на внутрішньоклітинний транскрипційний фактор клітини попередньо фарбували за допомогою набору для фарбування мертвих клітин Live/Dead Fixable і флуоресцентно кон’югованих антитіл у буфері FACS для виявлення поверхневих маркерів. Потім клітини фіксували протягом 30 хвилин на льоду з використанням FOXP3/буфера для фіксації фактора транскрипції (Invitrogen) і фарбували антитілами до фактора транскрипції в буфері для пермеабілізації. Після фарбування клітини ресуспендували в буфері FACS для проточної цитометрії. Дані проточної цитометрії збирали BD LSR Fortessa та BD FACSDiva (v8.0.2) і аналізували за допомогою програмного забезпечення FlowJo (v10.4). Репрезентативні стратегії стробування наведено на рисунку 10b розширених даних.

Секвенування РНК

Аналіз РНК-seq проводили з використанням 12-денних Т-клітин, культивованих у зазначених умовах, як показано на рис. 1а. Коротко, через 12 днів після експансії Т-клітин загальну РНК екстрагували гомогенізацією в TRIzol (Takara) і заморожуванням у пробірках без РНКази з рідким азотом. Цілісність РНК оцінювали за допомогою біоаналізатора Agilent 2100 (Agilent). Бібліотеки були створені за допомогою набору для підготовки зразків РНК TruSeq (FC-122-1001, Illumina). Потім бібліотеки секвенували за допомогою платформи Illumina NovaSeq 6000 (PE150), і було згенеровано приблизно 40 мільйонів парних зчитувань (Novogene). Необроблені підрахунки читань були витягнуті, а потім нормалізовані за коефіцієнтами розміру бібліотеки за допомогою DESeq2 (v1.28.1). Регуляризоване перетворення логарифму (r-log) було використано для стабілізації дисперсії по вибірках. Аналіз збагачення шляхів GO та KEGG диференціально експресованих генів проводили з кластерним профілем (v3.16.0). Теплові карти вираження були створені за допомогою R-пакета 'pheatmap' (v1.0.12). Для аналізу GSEA використовувався GSEA v.4.0.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq проводили, як описано раніше75, використовуючи Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit для Illumina (TD903, Vazyme). Коротко, Т-клітини людини розмножували протягом 12 днів у контрольних умовах, молочної кислоти або молочної кислоти з 800 мкМ метіоніну. Потім 1 × 105 Т-клітин лізували для екстракції нуклеїнових матеріалів та інкубували з кульками ConA при кімнатній температурі протягом 10 хв. Клітини ресуспендували в 50 мкл буфера антитіла, попередньо змішаного з первинним антитілом (анти-H3K27me3 або анти-H3K4me3) та інкубували протягом ночі при 4°C. Зразки інкубували з вторинним антитілом при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, а потім спільно інкубували з транспозазою білка A/G-Tn5 при кімнатній температурі протягом 1 години, щоб порушити фрагментацію ДНК. Очищену ДНК використовували для підготовки бібліотеки та секвенували за допомогою секвенатора PE150 Illumina Nova6000.

CUT&Tag-seq аналіз

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) використовувався для перевірки якості зчитування послідовності. Якість зчитування було зменшено до мінімального балу Phred 20 за допомогою trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Усі зчитування, зроблені CUT&Tag-seq H3K27me3 і H3K4me3, були узгоджені з геномом людини hg38 за допомогою Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) з параметрами: –local– very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Зразки без спайк-ін ДНК були нормалізовані за допомогою методу ChIPseqSpikeInFree, який є новий метод нормалізації для ефективного визначення коефіцієнтів масштабування для зразків у різних умовах і методах лікування76. Для H3K27me3 піки викликано за допомогою MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) із параметрами '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. Для H3K4me3 пік виклику використовував MACS2 з параметрами '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Піки були анотовані за допомогою ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), а візуалізації створено за допомогою deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en). /develop/) і pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

QRT–ПЛР

Загальну РНК виділяли за допомогою TRIzol (Takara) і зворотно транскрибували в кДНК за допомогою зворотної транскриптази HiScript (Vazyme), згідно з інструкціями виробника. Для кількісної ПЛР у реальному часі використовували систему ПЛР у реальному часі ABI prism 7500 (Thermo Fisher) і 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) відповідно до інструкцій виробника. ACTB використовувався як внутрішній стандарт. Відносну експресію мРНК розраховували методом 2−ΔΔCT. Послідовності праймерів, які використовуються для КПЦР, можна знайти в Додатковій таблиці 1.

