Епігалокатехін-3-галлат сприяє дозріванню in vitro та розвитку ембріона після ЕКЗ свинячих ооцитів Частина 2

Будь ласка, зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

Результатів

Вплив EGCG на індекс розширення кумулусу

Морфологія зрілих ооцитів і ооцитів з першою екструзією полярного тіла показана на додаткових малюнках S1A і S1B відповідно. По-перше, ми дослідили індекс розширення кумулусу в ооцитах після лікування з різною концентрацією EGCG, і, як показано в таблиці 1, EGCG при 5 і 10 uM значно підвищив індекс розширення кумулусу в порівнянні з контрольною групою (група 5uM проти групи 0uM: 2,989 ±0,068 проти 2,438±0,081;10 мкМ групи проти групи 0 уМ: 3.079±0.110 проти 2.438±0.081). Однак EGCG при 20 uM не впливав на індекс розширення кумулусу в порівнянні з контрольною групою (група 20 uM проти групи 0μM∶2,879±0,076 проти 2,438±0,081).

Будь ласка, натисніть тут, щоб дізнатися більше

Вплив EGCG на швидкість IVM Ооцитів

Далі було визначено вплив EGCG на швидкість дозрівання ооцитів in vitro. Як показано в таблиці 2, швидкість дозрівання ооцитів була вищою в групах 5 і 20 мкМ в порівнянні з контрольною групою EGCG 0 мкМ; при цьому різниця не була статистично значущою (табл. 2). З іншого боку, лікування EGCG 10 мкМ значно збільшило швидкість дозрівання ооцитів у порівнянні з контрольною групою EGCG 0 μM (група 10 мкМ проти 0 мкМ груп∶58,63±2,79% проти 46,27±3,25%; P<>

Вплив EGCG на окислювальний стрес Ооцитів

Вироблення АФК Ооцитів, оброблених EGCG, визначалося за допомогою аналізу вироблення АФК. Репрезентативні зображення АФК флуоресцентних сигналів в ооцитах після лікування різною концентрацією EGCG були показані на рисунку 1А. Кількісна оцінка імунолюмінесцентного фарбування показала, що EGCG при 5 мкМ не вплинула на вироблення АФК в ооцитах в порівнянні з контрольною групою 0 мкМ (рис. 1Б).EGCG при 10 і 20 мкМ значно знижувала АФК рівні ооцитів в порівнянні з контрольною групою EGCG 0 мкМ (рис. 1В).

Цистанче може підвищити імунітет

Оскільки EGCG при 10 мкМ може збільшити індекс розширення кумулусу і швидкість дозрівання ооцитів, а також знизити рівень АФК В Ооцитах, для подальших досліджень була обрана EGCG при 10 мкМ. Як показано на рисунку 1С, EGCG при 10 uM значно збільшивАнтиоксидантємністьооцитиякщо порівнювати з контрольною групою 0 уМ (рис. 1С). Крім того, рівень глутатіону був підвищений, в той час як рівень МДА був знижений в ооцитах, що лікувалися 10 мкМ EGCG (рис. 1D і E). Крім того, qRT-PCR було виконано для визначення рівнів експресії мРНКОкислювальнийгени, пов'язані зі стресом, включаючи каталазу (CAT), глутатіонпероксидаза(GPx), і супероксиддисмутаза(СОД). EGCG при 10 мкМ значно регулює рівні експресії мРНК CAT, GPx і SOD в порівнянні з контрольною групою 0 uM (рис. 2А-С).

Вплив EGCG на рівні експресії мРНКАпоптоз-Споріднені гени в ооцитах

QRT-ПЛР була проведена для визначення рівнів експресії мРНК генів, пов'язаних з апоптозом, включаючи

Bax,Bcl-2 і caspase-3. EGCG при 10 uM значно знизила рівні експресії мРНК Bax і caspase-3 і підвищила рівень експресії мРНК Bcl-2 в порівнянні з контрольною групою 0 мкМ (рис. 3А-С).

