Модель дрозофіли для вивчення кишкової мікробіоти в поведінці та нейродегенеративних захворюваннях. Частина 1

Анотація:

Все більше доказів свідчать про те, що кишкова мікробіота пов’язана з кількома фізіологічними процесами та розвитком захворювань у ссавців; однак основні механізми залишалися невивченими в основному через складність мікробіому кишечника ссавців. Плодова мушка, Drosophila melanogaster, є цінною тваринною моделлю для вивчення взаємодії між мікробіотою хазяїна та кишечника в трансляційних аспектах.

Тварини і пам'ять - це дуже цікавий зв'язок. Від відданості собак до розуму мишей, спогади тварин давно викликають подив і цікавість. Хоча тварини відрізняються за тим, наскільки добре вони запам’ятовують, їхня пам’ять дає підстави зробити висновок, що тварини не лише мають сильний інстинкт самозбереження, але й здатні вчитися на досвіді, що означає, що пам’ять важлива.

Перш за все, собаки та коти є двома улюбленцями, які найбільше підходять людям. Усі вони дуже розумні та мають гарну пам’ять. Вони можуть запам'ятовувати запах і звук власника та навколишнього середовища, а також можуть виражати емоції за допомогою певної поведінки. Сила цієї пам’яті відображається в здатності собак і котів знаходити своїх втрачених господарів. Навіть якщо минуло багато часу з тих пір, як власник пішов, поки є місця та запахи, які можна ідентифікувати, вони продовжуватимуть пошуки.

По-друге, миші також є одними з тварин з особливо високим IQ. Пам'ять мишей набагато краща, ніж здається. Вони можуть запам'ятати, куди вони йдуть, де їхня їжа, свою територію, а також вони можуть розпізнавати та запам'ятовувати людей або тварин, які були для них небезпекою. Експерименти деяких дослідників виявили, що миші також розпізнають навколишнє середовище та реагують на нього за допомогою музики та тонів, що показує, що пам’ять тварин включає сенсорний, емоційний і логічний інтелект.

Взагалі пам'ять тварин принесла людям багато сюрпризів і відкриттів. Вони можуть не тільки захистити себе, але й побудувати тісніші довірчі відносини з людьми. Крім того, тварини надихнули на різноманітні експерименти та дослідження, які допомогли вченим краще зрозуміти природу та механізми пам’яті. Тож захоплюймося розумом і пам’яттю тварин, подивуймося їхньому розумному й гнучкому мозку. Видно, що пам’ять дуже важлива, будь то людина чи тварина. Цистанхе може значно покращити нашу пам'ять, оскільки цистанхе є традиційним китайським лікарським матеріалом з багатьма унікальними ефектами, одним із яких є покращення пам'яті. Ефективність м’ясного фаршу пов’язана з різноманітністю активних інгредієнтів, які містяться в ньому, включаючи карбонову кислоту, полісахариди, флавоноїди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку через різні канали.

Клацніть короткочасну пам'ять про те, як її покращити

Наявність у дрозофіли потужних генетичних інструментів і ресурсів дозволила вченим розгадати механізми, за допомогою яких кишкові мікроби впливають на фізичну форму, здоров’я та поведінку своїх господарів.

Моделі дрозофіл широко використовувалися не лише для вивчення поведінки тварин (тобто залицяння, агресії, сну, навчання та пам’яті), але й деяких нейродегенеративних захворювань, пов’язаних із людиною (тобто хвороб Альцгеймера та Паркінсона), у минулому. Цей огляд вичерпно підсумовує поточне розуміння кишкової мікробіоти дрозофіли та її вплив на поведінку мух, фізіологію та нейродегенеративні захворювання.
Ключові слова:

Drosophila melanogaster; мікробіота; кишково-мозкова вісь; поведінки; навчання і пам'ять; нейродегенеративні захворювання.

1. Введення
Плодова мушка Drosophila melanogaster є важливою експериментальною твариною, яка використовується в біомедичних дослідженнях. Плодова мушка була вперше використана як експериментальний організм Каслом у 1901 році та Морганом у 1909 році для генетичних досліджень. Оскільки дрозофіла використовувалася як модельний організм більше століття, було розроблено кілька методів для вирішення конкретних наукових питань.