Вестерн-блот

Для аналізу експресії білка клітини збирали та промивали холодним PBS, а загальний білок екстрагували за допомогою 1% SDS (Sangon) на льоду. Концентрацію білка вимірювали за допомогою набору для аналізу білка BCA (Merck). Зразки білка розділяли SDS–PAGE гелями, а потім переносили на мембрани PVDF (Millipore). Мембрани блокували 5% знежиреним молоком у PBS, що містить Tween20. Після блокування мембрани інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 градусах і HRP-зв’язаними вторинними антитілами протягом 2 годин при кімнатній температурі. Сигнал HRP був розроблений за допомогою електрохемілюмінесценції (ChemeMINI610) і зібраний Sage Capture (v2.19.12). Аналіз даних проводили за допомогою програмного забезпечення ImageJ (v1.8.0).

Морфологічний аналіз мітохондрій

У кожній лунці {{0}}лункових планшетів PBMC активували людськими антитілами проти CD3 та CD28 протягом 3 днів і культивували в середовищі RPMI-1640 за різних умов протягом 12 днів. Потім 1 × 106 PBMC збирали та фіксували в попередньо охолодженому буфері для фіксації (2,5% глутарового альдегіду, 0,1 М фосфатного буфера (PB), pH 7,4) протягом ночі при 4 градусах. Після тричі промивання PBS клітини постфіксували в 1% чотириокисі осмію в PBS протягом 2 годин, зневоднювали і заливали в смолу Spurr згідно зі стандартною процедурою. Ультратонкі зрізи фарбували уранілацетатом і цитратом свинцю. Морфологію мітохондрій було зображено за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії Hitachi HT-7800 (TEM) (v01.20) і камери AMT-XR81DIR.

Антитіла та реагенти

Антитіла, використані для проточної цитометрії, були такими. APC проти людського NGFR (кат. № 345108, 1:1, 000 для FACS), FITC проти людського CD4 (кат. № 357406, 1:200 для FACS), Pacific Blue проти людського CD8 (№ за кат. 300928, 1:200 для FACS), APC-Cy7 анти-людський/мишачий CD44 (№ за кат. 103028, 1:200 для FACS), PE анти-людський CCR7 (№ за кат. 353204, 1 :200 для FACS), PE проти людини TNF- (кат. № 502909, 1:200 для FACS), PE-Cy7 проти людини CD45RO (кат. № 304230, 1:200 для FACS), APC анти- людський IFN- (кат. № 502512, 1:200 для FACS), PE-Cy7 анти-людський LAG-3 (кат. № 369310, 1:200 для FACS), PE анти-людський TIM{{ 52}} (номер за кат. 345006, 1:200 для FACS), BV711 проти людини PD-1 (номер за кат. 329928, 1:200 для FACS), Percp-Cy5.5 проти людини CD62L (№ за кат. 304824, 1:200 для FACS), APC анти-людський CD27 (№ за кат. 302810, 1:200 для FACS), BV711 антимишачий CD8 (№ за кат. 100748, 1:200 для FACS) ), PE-Cy7 антимишачий CD62L (кат. № 104418, 1:200 для FACS), APC-Cy7 антимишачий CD45.2 (кат. № 830789, 1:200 для FACS), Pacific Blue анти- миша CD45.1 (кат. № 110722, 1:200 для FACS), APC anti-mouse Ly108 (кат. немає. 134610, 1:200 для FACS), PE антимишачий LAG-3 (номер за кат. 125207, 1:200 для FACS), антитіло Alexa Fluor 488 анти-c-MYC (номер за кат. 626811, 1) :200 для FACS), PE проти мишачого TNF- (кат. № 506306, 1:200 для FACS) і APC проти мишачого IFN- (кат. № 505810, 1:200 для FACS) були придбані в BioLegend . Набір живих/мертвих плям від мертвих клітин, PerCP-eFluor710 проти мишачих PD-1 (кат. № 46-9981-82, 1:200 для FACS), PE luminofor-S6 (Ser235/236) (кат. . № 12-9007-42, 1:200 для FACS), PE проти людини/миші TOX (кат. № 12-6502-82, 1:200 для FACS) і PE-Cy7 проти миші TIM{ {149}} (кат. № 25-5870-82, 1:200 для FACS) були придбані у Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (кат. № 6709, 1:200 для FACS) і фосфор-4E-BP1 (Thr37/46) (кат. № 2846, 1:200 для FACS) були придбані в Технологія клітинної сигналізації. Alexa Fluor 647 проти пуроміцину (кат. № MABE343-AF647, 1:800 для FACS) було придбано в Merck. Антитіла, використані для вестерн-блотів, були такими. Кролячий анти-фосфо-Akt (Ser473) (кат. № 4060, 1:1, 000 для IB), анти-фосфо-NF-κB p65 (Ser536) (кат. № 3033, 1:1) ,000 для IB), анти-c-MYC (кат. № 18583, 1:1,000 для IB), анти-EZH2 (кат. № 5246, 1:1,{ {200}} для IB), анти-три-метил-гістону H3 (Lys27) (номер за кат. 9733, 1:1, 000 для IB), анти-три-метил-гістону H3 (Lys4) (№ за кат. 9751, 1:1, 000 для IB), анти-диметилгістону H3 (Lys9) (№ за кат. 4658, 1:1, 000 для IB) , анти-диметил-гістон H3 (Lys79) (№ за кат. 5427, 1:1, 000 для IB), анти-гістон H3 (№ за кат. 9715, 1:1, {{242) }} для IB), анти-COXIV (№ за кат. 850, 1:1,000 для IB), анти-кролячий IgG (пов’язаний з HRP) (№ за кат. 7074, 1:2,{ {253}} для IB) і антимишачий IgG (HRP-зв’язаний) (кат. № 7076, 1:2, 000 для IB) були придбані в Cell Signaling Technology. Мишачий анти-Tim23 (кат. № 611223, 1:1, 000 для IB) був від BD Biosciences. Мишачий анти- -актин (кат. № 66009-1-Ig, 1:5,000 для IB), анти-SLC7A5 (кат. № 67951-1-Ig, 1: 1,000 для IB), і кролячий анти-SLC38A1 (номер за кат. 12039-1-AP, 1:1,000 для IB) були від Proteintech. Кролячий анти-SLC38A2 (кат. № BMP081, 1:1, 000 для IB) було придбано в Medical & Biological Laboratories.

Т-клітинний метаболічний аналіз

Щоб перевірити поглинання BODIPY FL C16 контрольними або ↑[H+ ]-обробленими Т-клітинами, Т-клітини культивували зі свіжорозчиненим 1 мкМ BODIPY FL C16 (Invitrogen) протягом 1 години, потім двічі промивали PBS перед фарбуванням поверхні. Для подальшого вивчення метаболічної залежності в різних групах лікування було проведено експерименти з використанням методу SCENITH (енергетичний метаболізм однієї клітини шляхом профілювання інгібіції трансляції)42. Коротко, Т-клітини висівали в 96-лункові планшети при 1 × 106 клітин/мл. Потім клітини обробляли контролем (Ctrl), 2-дезокси-d-глюкозою (кінцева концентрація 100 мМ), олігоміцином (кінцева концентрація 5 мкМ) або сумішшю інгібіторів у кінцевих концентраціях протягом 40 хвилин при 37°С. ступінь . Протягом останніх 30 хв додавали пуроміцин (кінцева концентрація 10 мкг/мл). Після обробки пуроміцином клітини промивали холодним PBS і попередньо фарбували набором для фарбування живих/мертвих клітин, що фіксується, і антитілами проти поверхневих маркерів. Після фарбування внутрішньоклітинного пуроміцину слідував процес фарбування внутрішньоклітинних факторів транскрипції.

Метаболомічний аналіз за допомогою LC-MS/MS

Метаболомічний аналіз і збір зразків проводили, як і в попередніх звітах77. Коротше кажучи, РВМС активували індивідуально в 24-лункових планшетах людським анти-CD3/CD28 протягом 3 днів і культивували в середовищі RPMI 1640 з контролем або молочною кислотою до 12 дня. Потім 8 × 106 клітин на зразок (n=4 незалежних зразків на групу) збирали та переносили в пробірку на 1.5- мл для центрифугування при 300 g протягом 5 хвилин при 4 градусах, а потім промивають холодним PBS. Після повторного центрифугування при 300 g протягом 5 хвилин додавали 80% холодний метанол і енергійно перемішували, щоб повністю зруйнувати клітинний осад, а потім клітини переносили в морозильну камеру при -80 градусах. Зразки центрифугували при 12,000 g протягом 10 хв при 4 градусах. Супернатант збирали. Нарешті, екстракти були ліофілізовані та проаналізовані за допомогою UHPLC–MS/MS у Novogene. Файли необроблених даних, створені UHPLC–MS/MS, були оброблені за допомогою Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) для виконання вирівнювання піків, відбору піків і кількісного визначення для кожного метаболіту. Програмне забезпечення Metaboanalyst (v5.0) використовувалося для подальшого аналізу даних, а потім були обрані значно збагачені шляхи з використанням P <0,05.

Експерименти з міченням стабільних ізотопів

Метаболічний потік 13C проводили на Т-клітинах за допомогою описаних раніше методів60,78,79. Коротко, РВМС активували на лунку в 24-планшетах з лунками людськими анти-CD3/CD28 протягом 3 днів, як описано вище. Для відстеження рівня глюкози [13C6] через 11 днів середовище було замінено на безглюкозний RPMI (Gibco) з додаванням 10% діалізованого FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% пеніциліну-стрептоміцину, 1% незамінних амінокислот, 50 мкМ -меркаптоетанол і 0,1 М HEPES, що містить 11 мМ [13C6]глюкози (Cambridge Isotope Laboratories) з контролем або 10 мМ молочної кислоти, протягом 24 год. Для відстеження [13C16]пальмітату 2 × 107 Т-клітин активували та поміщали в готове середовище з контролем або умовами 10 мМ молочної кислоти, як описано вище, на 12 день, що містило 200 мкМ [13C16]пальмітату (Cambridge Isotope Laboratories), протягом 8 ч. Для відстеження [13C5]метіоніну Т-клітини розмножували під контролем, молочною кислотою або молочною кислотою з 800 мкМ метіоніну протягом 12 днів. Потім 4 × 107 Т-клітин перевели на повне середовище RPMI без метіоніну (Gibco) і культивували в контрольних умовах, молочній кислоті або молочній кислоті з додаванням метіоніну (містить 100 мкМ, 100 мкМ або 800 мкМ [13C5]метіоніну) (Cambridge Isotope Laboratories), протягом 8 год. Відповідні супернатанти збирали і потім зберігали при -80 градусах. Клітини осаджували центрифугуванням (300 g, 4 градуси, 5 хвилин), двічі промивали фізіологічним розчином і негайно швидко заморожували в рідкому азоті та зберігали при -80 градусах. Метаболіти екстрагували за допомогою охолодженого 80% метанолу ВЕРХ і коротко перемішували, потім додавали 200 мл води ВЕРХ, потім 500 мл хлороформу ВЕРХ (співвідношення метанол:вода:хлороформ 5:2:5). ). Суміш перемішували і центрифугували для досягнення розділення фаз. Супернатанти сушили вакуумним центрифугуванням для подальшої дериватізації, а потім інкубували з 2% (маса/об’єм) гідрохлоридом метоксиаміну (226904, Sigma-Aldrich) у піридині протягом 60 хвилин при 37 градусах і силілювали N-метил-N-( трет-бутилдиметилсиліл) трифторацетамід з 1% трет-бутилдиметилхлорсилану (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) протягом 30 хвилин при 45 градусах. Похідні [13C6]глюкози аналізували за допомогою GC-HRMS, газового хроматографа Trace 1310 (Thermo Fisher) з колонкою DB–35MS (Agilent Technologies) та системи Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS (Thermo Fisher). Метаболомічні аналізи ГХ-МС/МС проводилися за допомогою Metabo-Profile. Метаболіти були ідентифіковані та кількісно визначені Xcalibur (v4.1) і TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), включаючи час утримування, співвідношення заряду до маси іонних фрагментів та пікову інтенсивність. Похідні [13C16]пальмітату та [13C5]метіоніну аналізували за допомогою рідинної хроматографії надвисокого тиску на потрійному квадрупольному мас-спектрометрі (UPLC–TQMS). Необроблені дані UPLC–TQMS були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Waters MassLynx (v4.1, Waters) для екстракції піків, інтеграції, ідентифікації та кількісного визначення метаболітів. Для подальшого статистичного аналізу використовувалася мова R (v4.1.1).

Модель пухлини B16 та імунотерапія з адаптивним перенесенням клітин

Щоб дослідити протипухлинну активність Т-клітин in vivo, 0.2 × 106 клітин меланоми B16-OVA були підшкірно введені самкам мишей C57BL/6N. Через дев'ять днів після імплантації пухлини мишам внутрішньовенно вводили 5 × 106 Т-клітин від самок мишей OT-I, розмножених протягом 7 днів у різних умовах. Миші з пухлиною отримали 5 Гр сублетального опромінення перед ACT. Площу пухлини вимірювали кожні 2 дні та розраховували як довжину (мм) × ширину (мм). Мишей із площею пухлини, що наближалася до 300 мм2, піддавали евтаназії. Щоб дослідити стійкість розширених Т-клітин у різних умовах, 4 × 106 CD45.1+ Т-клітини самок мишей OT-I були адаптовано перенесені в самок мишей C57BL/6N. Через тиждень мишей піддавали евтаназії та підраховували клітини ізольованої крові, селезінки та лімфатичних вузлів. Частку перенесених Т-клітин визначали за допомогою стробування Т-клітин, що експресують CD45.1+ і CD45.2+, за допомогою проточної цитометрії.

Мишача модель NCG і терапія CD19-CAR-T

Самкам мишей NCG підшкірно імплантували 1 × 106 клітин CD19-K562. Коли об’єм пухлини досягав 75 ​​мм3, миші отримували 5 × 106 нетрансдукованих Т-клітин і CD19-CAR Т-клітин, культивованих у контрольному середовищі або середовищі, що містить 10 мМ молочної кислоти. Зростання пухлини вимірювали кожні 2 дні електронним штангенциркулем і розраховували за довжиною (мм) × шириною (мм). Мишей з площею пухлини більше 300 мм2 піддавали евтаназії. Пухлини збирали, перетравлювали та обробляли Percoll (Sigma), а потім визначали функцію та фенотип Т-клітин за допомогою проточної цитометрії.

Аналіз рівня базального споживання кисню та рівня позаклітинного підкислення

Для аналізу метаболічних характеристик OCR і ECAR оцінювали за допомогою аналізатора Seahorse XF24 (Agilent). Коротко, Т-клітини людини, культивовані в різних умовах протягом 12 днів, попередньо обробляли небуферизованим середовищем XF (небуферизоване RPMI 1640, що містить 10 мМ глюкози, 1 мМ пірувату натрію та 2 мМ глутаміну) . Далі Т-клітини людини висівали 0.5 × 106 клітин на лунку в мікропланшет для клітинної культури XF24 та інкубували в інкубаторі без CO2 протягом 1 години при 37 градусах. Щоб підвищити адгезію клітин, пластини обертали при кімнатній температурі протягом 5 хвилин при 100 g з нульовим гальмуванням. Споживання кисню та позаклітинне підкислення аналізували за базових умов і у відповідь на 1,25 мкМ олігоміцину, 50 мМ 2-дезокси-d-глюкози, 1,5 мкМ FCCP, 0,5 мкМ ротенону та 0,5 мкМ антиміцину А. SRC розраховували шляхом віднімання базальний OCR від максимального OCR.

ЧІП–кПЛР

Імунопреципітацію хроматину (ChIP) проводили згідно з інструкціями виробника, що надаються разом із набором експрес-ферментативного зсуву ChIP-IT (Active Motif). Коротше кажучи, 15 мільйонів Т-клітин людини, культивованих у контрольних умовах або в умовах 10 мМ молочної кислоти, фіксували формальдегідом протягом 10 хвилин при кімнатній температурі, і реакцію фіксації зупиняли додаванням 1 × гліцину. Фіксовані клітини осаджували з PMSF і коктейлем інгібування білків і зберігали при -80 градусах до лізису клітин. Потім розморожений осад ресуспендували в 1 мл охолодженого буфера для лізису з PMSF і білковим інгібуючим коктейлем на льоду протягом 30 хвилин для отримання ядерного матеріалу. Потім ядерний осад ресуспендували та розщеплювали ферментативним коктейлем для зсуву хроматину протягом 15 хвилин при 37 градусах. Розрізаний хроматин інкубували з магнітними кульками протеїну G з анти-c-MYC (CST, кат. № 18583, 1:100 для ChIP) і анти-IgG (CST, кат. № 2729, 1:100 для ChIP) при 4 градуси вночі. Потім магнітні кульки чотири рази промивали буферами ChIP і елюювали 50 мкл буфера для елюції. Елюйовану ДНК зворотно зшивали протягом 2,5 годин при 65 градусах, а потім очищали фенол-хлороформною екстракцією. Очищену ДНК використовували для виконання ChIP–qPCR для виявлення збагачення MYC на промоторах цільових генів. Праймери, які використовуються для ChIP–qPCR, можна знайти в додатковій таблиці 2.

Аналіз мітохондріальної маси та мембранного потенціалу

Масу мітохондрій і мембранний потенціал аналізували за допомогою MitoTracker Green і метилового ефіру тетраметиродаміну (TMRM). Клітини фарбували 250 нМ MitoTracker Green (Thermo Fisher) або 50 нМ TMRM (Thermo Fisher) в інкубаторі при 37 градусах (5% CO2) протягом 1 години перед фарбуванням поверхні клітин. Клітини тричі промивали буфером FACS, після чого фарбували поверхневі маркери для подальшого аналізу FACS.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою GraphPad Prism версії 8.0. Результати відображаються як середнє ± sem. Двосторонній t-критерій Стьюдента використовувався для порівняння лікування з контрольними групами. Двосторонній дисперсійний аналіз із множинним порівнянням Тьюкі Сідака або Даннетта застосовувався для численних порівнянь. P < 0.05 вважалося статистично значущим.

Список літератури

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T стовбурові клітини пам'яті в здоров'ї та хворобі. Нац. Мед. 23, 18–27 (2017).

2. Гао С. та ін. Т-клітини пам'яті, подібні до стовбурових клітин: погляд з темного боку. Клітинний імунол. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Передача адоптивних клітин як персоналізована імунотерапія раку людини. Наука 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Імунотерапія раку з використанням блокади контрольних точок. Наука 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Стовбурові, ефекторні та гібридні стани CD{1}} Т-клітин пам’яті. Trends Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. та ін. Дві підмножини стовбурових CD8+ Т-клітин-попередників пам’яті з чіткими зобов’язаннями долі у людей. Нац. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Гаттіноні Л. та ін. Підгрупа Т-клітин пам’яті людини з властивостями, подібними до стовбурових клітин. Нац. Мед. 17, 1290–1297 (2011).

8. Франко, Ф., Жаккард, А., Ромеро, П., Ю, Ю.Р. і Хо, ПК. Метаболічна та епігенетична регуляція виснаження Т-клітин. Нац. Метаб. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Транскрипційний контроль ефектора та диференціації CD{1}} Т-клітин пам’яті. Нац. Rev. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. та ін. Первинна диференціація пухлиноспецифічних CD{2}} Т-клітин пам’яті як добросовісних реагуючих на блокаду PD-1/PD-L1 у дренажних лімфатичних вузлах. Cell 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. та ін. Внутрішньопухлинні Tcf1+ PD-1+ CD8+ Т-клітини зі стовбуровими властивостями сприяють контролю пухлини у відповідь на вакцинацію та імунотерапію блокадою контрольних точок. Імунітет 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. та ін. Важлива роль ефектора шляху Wnt Tcf-1 для встановлення функціональної пам’яті Т-клітин CD8. Proc. Нац. акад. Sci. США 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Епігенетичний контроль CD8+ Т-клітинної диференціації. Нац. Rev. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Кромптон Дж. Г. та ін. Взаємозв’язок між підгрупами Т-клітин CD8+ виявляється прогресивними змінами в епігенетичному ландшафті. Клітина мол. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Ю Б. та ін. Епігенетичні ландшафти виявляють фактори транскрипції, які регулюють диференціацію CD8+ Т-клітин. Нац. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Аракі Ю. та ін. Загальногеномний аналіз метилювання гістонів показує регуляцію транскрипції генів і функції CD8+ Т-клітин пам’яті на основі стану хроматину. Імунітет 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Метаболічні програми адаптують Т-клітинний імунітет при вірусних інфекціях, раку та старінні. клітинний метаб. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT та ін. Конститутивний гліколітичний метаболізм підтримує диференціацію ефекторної пам’яті Т-клітин CD8+ під час вірусної інфекції. Імунітет 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV та ін. Рецептор антигену контролює метаболізм метіоніну в Т-клітинах. eLife 8, e44210 (2019).

20. О'Салліван Д. та ін. Т-клітини пам’яті CD8+ використовують властивий клітинам ліполіз для підтримки метаболічного програмування, необхідного для розвитку. Імунітет 41, 75–88 (2014).

21. Пірс, Е. Л. та ін. Посилення пам'яті Т-клітин CD8 шляхом модуляції метаболізму жирних кислот. Nature 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ та ін. Дихальна здатність мітохондрій є критичним регулятором розвитку пам’яті CD8+ Т-клітин. Імунітет 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Кисле мікрооточення пухлини як рушійна сила раку. Annu. Rev. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T-клітинна дисфункція при раку. Ракова клітина 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE та ін. Мікрооточення пухлини пригнічує мітохондріальний біогенез Т-клітин, що призводить до внутрішньопухлинної метаболічної недостатності та дисфункції Т-клітин. Імунітет 45, 374–388 (2016).

26. Ю. Р. та ін. Порушена мітохондріальна динаміка в CD8+ TIL посилює виснаження Т-клітин. Нац. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH та ін. Метаболічна конкуренція в мікрооточенні пухлини є рушійною силою прогресування раку. Осередок 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE та ін. Мітохондріальний стрес, викликаний постійною стимуляцією в умовах гіпоксії, швидко призводить до виснаження Т-клітин. Нац. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS та ін. Внутрішньопухлинна ніша підтримує та диференціює стовбурові CD8 Т-клітини. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Ім, SJ та ін. Визначення CD8+ T-клітин, які забезпечують проліферативний сплеск після PD-1 терапії. Nature 537, 417–421 (2016).

31. Хаас Р. та ін. Лактат регулює метаболічні та прозапальні ланцюги, контролюючи міграцію Т-клітин і ефекторні функції. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. та ін. Т-клітини виробляють кислотні ніші в лімфатичних вузлах для придушення власних ефекторних функцій. Нац. Комун. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. та ін. Модуляція кислотності мікрооточення скасовує анергію в Т-лімфоцитах, що інфільтрують пухлину людини та миші. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Готфрід Е. та ін. Молочна кислота, отримана з пухлини, модулює активацію дендритних клітин і експресію антигену. Кров 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR та ін. Функціональна поляризація асоційованих з пухлиною макрофагів молочною кислотою, отриманою з пухлини. Nature 513, 559–563 (2014).

36. Ерра Діас, Ф. та ін. Позаклітинний ацидоз і інгібування mTOR стимулюють диференціювання дендритних клітин людського моноцитарного походження. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Сукумар М. та ін. Інгібування гліколітичного метаболізму покращує пам’ять CD8+ Т-клітин і протипухлинну функцію. Дж. Клін. Інвестувати. 123, 4479–4488 (2013).

38. Шольц Г. та ін. Модуляція передачі сигналів mTOR запускає утворення Т-клітин пам’яті, подібних до стовбурових клітин. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN та ін. mTORC1 і mTORC2 вибірково регулюють диференціацію Т-клітин CD8+. Дж. Клін. Інвестувати. 125, 2090–2108 (2015).

40. Чжан Л. та ін. Мішень комплексу рапаміцину 2 у ссавців контролює диференціацію пам’яті Т-клітин CD8 залежно від Foxo1-. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Роль сигналізації mTOR у рухливості пухлинних клітин, інвазії та метастазуванні. Curr. Протеїн Пепт. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ та ін. SCENITH: метод на основі проточної цитометрії для функціонального профілю енергетичного метаболізму з роздільною здатністю однієї клітини. клітинний метаб. 32, 1063–1075 (2020).

43. Рон-Харел Н. та ін. Мітохондріальний біогенез і ремоделювання протеомів сприяють одновуглецевому метаболізму для активації Т-клітин. клітинний метаб. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Підживлення Т-клітинного протипухлинного імунітету: перегляд метаболізму амінокислот. Імунол проти раку. рез. 9, 1373–1382 (2021).

45. Какарадов Б. та ін. Рання транскрипційна та епігенетична регуляція диференціювання CD8+ Т-клітин, виявлена ​​секвенуванням одноклітинної РНК. Нац. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Амінокислоти та їх транспортери в Т-клітинному імунітеті та терапії раку. мол. Cell 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Кількісний аналіз того, як Myc контролює протеоми Т-клітин і метаболічні шляхи під час активації Т-клітин. eLife 9, e53725 (2020).

48. Сукумар М. та ін. Потенціал мітохондріальної мембрани ідентифікує клітини з підвищеною стволовістю для клітинної терапії. клітинний метаб. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 посилює протипухлинну активність клітин CAR-T шляхом зниження активності mTORC1 і збереження фенотипу пам’яті стовбурових клітин. Імунол проти раку. рез. 7, 759–772 (2019).

50. Бак, доктор медицини та ін. Мітохондріальна динаміка контролює долю Т-клітин за допомогою метаболічного програмування. Осередок 166, 63–76 (2016).

51. Крішна С. та ін. Стовбурові CD8 Т-клітини опосередковують відповідь адаптивної клітинної імунотерапії проти раку людини. Наука 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML та ін. Ієрархії домінування антигенів формують фенотипи T-клітин CD8-попередників TCF1+ у пухлинах. Cell 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. та ін. Метаболічне перепрограмування остаточно виснажених CD8+ T-клітин за допомогою IL-10 посилює протипухлинний імунітет. Нац. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI та ін. Метаболічне кондиціонування ефекторних Т-клітин CD8+ для адоптивної клітинної терапії. Нац. Метаб. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Глутамін регулює протипухлинну активність CD8 Т-клітин. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Воднала С.К. та ін. Стовбурові Т-клітини та дисфункція в пухлинах запускаються загальним механізмом. Наука 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. та ін. Зміщена активація Т-лімфоцитів людини через низький позаклітинний рН антагонізується костимуляцією B7/CD28. Євро. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Накопичення лактату в місці хронічного запалення сприяє захворюванню, індукуючи перебудову метаболізму CD4+ Т-клітин. клітинний метаб. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Лактат підвищує стовбурові клітини CD8+ T для посилення протипухлинного імунітету. Нац. Комун. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG та ін. Метаболізм метіоніну формує реакції Т-хелперних клітин шляхом регуляції епігенетичного перепрограмування. клітинний метаб. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Метаболічний контроль CD8+ Т-клітинних рішень щодо долі та протипухлинного імунітету. Тенденції мол. Мед. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Депривація глюкози пригнічує численні ключові події експресії генів і ефекторні функції в CD8+ T-клітинах. Євро. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. О'Салліван Д. та ін. Т-клітини пам’яті CD8+ використовують властивий клітинам ліполіз для підтримки метаболічного програмування, необхідного для розвитку. Імунітет 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. та ін. Окислення жирних кислот контролює виживання CD8+ тканинно-резидентних Т-клітин пам’яті при аденокарциномі шлунка. Імунол проти раку. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. та ін. Дія етоксіру на регуляторні Т-клітини та Т-клітини пам’яті не залежить від опосередкованого Cpt1a окислення жирних кислот. клітинний метаб. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Метаболічні входи в епігеном. клітинний метаб. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA та ін. S-2-гідроксиглутарат регулює долю CD8+ Т-лімфоцитів. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Чжан Х. та ін. Бета-гідроксибутират, що утворюється в результаті кетогенезу, є епігенетичним регулятором розвитку пам’яті Т-клітин CD8+. Нац. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. та ін. Рак SLC43A2 змінює метаболізм метіоніну в Т-клітинах і метилювання гістонів. Nature 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. et al. Трансляційний контроль c-MYC рапаміцином сприяє кінцевій мієлоїдній диференціації. Кров 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Метаболічний контроль епігенетики та його роль у диференціації та функції Т-клітин CD8+. Фронт. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. та ін. Іонна імунна супресія в мікрооточенні пухлини обмежує ефекторну функцію Т-клітин. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Гуо А. та ін. Компоненти комплексу cBAF і MYC співпрацюють на ранній стадії CD8+ Т-клітин. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Метаболічний контроль генерації Т-клітин пам'яті та стовбурності. Cold Spring Harb. Перспектива. Biol. 13, a037770 (2021).

75 Кая-Окур, Г. С. та ін. CUT&Tag для ефективного епігеномного профілювання малих зразків і окремих клітин. Нац. Комун. 10, 1930 (2019).

76 Джин Х. та ін. ChIPseqSpikeInFree: підхід нормалізації ChIP–seq для виявлення глобальних змін у модифікаціях гістонів без спайків. Біоінформатика 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Екстракція метаболітів із суспензійних культивованих клітин ссавців для глобального профілювання метаболітів. Нац. Protoc. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. та ін. Катаболізм амінокислот регулює протеостаз гемопоетичних стовбурових клітин через вісь GCN2–eIF2. Клітинна стовбурова клітина 29, 1119–1134 (2022).

79 Wenes, M. et al. Мітохондріальний піруватний носій регулює диференціювання Т-клітин пам’яті та протипухлинну функцію. клітинний метаб. 34, 731–746 (2022).