Вплив ЕГГГ, що використовується під час ЕКЗ та ЕКЗ, на потенціал розвитку Ооцитів

Репрезентативні зображення для ембріонів і бластоцисти були показані на додатковій фігурі SIC-S1E.

лікування під час ЕКЗ значно збільшило швидкість розщеплення і швидкість бластоцисти, якщо порівнювати з контрольною групою (табл. 3). Лікування EGCG під час IVM сигніфі-відверто збільшило рівень бластоцисти, але не швидкість розщеплення в порівнянні з контрольною групою (табл. 3). Більше того, лікування EGCG як під час IVM, так і під час IVC значно збільшило швидкість розщеплення та рівень бластоцисти порівняно з трьома іншими групами (табл. 3). Ці результати вказували на те, що EGCG під час ЕКЗ та ЕКЗ можуть сприяти розвитку потенціалу ооцитів.

Вплив EGCG, що використовується під час IVM та VC, на потенціал розвитку Ооцитів

Лікування EGCG під час МКЧ значно знизило швидкість розщеплення та швидкість бластоцисти ооцитів у порівнянні з групою без лікування EGCG (табл. 4). З іншого боку, лікування EGCG під час ІВМ значно збільшило швидкість розщеплення та швидкість бластоцисти ооцитів у порівнянні з групою без лікування EGCG (табл. 4). Лікування EGCG під час IVM та IVC значно знизило швидкість розщеплення та швидкість бластоцисти ооцитів у порівнянні з групою без лікування EGCG та групою з лікуванням EGCG під час IVM (табл. 4). У сукупності ці результати вказували на те, що лікування EGCG під час IVM підвищило потенціал розвитку ооцитів, тоді як лікування EGCG під час ІВК послабило потенціал розвитку ооцитів.

Обговорення

Методика IVM для КОК була розроблена та застосована для отримання потомства у ссавців, включаючи свиней, однак швидкість утворення бластоцитів після ЕКЗ все ще низька з використанням ооцитів IVM порівняно з ооцитами, що дозрівають у vivo, таких як свині. У свиней КОК зазвичай збирають з антральних фолікулів середнього розміру(діаметром >3 мм), де ооцит має здатність викликати дозрівання ооцитів, тоді як фолікулярні соматичні клітини не набувають здатності реагувати на подразники овуляції. Крім того, середовища in vitro зазвичай збільшують вироблення АФК клітинами, яка була задіяна як основна причина пошкодження клітин.16 Тому оптимізація умов культури для імітації середовищ in vivo має важливе значення для нормального росту і дозрівання ооцитів. У цьому дослідженні різні концентрації EGCG були додані до культурального середовища IVM, ЕКЗ та IVC для спостереження за якістю дозрівання ооцитів. EGCG при 10 uM значно покращує IVM свинячих ооцитів. У цьому дослідженні доповнення EGCG під час ЕКЗ та IVC виробляє два різних ефекти. Добавки 10 uM EGCG під час ЕКЗ можуть сприяти швидкості розщеплення ооцитів, що узгоджувалося з результатами Spinaci та ін., показуючи, що добавки 10 мкМ EGCG під час ЕКЗ, але не ЕКЗ, значно збільшили швидкість запліднення.17Ефект додавання EGCG під час ЕКЗ міг бути обумовлений його дією на сперму не на ООцит.

У процесі посіву in vitro ооцити та ембріони неминуче піддаються впливу світла та вищих концентрацій кисню, ніж in vivo, що може призвести до посиленого вироблення АФК (супероксидного аніону, перекису водню та високореактивного гідроксилу). Велика кількість досліджень показали, що добавка антиоксидантів в середовищі ІВМ здатна поліпшити здатність до розвитку ембріона. Було виявлено, що EGCG діє як антиоксидант, щоб пом'якшити шкідливий вплив материнської гіпертермії на закриті фолікулами ооцити у мишей». Барберіно та ін продемонстрували, що EGCG послабила апоптоз преантральних фолікулів через фосфатидилінозитол-3-кіназу/протеїнкіназу В сигнальний шлях після інвітро культури оваріальної тканини овець». Хуан та інші припустили, що 50 мкМ EGCG може покращити дозрівання бичачих ооцитів, а захисна роль EGCG може бути співвіднесена з його антиоксидантною властивістю.°У поєднанні з попередніми дослідженнями наші результати показали, що вплив EGCG на IVM свинячих ооцитів може бути пов'язаний з антиоксидантним та антиапоптозним ефектом, який був додатково досліджений у цьому дослідженні.

Надмірне накопичення АФК може призвести до окисного стресу, а наші результати показали, що EGCG може збільшити загальну антиоксидантну здатність і знизити рівень АФК і МДА в лейкоцитах. Це може бути пов'язано з тим, що EGCG може безпосередньо усунути АФК та/або EGCG може діяти синергетично з антиоксидантною системою. Неферментативні системи покладаються на молекули для безпосереднього гасіння АФК, в той час як ферментативні системи складаються зі специфічних ферментів, які детоксикують АФК. В останньому сімейство СОД має важливе значення в регуляції окисного стресу. СОД - єдиний відомий фермент, який безпосередньо поглинає вільні радикали, каталізуючи дисмутацію супероксидного аніону до перекису водню. Фермент СОД регулює рівні супероксиду і перекису водню, що виробляються клітинами, а потім регулює трансдукцію сигналу клітини". Каталаза є важливим антиоксидантом і маркерним ферментом пероксисом. На його частку припадає 40% від загального обсягу пероксисомних ферментів. Це антиоксидантне олігомер-застосування з чотирма однаковими субодиницями, розташованими в тетраедрах, і є важливим ферментом, який захищає клітини від окисного пошкодження АФК.2Глутатіон - це трипептид, що складається з глутамінової кислоти, цистеїну та гліцину, що містить Y-амідні зв'язки та сульфгідрильні групи. Він може підтримувати нормальну роботу імунної системи і має антиоксидантну дію. Глутатіонпероксидаза(GPXs) поєднує окислення ГСГ з Н, О, детоксикацію.2"Дослідження показали, що тепловий стрес може викликати окислювальний стрес в ооцитах бубаліну, що викликає усунення АФК системою захисту антиоксидантних ферментів.2 Наші дослідження послідовно показали, що EGCG знижувала рівень АФК І вміст Ооцитів МДА при одночасному збільшенні внутрішньоклітинного вмісту ГСГ і загальної антиоксидантної здатності.

Процес апоптозу може впливати на якість і виживаність ооцитів і, таким чином, впливати на ембріональний розвиток. Білки сімейства Bcl-2 відіграють ключову роль у регулюванні загибелі клітин через збалансовану взаємодію між проапоптотичними та антиапоптотичними білковими членами.24 Проапоптотичний білок Bax є ядром мітохондріально-залежного апоптозу ссавців. Каспаза-3 також грає незамінну роль при апоптозі клітин. Каспаза-3 є найважливішим ферментом термінального зрощування в процесі апоптозу клітин, а активована каспаза-3 є ключовим виконавцем апоптозу клітин. Наші результати показують, що EGCG регулює рівень експресії Bcl-2 мРНК, але знижував рівні експресії Bax і caspase-3 мРНК. У сукупності ці результати мали на увазі, що антиоксидантні та антиапоптотичні ефекти EGCG у свинячих ооцитах значною мірою пов'язані з регуляцією SOD1, CAT та GPX, а також генів, пов'язаних з апоптозом.

Таким чином, наші результати свідчать про те, що EGCG сприяє дозріванню in vitro та розвитку ембріона після ЕКЗ лейкоцитів. Захисний вплив EGCG на ооцити може бути пов'язаний з його антиоксидантними та антиапоптозними властивостями.

Фінансування

Це дослідження було підтримано грантами від Natural ScienceFoundation of Guangdong Province (2020Al515010976), Проекту місцевих інноваційних та дослідницьких груп Програми талантів річки Гуандун Перл (2019BTO2N630), Стратегії науково-технічних інноваційПроекти провінції Гуандун (2018B020203002).

Ця стаття витягнута з Цієї статті було опубліковано в наступному журналі Dove Press: Розробка, розробка та терапія лікарських засобів