Дрозофіла має відносно короткий термін життя і складну поведінку. Наявність потужних інструментів для генетичних маніпуляцій у конкретних тканинах чи органах дозволила вченим вивчити молекулярні механізми регуляції поведінки дрозофіли, такі як адаптивна реакція на навколишнє середовище, а також вроджені (залицяння, агресія, сон тощо) [1 –3] та навченої поведінки (нюхова пам’ять і пам’ять залицяння) [4–6].

Протягом останніх 20 років Drosophila використовувалася як ідеальна модель in vivo для вивчення нейродегенеративних захворювань, таких як хвороба Альцгеймера (AD) і хвороба Паркінсона (PD) [7,8]. Видатні сигнальні шляхи, які регулюють ріст і функції нейронів у людини, збережені у дрозофіли, що дозволяє використовувати цей модельний організм для вивчення нейродегенеративних захворювань людини.

Наприклад, модель AD у дрозофіли, розроблена шляхом ектопічної експресії білка A 42 людини в мозку мухи, демонструє клінічні симптоми, пов’язані з пацієнтами з AD, такі як залежне від віку порушення короткочасної пам’яті, дефекти навчання, підвищене неспання та порушення сну [8]. ,9]. Це свідчить про те, що Drosophila може бути використана як ідеальна модель in vivo для скринінгу нових ліків для лікування AD.

Все більше доказів підтверджує думку про те, що добре збалансована кишкова мікробіота є важливою для здоров’я людини [10,11]. Втручання у склад кишкової мікробіоти може негативно вплинути на здоров’я та фізіологію хазяїна, що призводить до різних неврологічних захворювань, таких як поведінкові аномалії, нейродегенеративні захворювання та нейропсихічні розлади [12–14].

Дослідження показали, що кишкові бактерії можуть виробляти кілька нейромедіаторів, включаючи дофамін, гамма-аміномасляну кислоту (ГАМК) і серотонін [15]. Крім того, двонаправлений перехресний зв’язок між кишечником і центральною нервовою системою (ЦНС) опосередковується кишковою мікробіотою [16,17]. Нещодавні дослідження показали, що зміни у складі кишкової мікробіоти пов’язані з певними неврологічними захворюваннями [18–20].

Проте детальний механізм того, як кишкові бактерії регулюють прогресування захворювання, впливаючи на зв’язок уздовж осі кишечник-мозок, потребує подальшого дослідження.

За останні 20 років більшість досліджень мікробіоти кишечника використовували моделі гризунів для дослідження ролі осі мікробіота-кишечник-мозок. Однак універсальний організм, дрозофіла, є потужною дослідницькою моделлю, яка дозволяє вченим досліджувати механізми, за допомогою яких кишкові мікроби впливають на функції мозку (рис. 1а, б). Мікроби можуть бути генетично помічені флуоресцентним білком, таким чином можна візуалізувати їх розподіл у травному тракті дрозофіли (рис. 1c) [21,22].

Рисунок 1. Порівняння травного тракту людини та дрозофіли. (а) Травний тракт людини та дрозофіли. Функціональні відділи шлунково-кишкового тракту у дрозофіли та людини схожі та включають стравохід, передню та задню середню кишку (тонка кишка), товсту кишку (задня кишка) та шлунок (зріз). (b) Субрегіони травного тракту дрозофіли, що зображують передню, середню та задню кишки.

Передня кишка містить зріз і передшлунок. Середня кишка далі поділяється на ділянки R1-R5. (c) Lactobacillus, помічену GFP, годували дорослою дрозофілою, і конфокальні зображення показують розподіл Lactobacillus (зелений) у різних областях травного тракту. Збільшені зображення кадрування, R2, R4 і R5 областей показані в c1 до c4. Зразок був імунологічно забарвлений антитілом проти інтегрин-PS (червоний). Масштабна шкала, 500 мкм.

2. Вроджена поведінка дрозофіли
Вважається, що вроджена поведінка закладена в мозку тварин і генетично закодована, і для належного виконання не потрібен попередній досвід. Вроджена поведінка добре адаптується до внутрішнього стану тварин і зовнішнього середовища, що дозволяє тваринам модифікувати свою поведінку відповідно до різних умов середовища [23].

Дрозофіла є чудовою тваринною моделлю для вивчення молекулярних механізмів вродженої поведінки людини, оскільки існує певна подібність у поведінкових фенотипах мух і людей. У дрозофіли досліджено різноманітні вроджені форми поведінки, такі як шлюбна поведінка, агресивна поведінка, сон/рухова активність та поведінка, пов’язана з температурою [3,24–28].

Крім того, геном дрозофіли приблизно на 60% гомологічний геному людини, і приблизно 75% генів, пов’язаних із захворюваннями людини, також мають гомологи у мух [29]. Наприклад, у поведінці уві сні сигналізація дофаміну регулює неспання не лише у дрозофіли, але й у людини [30]. Тут ми представляємо деякі ключові вроджені форми поведінки дрозофіли та обговорюємо їх зв’язок із кишковою мікробіотою (таблиця 1).

2.1. Кишкова мікробіота та шлюбна поведінка

Поведінка спарювання у самців дрозофіл включає ряд кроків: просування до самки (орієнтація), переслідування самки (слідування), торкання живота самки (постукування), одностороннє розгинання крил і вібрація (спів), облизування геніталій самки, захоплення вгору до спини самки (спроба копуляції), і остаточна копуляція [3,26]. Один самець мухи намагається спаровуватися з однією незайманою самкою, і вимірювання сексуального ентузіазму самця до самки називається індексом залицяння (CI).

CI — час, витрачений самцем дрозофіли на залицяння, поділений на загальний час експерименту. Добре відомий нейронний ланцюг, який регулює шлюбну поведінку, складається з безплідних (fru)-експресуючих нейронів. Нейрони, що експресують fru, включаючи первинні сенсорні аференти та центральні інтернейрони, такі як кластерні нейрони P1, які запускають залицяння, можуть утворювати основну частину чоловічого контуру залицяння [50].

Принаймні три дослідження показали, що кишкова мікробіота не впливає на поведінку залицяння дрозофіл [33,35,51]; однак слід зазначити, що в кожному дослідженні використовувалися різні мухи дикого типу та застосовувалися різні методи для створення вільних від мікробів мух.

На відміну від цих досліджень, Heys et al. показали, що кишкова мікробіота протидіє стратегії аутбридингу самців, змінюючи статеві сигнали самки, що призводить до зменшення передачі сперми від самців мух [31]. Аутбридинг у Drosophila збільшує генетичне різноманіття потомства, посилює імунний захист і може бути підданий впливу мікробіоти хазяїна [31,52].

Попереднє дослідження показало, що протягом 1- і 3- днів після спарювання змінюється модель експресії генів у тканині голови мухи, що впливає на поведінку мухи, включаючи харчову поведінку, метаболізм і виробництво яєць (після -шлюбна поведінка) [53]. Дельбаре та ін. провели широкомасштабний аналіз RNA-seq незайманих і поєднаних аксеничних/звичайних мух і повідомили, що у поєднаних самок транскрипти, задіяні в регуляції репродукції та нейронних функцій, відрізняються великою кількістю залежно від мікробіоти самок [32].

Крім того, стан мікробіоти самця впливав на плідність як у звичайних, так і в аксенічних самок; однак це вплинуло на профілі транскрипції лише у аксеничних, але не у звичайних жінок.

2.2. Кишкова мікробіота та агресивна поведінка

Агресивна поведінка, яка широко спостерігається у тваринному світі, є критичною для виживання та розмноження [54]. У дрозофіли агресивна поведінка включає погрозу крилом, боксування, постукування передньою ногою, випади та удари головою [2,33]. Jia та ін. описав протокол аналізу агресивної поведінки мух.

У цьому аналізі двох мух-самців або самок (віком 5–7 днів) поміщають у бойову камеру, яку потім швидко накривають скляним скельцем розміром 20 мм × 20 мм. Сутичка протягом 30 хвилин записується на камеру. Агресивна поведінка аналізується шляхом підрахунку кількості випадів у самців і ударів головою у самок і оцінки частоти випадів/затримки бою. Частота випадів визначається як кількість випадів за хвилину після початку випаду, тоді як латентність бою визначається як тривалість між початком запису та першим випадом [33].

Дослідження показують, що агресивна поведінка узгоджується із зоровими, нюховими, смаковими, механосенсорними та слуховими сигналами. Ці входи інтегруються в грибоподібне тіло головного мозку (MB), бічні роги та центральні комплексні області, і, нарешті, керують моторними виходами через м’язи крил і ніг.

Дослідження також показують, що нейротрансмітери та нейропептиди, такі як октопамін, серотонін, дофамін, ацетилхолін і нейропептид F (NPF), також відіграють важливу роль в агресивній поведінці [54].

Недавні дослідження показали, що специфічна кишкова мікробіота пов’язана з агресивністю мух. Jia та ін. використовували гіпохлорит натрію та ряд протоколів промивання для створення аксенічних мух [33].

Порівняно зі звичайними мухами (Canton-S), аксенічні мухи демонстрували меншу агресивну поведінку між самцями, що вказує на те, що у вільних мух агресія між самцями зменшилася. Крім того, коменсальні бактерії, такі як Acetobacter, Lactobacilli та Enterococci, сприяли агресивній поведінці аксенічних мух шляхом повторної мікробної колонізації. Автори також повідомили про зниження рівня октопаміну на 73% у вільних від мікробів мух, а генетична маніпуляція активністю октопамінергічних нейронів відновила агресивну поведінку у мух-аксеників.

Те ж дослідження також повідомило про два ключових чинники, що беруть участь у регуляції агресії через експресію октопаміну. Одним з них був критичний період розвитку під час личинкової стадії (48–98 годин після відкладання яєць), у якому доповнення багатою дріжджами дієтою відновлювало агресивну поведінку аксенічних мух. Іншим фактором було харчування, оскільки воно також важливо для експресії октопаміну, і забезпечення належного харчування аксеничних мух нормалізувало агресивну поведінку.

Ці результати демонструють, що кишкова мікробіота та харчування під час критичного періоду розвитку впливають на експресію октопаміну, який регулює агресію у дорослих чоловіків [33].
2.3. Кишкова мікробіота, сон і рухова активність
Система Drosophila Activity Monitor (DAM) використовується для вивчення сну та поведінки пересування у мух [55]. У цьому аналізі мухи містяться в умовах циклу 12 годин світла/12 годин темряви [56,57].

Апарат DAM складається з трьох основних компонентів: (1) скляна трубка, в якій може вільно рухатися одна муха, (2) інфрачервоний промінь, який спрямовується через середину скляної трубки, і (3) комп’ютер для запису поведінки результати [55]. В аналізі поведінки сну/локомоторної поведінки система DAM реєструє розриви інфрачервоного променя через мух, які ходять у скляних трубках, щоб виявити сон або пересування [58].

Добре відома схема поведінки уві сні в мозку дрозофіли складається з циркадних нейронів. Світло стимулює групу великих вентрально-латеральних нейронів (l-vLN), які вивільняють пігмент-диспергуючі фактори (PDF), щоб стимулювати групу малих вентрально-латеральних нейронів (s-vLN). Нарешті, s-vLNs регулюють центр управління руховим рухом мозку, еліпсоїдні тіла, щоб перешкоджати поведінці уві сні.

І l-vLN, і s-vLN експресують рецептори ГАМК, які можуть пригнічувати неспання через ГАМКергічні нейрони, що сприяють сну. MB також є важливою областю мозку, яка регулює сон через каталітичну субодиницю протеїнкінази А, ферменту, який активується відповідним для сну шляхом цАМФ [59]. Локомоторна активність важлива для виживання дрозофіли і контролюється гормонами, які також можна аналізувати за допомогою системи DAM. Кінг та ін.

нещодавно повідомили про наявність пептидергічної ланцюга, який пов’язує циркадний годинник з руховою активністю. s-vLN вивільняють PDF-файли, які стимулюють тактові нейрони DN1, які, у свою чергу, стимулюють DH44-позитивні нейрони pars intercerebralis (PI). DH44-позитивні PI-нейрони стимулюють hugin-позитивні SEZ-нейрони, які, нарешті, вивільняють нейропептид hugin до моторного кола у вентральному нервовому канатику, який регулює рухову активність у дрозофіл [60].

Вплив кишкової мікробіоти на поведінку дрозофіли уві сні залишається неясним. Selkrig та ін. використовували ізогенний штам D. melanogaster Canton-S, вільний від Wolbachia, як мух дикого типу, а також провели аналізи сну та рухової поведінки. Автори створили вільних від Wolbachia мух Canton-S, промиваючи яйця NaClO, і назвали перше покоління F1, а наступне покоління F2.

Їхні дані показали, що ані вільні від мікробів мухи F1, ані вільні від мікробів F2 не демонструють значних змін у поведінці уві сні. Крім того, незважаючи на те, що вільні від мікробів мухи F1 не показали жодних змін у руховій поведінці, вільні від мікробів мухи F2 продемонстрували незначне збільшення рухової активності порівняно зі звичайними мухами [35].

Ще одне дослідження Silva et al. використовували Canton-S і W1118 як мух дикого типу та використовували NaClO для промивання яєць мух протягом 3–5 хвилин для створення аксенічних мух [61]. Їхні результати показали, що порівняно зі звичайними мухами мухи-аксеники мали тенденцію спати довше і демонстрували меншу відновлюваність сну після депривації [34]. Однак стан кишкової мікробіоти мух мав незначний вплив на циркадіанну ритмічність рухової активності.

Сільва та ін. і Selkrig et al. зосереджено на розумінні ролі мікробіоти кишечника в регуляції сну та пересування дрозофіл. Шреттер та ін. запропонував можливий механізм пояснення зв’язку між кишковою мікробіотою та рухом/сном. У цьому дослідженні штам Oregon-R використовувався як дикий тип, і мухи отримували дієту, доповнену антибіотиками, для створення мух, які отримували антибіотик (ABX).

Результати показали, що мухи ABX мають збільшену швидкість ходьби, активнішу повсякденну активність і менший сон вдень. Автори також повідомили, що фермент ксилозоізомераза, який каталізує оборотну ізомеризацію деяких цукрів, присутніх у Lactobacillus brevis, знижує рухову активність шляхом модуляції метаболізму цукру через стимуляцію октопамінергічних нейронів; однак цей фермент не впливає на сон [36].

2.4. Кишкова мікробіота та поведінка, пов’язана з температурою

Температура навколишнього середовища сильно впливає на фізіологію ектотермів, таких як дрозофіли. Температурна поведінка (мухи уникають гарячого чи холодного середовища) і толерантність до високих чи низьких температур важливі для виживання дрозофіли. Аналіз градієнта температури використовується для вивчення температурних переваг у мух.

У різних дослідженнях використовувалися різні пристрої з температурним градієнтом, але основний принцип той самий: одна сторона пристрою має низьку температуру, а інша — високу. Розміщуючи алюмінієвий лист між двома сторонами, створюється градієнт температури. Мух поміщають на алюмінієвий лист і їм дозволяють вибрати бажану температуру [62,63].

Існує два різні способи вивчення поведінки уникнення температури: один полягає у використанні аналізу температурного градієнта (описаного вище), а інший полягає у використанні аналізаторної машини з двома варіантами.

Аналізна машина з двома варіантами аналізу містить чотири квадранти, які побудовані за допомогою термоелектричного охолоджувального чіпа та алюмінієвого листа. При виконанні аналізу уникнення температури апарат для аналізу з двома варіантами встановлює постійну температуру (25 ◦C) в одному наборі діагональних квадрантів, а інші діагональні квадранти встановлюються на експериментальну температуру, яка залежить від аналізу [64]. .

Відновлення холодової коми — це протокол для вивчення температурної толерантності. У цьому аналізі мух занурюють у водно-гліколеву ванну з температурою -3,5 ◦C (залежно від плану експерименту) для холодового стресу або піддають температурі 38,5 ◦C (залежно від дизайну експерименту) для теплового стресу, після чого мухам дають відновитися та вимірюють час відновлення [37,65].

Нещодавні дослідження показали, що кишкова мікробіота сильно впливає на температурну стійкість плодових мушок. Генрі та ін. генерували аксенічні мухи шляхом дехлорування, під час якого яйця мух занурювали в 2,7% гіпохлорит на 2 хв, 70% етанол на 2 хв і, нарешті, двічі промивали в автоклавній воді [37]. Після дехлорування мух вирощували на автоклавній їжі. Їхні результати свідчать про те, що морозостійкість аксенічних мух є недостатньою порівняно з звичайними мухами. Однак термостійкість не була порушена у аксеничних мух. Це свідчить про те, що порушення мікробіоти знижує здатність справлятися з холодовим стресом [37]. Дослідження інших видів дрозофіл, таких як D. subobscura, свідчать про те, що звичайні мухи піддаються дії м’якої спеки (<34 ◦C) exhibit higher thermal tolerance than axenic flies [38].

For more information:1950477648nn@gamil.com