Характерна експресія генів Toll-подібних рецепторів і гліальна відповідь у різних областях мозку природного скрейпі. Частина 2

2.2. Нейропатологічні особливості в гіпокампі овець, природним чином інфікованих Serapie

У заражених скрепі та контрольних овець чотири наступні області гіпокампу були досліджені більш детально на наявність усіх патологічних маркерів: пірамідні клітинні шари CA1, CA3 та CA4, а також SLM (рис. 3).

Недавні дослідження показали, що пірамідальний шар клітин відіграє важливу роль у пам’яті. Пірамідний клітинний шар є нейроном мозку, головним чином відповідальним за сприйняття зовнішнього середовища та зберігання пам'яті.

Під час навчання та пам’яті шар пірамідних клітин вивільняє деякі нейромедіатори, які можуть стимулювати зв’язок між нейронами, тим самим покращуючи збереження та відновлення пам’яті. Крім того, пірамідальний клітинний шар також може відсіювати та інтегрувати інформацію в процесі навчання та пам’яті, допомагаючи нам швидко оволодівати новими знаннями та навичками.

Дослідження також виявили, що функція та стан пірамідного клітинного шару мають великий вплив на ефективність пам’яті. Якщо шар пірамідних клітин пошкоджений або сильно навантажений, це може сильно вплинути на пам’ять. Тому нам потрібно приділяти увагу здоров’ю та підтримці шару пірамідних клітин, щоб підтримувати хороші здібності до навчання та пам’яті.

Рекомендації щодо здоров’я та підтримки шару пірамідних клітин включають дієту, фізичні вправи та сон. Наприклад, дієта, багата жирними кислотами та антиоксидантами, може сприяти зміцненню здоров’я шару пірамідних клітин; регулярні фізичні вправи можуть підвищити функцію і стійкість нервової системи; і хороші звички до сну можуть допомогти зменшити навантаження на шар пірамідних клітин і сприяти консолідації та відновленню пам’яті.

Коротше кажучи, пірамідний шар клітин відіграє важливу роль у навчанні та пам’яті. Ми повинні приділяти увагу здоров’ю та підтримці шару пірамідних клітин, щоб покращити наші здібності до навчання та пам’яті.

Клацніть «Знай, як покращити короткочасну пам’ять».

У той же час ми повинні уникати надмірної втоми та стресу, забезпечувати мозку достатній час для відпочинку та відновлення, а також дозволяти нашій пам’яті постійно вдосконалюватися та вдосконалюватися.

Видно, що нам потрібно покращувати пам'ять. Цистанхе може значно покращити пам’ять, оскільки має антиоксидантну, протизапальну та антивікову дію, що може допомогти зменшити окислення та запальні реакції в мозку, тим самим захищаючи здоров’я нервової системи. Крім того, Cistanche також може сприяти зростанню та відновленню нервових клітин, тим самим покращуючи зв’язок і роботу нейронної мережі.

Ці ефекти можуть допомогти покращити пам’ять, здатність до навчання та швидкість мислення, а також можуть запобігти виникненню когнітивної дисфункції та нейродегенеративних захворювань.

Рисунок 3. Розподіл нейропатологічних уражень (HE), відкладення PrPSc, астрогліозу (GFAP) і мікрогліозу (Iba1) у чотирьох різних областях гіпокампу в заражених скрейпі та контрольних овець: шари пірамідних клітин CornuAmmonis (CA) 1, 3 і 4 , а також Lacunosum-Moleculare (SLM).

Графіки зображують напівкількісні значення оцінки для кожного аналізованого параметра. (A) Легкі губчасті зміни спостерігалися в усіх проаналізованих областях гіпокампу. (B) Внутрішньонейрональний малюнок PrPSc (L42) в CA1, CA3 і CA4 і поширений дрібнозернистий малюнок PrPSc в SLM. (C) Підвищене фарбування Iba1 у овець, заражених скрейпі, порівняно з контрольними.

Збільшені зображення показують деякі спостережувані морфологічні відмінності. (D) Ознаки помірного реактивного астрогліозу у овець, заражених скрейпі, порівняно з контролем. Оцінки варіюються від 0 (негативний) до 5 (максимальна інтенсивність).

Значні відмінності були визначені за допомогою t-критерію Стьюдента або U-критерію Манна–Уїтні для даних із нормальним і ненормальним розподілом відповідно. * p < 0.05, ** p < 0,01. Масштаб=200 мкм.

Спонгіоз у гіпокампі був дуже легким, і випадкові вакуолі спостерігалися в CA1, CA3 і CA4, а також у SLM (рис. 3A). Ця обмежена втрата нейронів контрастувала з рідкісним, але локально інтенсивним відкладенням PrPSc в CA1 і CA3 (рис. 3B).

Дуже помірне фарбування PrPSc спостерігалося в CA4 і SLM. У цих областях мозку спостерігалися чіткі моделі PrPSc (рис. S2). У той час як інтранейрональні та асоційовані з нейропілами патерни PrPSc переважали в CA1 і CA3, інтрагліальне відкладення було основним морфологічним патерном, що спостерігався в SLM.

Помірні інтранейрональні та асоційовані з нейропілами патерни PrPSc постійно спостерігалися в CA4, хоча інтенсивність була нижчою, ніж у CA1 і CA3. Iba1 конститутивно експресувався та рідко розподілявся в контрольних зразках. Навпаки, виражений мікрогліоз спостерігався в СА1, СА3 і СА4, а також у SLM у овець, інфікованих скрепі.

Однак морфологічні особливості мікроглії суттєво відрізнялися між цими ділянками мозку. У пірамідному шарі CA1 більшість мікрогліальних клітин показали короткі відростки зі збільшеними клітинними тілами, характерними для гіпертрофічної морфології.

У CA4 клітини мікроглії також були гіпертрофованими, але демонстрували довші та тонші гілки, ніж клітини мікроглії CA1. Тим часом гіпертрофічна мікроглія в SLM демонструвала короткі та тонкі відростки з набряклими клітинними тілами. Навпаки, у CA3 ми спостерігали вищезгадану морфологію стрижневої мікроглії [42].

Ці мікрогліальні клітини мали подовжені клітинні тіла з довгим паралельним первинним відростком, орієнтованим перпендикулярно шару пірамідних клітин CA3, і допоміжними гілками, які були коротшими за довгі первинні відростки.

Імунне фарбування GFAP було значно посилене в шарах пірамідних клітин CA1 і CA3 від овець, інфікованих скрейпі, порівняно з контрольними овець. Цікаво, що показники PrPSc були найвищими в CA1 і CA3. Жодних відмінностей не спостерігалося в пірамідальному клітинному шарі CA4 або SLM.

2.3. Невропатологія інфікованих скрейпі мишей tg338

Ті самі нейропатологічні маркери спонгіозу, відкладення PrPSc, мікрогліозу та астрогліозу, проаналізованих у овець, досліджували в таламусі клінічно уражених мишей tg338, які були інтрацеребрально інфіковані скрейпі (рис. 4).

Порівняно з контролем спостерігалися значні відмінності (p < 0,05) у спонгіозі в таламусі мишей, інфікованих скрейпі, у яких вакуолі були обмежені нейропілем.

Відкладення PrPSc були широко поширені на рівні цитоплазми та нейропіла. Оцінка гліозу виявила значні відмінності в імунному фарбуванні Iba1 та GFAP між інфікованими скрейпі та контрольними мишами, причому як астроцити, так і мікроглія мають гіпертрофічну морфологію.

Накопичення PrPres також було оцінено за допомогою WB у всіх мишей, інфікованих скрейпі, виявивши постійну структуру смуги 19 кДа (рис. 5). Інтенсивність сигналу PrPres у мишей tg338 була більш однорідною серед особин, ніж у овець, як і очікувалося для експериментального зараження, у якому контролювали дозу, вік інокуляції та час умертвіння.

Жодного сигналу не було виявлено у контрольних мишей, яким інокулював нормальний гомогенат головного мозку, що узгоджується з негативними результатами IHC.

Рисунок 4. Зрізи таламуса інфікованих скрейпі (внутрішньомозкова інокуляція) та відповідних за віком контрольних мишей tg338, імунофарбованих для оцінки спонгіозу (гематоксилін-еозин), відкладення PrPSc (антитіло R486), астроцитів (гліальний фібрилярний кислий білок; GFAP) і мікроглії (іонізований кальцій) -зв'язуюча молекула-адаптор-1; (A, E) Важкі губчасті ураження, розташовані в основному в нейропілі інфікованих скрейпі порівняно з контрольними мишами. (B, F) Декілька PrPSc-позитивних нейронів помітні у мишей, інфікованих скрейпі, але відсутні у контрольних. (C, G) Активована мікроглія демонструє більш інтенсивне імунне забарвлення та товсті процеси у мишей, інфікованих скрейпі, порівняно з контрольною групою. (D, H) Посилення астрогліозу з гіпертрофованими клітинними тілами та процесами у мишей, інфікованих скрейпі, порівняно з контрольною групою. Оцінки варіюються від 0 (негативний) до 5 (максимальна інтенсивність).

Істотні відмінності були визначені за допомогою U-тесту Стьюдента Манна–Уїтні для даних з нормальним і ненормальним розподілом відповідно. * p < 0.05,** p < 0,01. Масштаб=200 мкм.

Малюнок 5. Вестерн-блот виявлення накопичення PrPres у ЦНС клінічно уражених мишей tg338, яким інтрацеребрально інокульовано скрейпі, порівняно з відповідними контролями.

Для адекватного порівняння завантажували еквівалентні кількості білка та проводили імуноблоти з використанням моноклонального антитіла SHA31. Маркери молекулярної маси (кДа) вказані на лівій стороні імуноблоту.

Про посилення експресії TLR у відповідь на Prpsc раніше повідомлялося в експериментальних умовах in vivo та in vitro. Таким чином, після характеристики присутності основних пріон-індукованих нейропатологічних змін у ЦНС у контексті природного та експериментального захворювання, ми дослідили чи корелюють ці зміни зі змінами в експресії гена TLR.

З цією метою ми виконали qPCR, використовуючи зразки з чотирьох областей мозку овець, щоб оцінити експресію MyD8g і Trif, двох основних адаптерних білків, залучених до сигналізації TLR; CD36, рецептор поглинача, який співпрацює з TLR; і мРНК TLR.

Крім того, ми вимірювали рівні чотирьох про- і анти-. запальних цитокінів у таламусі та гіпокампі овець для подальшої оцінки запальної відповіді. У мишей tg338 ми вимірювали рівні мРНК MyD88 і TLR1-9 у таламусі.

Гени, для яких спостерігалися суттєві відмінності щодо контролю, і відповідні зміни кратності, наведені в таблиці $1, а значення ACt для контрольної групи та овець, заражених скрейпі, представлені на малюнку $3.

Кількість змінених генів зменшувалася в каудально-ростральному напрямку. Довгастий мозок овець, інфікованих скрейпі, був областю, в якій спостерігалися найбільші зміни в експресії гена TLR (рис. 6). У цій області експресія TLR2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 і CD36 була значно вищою (p < 0.01) у тварин, інфікованих скрейпі, порівняно з контрольними тваринами.
У таламусі TLR6, MyD88 і CD36 значно підвищувалися в групі інфікованих скрейпі (p < 0.05), тоді як TLR2 і TLR3 демонстрували тенденцію до посилення (p < {{12} }.1). У фронтальній корі головного мозку (крайня ростральна ділянка) TLR4 і CD36 були єдиними генами, що мають підвищену експресію (p <0,05).

Примітно, що контрастні моделі експресії були виявлені в гіпокампі овець, інфікованих скрепі, у яких TLR2 і MyD88 були знижені (p < 0.01), а TLR1 продемонстрував тенденцію до зниження регуляції (p < 0,1). .

Крім того, гіпокамп був єдиною областю, в якій експресія CD36 не була підвищена. Загалом, TLR4 був геном, який був найбільш активованим у інфікованих скрепі овець порівняно з контрольною групою у всіх чотирьох областях мозку, хоча суттєвих відмінностей у таламусі чи гіпокампі не спостерігалося через внутрішньоіндивідуальну мінливість.

Аналіз рівня цитокінів виявив надлишкову експресію TGF-, IL-10 та IL-6 у таламусі овець, інфікованих скрейпі, порівняно з овець контрольної групи, але жодних змін у гіпокампі (рис. 7).

Рисунок 6. Експресія генів TLR 1-10, MyD88, Trif і CD36 у довгастому мозку (A), таламусі (B), лобовій корі (C) і гіпокампі (D) контрольної групи та овець, інфікованих скрейпі .

Дані представлені у вигляді середнього кратного збільшення ± SEM для контрольних овець (виражене як 1 бал). Середні показники порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента або U-тесту Манна–Уїтні для даних із нормальним і ненормальним розподілом відповідно. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

Рисунок 7. Експресія генів протизапальних цитокінів TGF- і IL-10, а також прозапальних цитокінів TNF- і IL-6 у таламусі (A) і гіпокампі (B) контрольної та природної хвороби скрейпі - заражені вівці.

Дані представлені як середнє значення ± кратна зміна стандартної середньої помилки щодо контрольних груп (виражене як 1 бал). Середні показники порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента або U-критерію Манна–Уітні для даних із нормальним і ненормальним розподілом відповідно. * p < 0.

Щоб перевірити, чи є зміни в експресії TLR у ЦНС при природному захворюванні порівнянними з тими, що індукуються в мишачій моделі tg338 після внутрішньомозкової інфекції скрейпі, рівні транскрипції TLR та MyD88 оцінювали в таламусі мишей tg338 (рис. 8). Рівні мРНК TLR1 і TLR2 були значно збільшені (p < 0.01) порівняно з контролем, і спостерігалася тенденція до активації TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Рисунок 8. Експресія генів TLR1-7, TLR9 і MyD88 у таламусі клінічно уражених мишей tg338, інтрацеребрально інокульованих позитивним інокулятом проти скрейпі, порівняно з контрольними (негативний інокулят скрейпі). Результати виражені як середнє значення ± зміна кратності SEM відносно контрольної групи (оцінка 1). Середні показники порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента або U-критерію Манна–Уїтні для даних із нормальним і ненормальним розподілом відповідно. # p < {{10}}.1, ** p < 0,01.

2.5. Оцінка рівнів білка TLR4 підтверджує підвищення регуляції, виявлене qPCR у овець, інфікованих Скрепі

Щоб підтвердити, що спостережуване збільшення мРНК TLR4 перетворюється на зміни в рівнях білка, WB оцінив TLR4 у довгастому мозку, таламусі, гіпокампі та лобовій корі чотирьох овець, інфікованих скрейпі, і чотирьох контрольних овець (Малюнок 9).

Згідно з результатами КПЦР, рівні білка TLR4 були значно підвищені (p < 0.05) у всіх чотирьох областях мозку овець, інфікованих скрейпі.

Рисунок 9. Експресія білка TLR4 у довгастому мозку (Mo), таламусі (Th), гіпокампі (Hc) і лобовій корі головного мозку (Fc) овець, інфікованих скрейпі, порівняно з овець контрольної групи (n=4 на групу). -актин використовувався як контроль навантаження.

На графіку зображено значення денситометрії та вказує на значне підвищення експресії TLR4 у всіх регіонах у овець, інфікованих скрейпі, порівняно з контрольними овець. Дані виражені як середнє значення ± SEM. Середні показники порівнювали за допомогою t-критерію Стьюдента. * p < 0.05.

3. Обговорення

Останніми роками вивчення нейрозапальної відповіді при пріонних захворюваннях дозволило краще зрозуміти основні механізми та наслідки.

Нейрозапалення включає реактивний мікрогліоз і астрогліоз [43], обидва з яких можна виявити до появи клінічних ознак і передують спонгіозу та втраті нейронів [7,8,18].

Чи є мікрогліальна активація при пріонних захворюваннях корисною чи шкідливою, залишається предметом дискусії. Деякі автори стверджують, що мікрогліальна активація та проліферація сприяють нейрозапальному процесу та подальшій нейродегенерації [8,18,44].

Проте інші вказують на загальну захисну роль мікроглії, а дослідження in vitro показують, що мікроглія може інтерналізувати та деградувати PrPSc [27,45]. Згідно з цими висновками, експерименти in vivo показали, що виснаження мікроглії зменшує період виживання, ймовірно, через зниження кліренсу PrPSc [46,47].

Таким чином, вірогідно, що під час процесу захворювання існують численні реактивні мікрогліальні фенотипи, які проявляють нейропротекторний ефект на ранніх стадіях захворювання та, у міру прогресування захворювання, поступаються місцем прозапальному фенотипу, який викликає шкідливі ефекти [9,10]. Одна гіпотеза передбачає, що передача сигналів TLR опосередковує активацію гліальних клітин при пріонних захворюваннях.

Відомо, що поглинанню мікроглією амілоїдних волокон при хворобі Альцгеймера сприяє активація TLR [48,49]. