Вплив фенілетаноїдних глікозидів, витягнутих із Herba Cistanches, на навчання та пам'ять мишей із хворобою Альцгеймера

ali.ma@wecistanche.com

Цзяньхуа Ян,1 Бовей Цзю,2,3 і Цзюньпін Ху 2

Фон.Щоб дослідити наслідкифенілетаноїдглікозиди(PhGs), витягнутий зHerbaЦистанчіна поведінкові та когнітивні можливості трансгенних мишей APP/PSI схвороба Альцгеймеразахворювання(AD).

методи.Мишей AD випадковим чином розділили на контрольну групу, модельну групу, групу донепезилу, групу PhG і групу вербаскози відповідно. Через три тижні тварини піддалися оцінці поведінки та когнітивних здібностей за допомогою тесту гніздування, тесту водяного лабіринту Морріса та тесту кроку вниз.

Результати.Здібності до пізнання в цих групах продемонстрували значне зростання порівняно з групою моделі. Тест зниження показав, що помилки, спричинені зниженням пам’яті, у групах PhG і групі verbascose показали значне зниження порівняно з помилками в групі моделі (P <>

Висновки.PhG послаблювали ознаки когнітивної дисфункції трансгенного гена APP/PSI. Крім того, PhG були активними компонентами для анти-AD активності H. Cistanches.

Цистанхе має анти-хвороба Альцгеймераефекти.

1. Фон

хвороба Альцгеймера(AD) — це вікове дегенеративне захворювання центральної нервової системи (ЦНС), що характеризується прогресуючою когнітивною дисфункцією та погіршенням пам’яті [1–3]. З процесом старіння та подовженням тривалості життя в усьому світі поширеність AD має тенденцію до зростання, що призводить до високої захворюваності, тривалого перебігу захворювання та високих витрат на лікування. На сьогоднішній день механізм АД все ще недостатньо визначений [4–7]. Таким чином, необхідно терміново дослідити механізм розвитку АД і відповідно розробити ефективний метод профілактики, контролю та лікування АД.

На сьогоднішній день досі не існує ефективного методу профілактики та лікування АД, і більшість засобів, що використовуються в клінічних умовах, використовуються для симптоматичного лікування. Засоби, схвалені FDA для лікування AD, включають інгібітори холінестерази (наприклад, донепезил) і збудливі амінокислотні рецептори (наприклад, мемантин), які, як вважають, послаблюють симптоми та покращують когнітивні/поведінкові здібності. Тим не менш, ефективність є незадовільною через обмежену відповідь на лікування після введення. [8–10]. Традиційна китайська медицина з довгою історією, заснованою на тисячолітньому досвіді, показує обширні джерела та кілька переваг порівняно з хімічними агентами, включаючи численні цілі, чудову безпеку, низькі побічні дії та придатність для тривалого застосування. Ці рослинні ліки мають перевагу над іншими агентами з точки зору лікування хронічних та стійких захворювань. Крім того, повідомлялося про високу ефективність цих препаратів при лікуванні AD [11–13]. Тому все більше зусиль було докладено для розробки нових агентів для лікування AD на основі лікарських трав на основі сучасних методів.

Клацніть на Cistanche UK для хвороби Альцгеймера

Herba Cistanches, відома китайською як Rou Cong-Rong, є диким видом, що перебуває під загрозою зникнення, і в основному поширений у посушливих землях і теплих пустелях північно-західного Китаю. Herba Cistanches застосовується як тонізуючий засіб та/або у формулі для лікування хронічних захворювань нирок, імпотенції, і старечий запор з двотисячолітньою історією. Хімічні компоненти Herba Cistanche в основному складаються з летких олій, нелетких фенілетаноїдних глікозидів (PhG), іридоїдів, лігнанів, альдитів, олігосахаридів і полісахаридів. Збільшується кількість досліджень, спрямованих на запобігання старінню, особливо на тваринних моделях з використанням A 25-35, D-галактози, Al2O3, хінолінової кислоти та скополаміну. Ці дослідження показали, що PhGs можуть сприяти пам’яті, ослабленню окислювального стресу в тканинах мозку, інгібування апоптозу нервових клітин і зниження ацетилхолінестерази [14–16].

У стародавніх рецептах H. Cistanche часто використовується для підтримки нирок і гальмування процесу старіння. У сучасні часи трава була схвалена як ефективна для лікування певних захворювань із задовільною безпекою. Крім того, він використовувався в осіб, які проживають у материковому Китаї [17]. У 2016 році CFSA схвалив безпеку харчових джерел H. Cistanchein, а потім, у 2018 році, Національна комісія з охорони здоров’я КНР оголосила, що він може служити харчовим джерелом і кандидатом для дослідження та розробки нових ліків [18, 19]. ]. Наскільки нам відомо, активними компонентами H. Cistanche є PhG, серед яких ехінакозид і вербаскоза, які є найбільш репрезентативними компонентами, були внесені до списку показників якості H. Cistanche Китайською фармакопеєю. Наприклад, PhG H. Cis-tanche може служити харчовою добавкою після очищення.

Наші попередні дослідження показали, що PhG, отриманий з H. Cistanche, був набагато більшим, ніж 80 відсотків [11]. Крім того, мономер PhG і вербаскоза мали високий вміст і служили основними діючими компонентами. Великі дослідження показали, що загальні PhG та мономер PhG (наприклад, вербаскоза та ехінакозид) показали значну ефективність проти AD. Наприклад, дослідження на тваринах показали, що загальні PhG, вербаскоза та ехінакозид можуть значно сприяти збільшенню здатності до навчання/запам’ятовування та когнітивної поведінки, знижувати регуляцію окислювального стресу в тканинах мозку, пригнічувати апоптоз нервових клітин і зменшувати утворення A в мозку та естеразну активність ацетилхоліну [20–25]. Експерименти in vitro показали, що PhG може впливати на клітинну модель AD, знижувати окислювальний стрес, видаляти вільні радикали, пригнічувати агрегацію амілоїду та зменшувати втрату нейронів і апоптоз нервових клітин [20, 25, 26]. Крім того, PhGs можуть послабити когнітивну дисфункцію та генерацію A 1-40 і A 1-42 у гіпокампі у трансгенних мишей APPswe/PSIdE9. Він може регулювати вихідні та нижні мішені інсулінового сигнального шляху, що потім покращує передачу сигналу інсуліну та регулює енергетичний метаболізм мозку, а також наступну здатність проти AD [27].

Моделі на тваринах мають вирішальне значення для досліджень, пов’язаних із захворюваннями, і розвитку фармації. Модель AD на основі трансгенних тварин вважається одним із найважливіших досягнень, оскільки трансгенна модель тварин AD могла імітувати AD на молекулярному рівні, що демонструє типові симптоми та ознаки. Крім того, ця модель перевершує інші моделі, пов'язані з AD, за стабільністю та надійністю. Дотепер не було створено жодної трансгенної моделі AD для дослідження впливу мономеру PhG на патогенез AD. У цьому дослідженні була створена мишача модель APP/PSI AD з подальшим визначенням анти-AD активності мономеру PhG, який називається вербаскоза, шляхом оцінки тесту гніздування, тесту водного лабіринту Морріса та тесту покрокового зниження.

2. Методи

2.1. Агент.

PhG H. Cistanche були виготовлені відповідно до нашого загальноприйнятого опису [20]. Якість, визначена УФ-методом, склала до 87,6%. Вміст ехінакозиду та вербаскози, визначений за допомогою ВЕРХ, становив 37,8% та 17,7% відповідно. Графічну формулу для PhG, вербаскози та ехінакозиду показано на малюнку 1. Стебла C. tubulosa (Schrenk) Wight були зібрані в жовтні 2016 року в Сіньцзяні, Китай. Рослина була ідентифікована Dr. Цзюньпін Ху. Усі ці ваучерні зразки (№ 201610) були збережені в Гербарії рослин Фармацевтичної школи Сіньцзянського медичного університету, Сіньцзян, Китай.

екстракт цистанки

2.2. Тварини.

Десять самців трансгенних мишей APP/PSI (3 місяці) і двадцять самок мишей (самці: 10; самки: 10, 20-30 г) були придбані в Модельному дослідницькому центрі тварин Нанкінського університету (SCXK 2015-0001, Нанкін, Китай). Тварин годували у спеціальних камерах без патогенів (SPF) у Центрі тварин Медичного університету Синьцзяна (SCXK 2011-0001, Синьцзян, Китай) на дієті SPF. Усі тварини мали вільний доступ до харчових продуктів і стерилізованої води. Протоколи дослідження були схвалені Комітетом з етики Сіньцзянського медичного університету.

2.3. Розповсюдження та ідентифікація трансгенних мишей APP/PSI.

У новонароджених трансгенних мишей ({{0}} тижнів) відрізали хвіст довжиною 0,5 см для виділення ДНК. Хвіст поміщали в пробірку Епендорфа з подальшим додаванням пролеази К до концентрації 400 мкг/ мл Згодом суміш перемішували протягом ночі при 55 градусах, а потім центрифугували при 13,000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 градусах, щоб отримати супернатант. Екстракцію ДНК проводили за допомогою комерційного набору відповідно до інструкцій виробника (Qiagen, Німеччина).

Для ампліфікації ДНК були розроблені специфічні праймери для АРР і PSI, як зазначено в таблиці 1. Ампліфікацію проводили в загальному об’ємі 20 мкл із застосуванням наступних умов: передатурація при 94 градусах протягом 5 хвилин, після чого 35 циклів денатурації при 94 градусах протягом 30 секунд 65 градусів протягом 35 секунд і 72 градуси протягом 45 секунд, а також 72 градуси протягом 3 хвилин. Отримані продукти ДНК піддавали електрофорезу в агаросегелі при постійній напрузі 100 В протягом 30 хв. Нарешті, зображення візуалізували за допомогою системи Chemi-Doc MP.

2.4. Групування.

Використовуючи рандомізацію, згенеровану програмним забезпеченням SPSS18.0, мишей AD випадковим чином розділили на (i) контрольну групу (n=10, миші C57BL/6J); (ii) група моделі (n=10); (iii) група донепезилу (n=10, 0.65 мг/кг, внутрішньошлункове введення); (iv) Групи PhG, які підлягають флаконному випаровуванню PhG у концентрації 250 мг/кг (n=10), 125 мг/кг (n=10) і 62,5 мг/кг (n {{16} }); та (v) група вербаскози (n=10, 125 мг/кг, внутрішньошлункове введення). Тварини, використані в групах (ii)-(v), були трансгенними мишами APPswe/PSIdE9. Промивання проводили у віці 6 місяців і тривало протягом 3 місяців з періодичністю один раз на день. Тваринам контрольної та модельної груп внутрішньошлунково вводили двічі дистильовану воду.

2.5. Тест вкладеності.

Тварин годували окремо протягом щонайменше 24 годин перед тестом у стандартній клітці (28 × 12 × 16 см), наповненій стерилізованою деревною стружкою товщиною 1 см. Спочатку час затримки відстежували на початку тесту, і було отримано загальний час 120. Оцінку вкладеності розраховували, як описано раніше [28].

2.6. Тест на водний лабіринт Морріса.

Апарат складався з круглого басейну, наповненого водою (23 ± 2 градуси С і 40 см завглибшки), розташованого в тестовій кімнаті з білими стінами та декількома сигналами на них. Платформу (діаметром 10 см) занурили на 1 см під поверхню води в один із чотирьох однакових квадрантів. Розташування платформи було фіксованим протягом випробувань, під час яких мишей окремо поміщали у воду обличчям до стінки басейну, щоб звести нанівець будь-який спрямований вплив. У 1-й і 2-й дні було проведено пробне тестування, включаючи 4 сеанси на день протягом 6 днів поспіль. Для кожного сеансу мишам дозволяли втекти, допливши до невидимої платформи, і затримку втечі (тобто час, необхідний для визначення місцезнаходження та підйому на платформу) і швидкість плавання реєстрували з граничним часом 60 с. Мишей, які не змогли знайти платформу протягом 60 секунд, направляли до платформи вручну і залишали на ній 10 секунд. На 11-й день пробний тест на отримання було проведено знову протягом останніх 6 послідовних днів після всіх обробок препаратом.

2.7. Тест на зниження.

Приблизно через 24 години після останнього введення лікарського засобу тварини повинні були перебувати в приміщенні та адаптаційному середовищі протягом 3 хвилин. Час встановлювався на 5 хвилин, а напруга становила 32 В. Після стимуляції миші намагалися стрибнути на платформу, а потім вимірювали час за наявності змін сигналу інфрачервоного детектора. Час затримки було вперше записано як час від платформи до дна щілини. У випадках відсутності стрибка з платформи час затримки був зафіксований як 5 хв. Потім реєстрували загальну частоту стимуляції після латентної стадії. Тест завершували через 2 дні. Навчання і пам'ять спостерігали в день 1 і день 2 відповідно. Етап затримки та частоту помилок реєстрували для кожної миші.

2.8. Статистичний аналіз.

Для статистичного аналізу було використано програмне забезпечення SPSS 18.0. Дані були представлені як середнє ± стандартне відхилення. Для міжгрупового порівняння використовували t-критерій Стьюдента. P < 0:05="" вважалося="" статистично="">

3. Результати

3.1. Ідентифікація генотипу.

Враховуючи те, що матрицею для ампліфікації слугувала геномна ДНК, у поколінні F1 було отримано дві смуги довжиною 344 і 608 кб відповідно. Це відповідало довжині гена АРР і гена PSI (рис. 2).

3.2. Оцінка гніздування.

П'ять оцінок були розділені на гніздовий бал (рис. 3). У контрольній групі поведінку гніздування спостерігали протягом кількох хвилин після розміщення паперів у клітку. У модельній групі дослідницька здатність мишей була порівняно зменшеною, і деякі тварини можуть навіть проявляти поведінку, пов’язану з тривогою, як-от догляд та миття обличчя, що спричинило затримку у гніздуванні. Більшість із цих тварин показали оцінку 1 або 2. Тим не менш, було помічено значне збільшення оцінки гніздування, яка відображалася залежно від часу після обробки PhG (рис. 4).

3.3. Вплив PhG на навігацію трансгенних AD мишей на латентній стадії.

З подовженням часу тренування час затримки в кожній групі показав значне зменшення. Перші 2 дні служили муштрою. На 3-й день латентний час у модельній групі показав значне збільшення порівняно з нормальним контролем (P < 0:01).="" подібним="" чином,="" у="" дні="" 4="" і="" 5="" час="" затримки="" в="" модельній="" групі="" показав="" значне="" збільшення="" порівняно="" з="" нормальним="" контролем="" (p="">< 0:05).="" на="" 3-й="" день="" латентний="" час="" у="" групах,="" які="" приймали="" донепезил,="" продемонстрував="" значне="" зниження="" порівняно="" з="" таким="" у="" групі="" моделі="" (p="">< 0:05).="" час="" затримки="" в="" групах="" phg="" продемонстрував="" значне="" зменшення="" залежно="" від="" дози="" порівняно="" з="" групою="" моделі="" (p="">< 0:05,="" таблиця="">

3.4. PhGs значно послабили сліди плавання трансгенних мишей AD.

У модельній групі сліди плавання мишей були типовими для маргінального пошуку. У групах PhG і verbascose сліди плавання мали лінійний тип або тип тенденції. Це вказує на те, що PhG може значно покращити спеціальну пам'ять трансгенних AD мишей APP/PSI (рис. 5).

3.5. Вплив PhG на спеціальні дослідження мишей AD.

Платформу було вилучено на 6-й день випробування водяного лабіринту, щоб дослідити спеціальні дослідницькі можливості. Частота проходження через платформу була зареєстрована протягом 60 с. Наші дані показали, що спостерігалося значне зниження частоти проходження через платформу в модельній групі порівняно зі звичайним контролем (P < 0="" :01).="" порівняно="" з="" модельною="" групою="" було="" помічено="" значне="" збільшення="" частоти="" проходження="" через="" платформу="" в="" групах="" phg="" та="" групі="" verbascose="" (p="">< 0:05,="" табл.="">

Оскільки платформа була розміщена в третьому квадранті, її назвали об’єктивним квадрантом. Більш тривале утримування в квадранті означало значне покращення навчання та пам’яті мишей після введення агентів. Наші дані показали, що спостерігалося значне зниження утримання в об’єктивному квадранті в модельній групі порівняно з нормальним контролем (P < {{{="" {2}}}}:01).="" порівняно="" з="" модельною="" групою="" було="" помічено="" значне="" збільшення="" утримання="" в="" групах="" phg,="" групі="" донепезилу="" та="" групі="" вербаскози="" відповідно="" (p="">< 0:05,="" таблиця="">

3.6. Вплив PhGs на тест Step-Down у трансгенних ADM мишей.

Час затримки в модельній групі був значно нижчим, ніж у контрольній групі (P < {{0}}:01).="" крім="" того,="" донепезил="" міг="" викликати="" значне="" збільшення="" латентного="" часу="" (p=""><0:01). подібним="" чином,="" групи="" phg="" і="" вербаскозна="" група="" також="" продемонстрували="" значно="" довший="" час="" затримки="" (p="">< 0:01).="" більше="" того,="" групи="" phg="" та="" групи="" verbascose="" показали="" значне="" зниження="" частоти="" помилок="" у="" тесті="" послаблення,="" викликаного="" порушенням="" пам’яті="" та="" навчання=""><0:01). these="" indicated="" that="" phgs="" contributed="" to="" the="" improvement="" of="" memory="" and="" learning="" capacity="" of="" transgenic="" ad="" mice="" (table="">

4. Обговорення

AD – це дегенеративне захворювання нервової системи, яке часто зустрічається у людей похилого віку. На жаль, точний механізм досі чітко не визначений, що певною мірою обмежує скринінг ліків. На сьогоднішній день були проведені численні дослідження розробки лікарських засобів з огляду на дослідження на тваринах, і доступно кілька моделей AD на тваринах, включаючи моделі на основі A 25-35, D-галактози, Al2O3, хінолінової кислоти та скополаміну. Ці моделі викликають когнітивну дисфункцію, але вони мають недоліки, включаючи пізній початок захворювання, значні індивідуальні відмінності та більшу тривалість експерименту, що заважало імітувати прогресуючі та дегенеративні ураження [29–31]. Завдяки прогресу трансгенної техніки у створенні тваринних моделей БА [27, 32, 33] було досягнуто великих успіхів у розумінні патогенезу БА разом із розробкою нових ліків. Тим не менш, патогенез БА досить складний, і лише виявлено кілька генів-мішеней, відповідальних за виникнення AD [34–36]. Виходячи з цього, трансгенна модель AD заслуговує на подальше застосування в розробці ліків. Ідентифікація сайтів генів, пов’язаних з AD, на основі трансгенної моделі AD за допомогою техніки схрещування сприятиме лікуванню AD у клінічних умовах і створенню нових моделей AD, що включають численні гени вірулентності.

У цьому дослідженні обрана модель APPswe/PSIDE9 значною мірою внесла в метаболізм APP, розвиток і патогенез AD, а також прогресування захворювання. Для проліферації та ідентифікації трансгенних мишей ми екстрагували ДНК із зразків крові та тканин відповідно. Для забору зразків крові, щоб забезпечити виживання тварин, зразок збирали з хвостової частини, що було важко зробити з меншим об’ємом зразка. Крім того, це може призвести до травмування тварин і вплинути на наступний аналіз. Навпаки, екстракцію ДНК із тканин зазвичай проводили через 6-8 тижні, що було легко виконати та спричиняло менше шкоди росту тварин. Крім того, не було статистичних відмінностей у вмісті та чистоті ДНК між цими двома методами. Тому для ідентифікації геному трансгенних мишей із тканини виділили ДНК.

Типовими клінічними проявами AD є прогресуюче зниження здатності до навчання та пам’яті. Таким чином, спостереження за навчанням і пам'яттю має вирішальне значення для оцінки ефективності препарату. У цьому дослідженні тест гніздування використовувався разом із тестом водяного лабіринту Морріса та тестом покрокового зниження, щоб дослідити вплив PhG на пам’ять і навчання трансгенних мишей APP/PSI. У навігаційному тесті час затримки в модельній групі показав значне збільшення порівняно з нормальним контролем (P < 0:05).="" тим="" часом="" було="" помічено="" значне="" зменшення="" латентного="" часу="" в="" групі="" донепезилу="" порівняно="" з="" модельною="" групою="" (p=""><0:05). порівняно="" з="" модельною="" групою="" латентний="" час="" у="" групах="" phg="" показав="" значне="" зниження="" залежно="" від="" дози="" (p="">< {{10}}:05).="" у="" спеціальному="" дослідженні="" було="" помічено="" значне="" зниження="" частоти="" проходження="" через="" платформу="" в="" модельній="" групі="" порівняно="" з="" нормальним="" контролем="" (p="">< 0:01).="" порівняно="" з="" модельною="" групою="" частота="" проходження="" через="" платформу="" в="" групах="" phg="" і="" донепезилу="" показала="" значне="" збільшення="" (p="">< 0:05).="" у="" понижувальному="" тесті="" частота="" помилок,="" спричинених="" порушенням="" пам’яті="" та="" навчання,="" значно="" зменшилася="" після="" введення="" phgs="" (p="">< 0:01).="" поведінковий="" тест="" показав,="" що="" інтерференція="" phg="" може="" значно="" покращити="" пам'ять="" і="" навчання="" app/psi="" трансгенних="" мишей="">

Традиційна фітотерапія з довгою історією широко використовується для лікування хронічних захворювань і рефрактерних розладів. В даний час розробка нових ліків від AD на основі фітотерапії була в основному зосереджена на екстракції активних компонентів та/або приготуванні сполуки. Порівняно з активним екстракційним компонентом мономерний компонент демонструє різноманітні переваги, такі як використання низької концентрації, легке дослідження цільових ділянок і краща ефективність. Вербаскоза є типовим мономером PhG, оскільки демонструє високий вміст і активність. У цьому дослідженні група вербаскози продемонструвала кращу здатність проти AD порівняно з групами PhG. Це підтримує дослідження та розробку засобів проти AD на основі вербаскози. H. Cistanches показують довгу історію використання їжі, починаючи з династії Хань. Сучасні методи стверджують, що H. Cistanches безпечні як харчові продукти. У цьому дослідженні ми схвалили ефективність H. Cistanches у сферах функціонального харчування, розробки ліків і охорони здоров’я, особливо у людей похилого віку та втомлених осіб.

Cistanche прокладає шлях для розробки нових ліків для лікування AD.

Для отримання додаткової інформації натисніть на зображення.

Тваринна модель має вирішальне значення для досліджень захворювань і розробки ліків. Нещодавно трансгенний метод був використаний для встановлення моделі AD, яка може імітувати патогенез AD на молекулярному рівні разом із типовими симптомами та життєвими ознаками. Ці моделі показали свою ефективність щодо стабільності та надійності порівняно з іншими моделями AD. У цьому дослідженні використовується модель трансгенних мишей APP/PSI, яка, як відомо, імітує патологічні процеси БА, демонструє ознаки поведінкової дисфункції, когнітивних розладів, сенільних бляшок, нейрофібрилярних клубків і смерті нейронів [37–39]. У цьому дослідженні ми вперше використали трансгенних ADmice для дослідження впливу PhG на навчання та пам’ять, що може надати корисну інформацію для дослідження та розробки засобів проти AD на основі PhG.

Таким чином, PhGs можуть послабити особливості когнітивної дисфункції трансгенного гена APP/PSI. Наше дослідження підтвердило, що PhG були активними компонентами для анти-AD активності H. Cistanches. Це може прокласти шлях для розробки нових ліків для лікування AD.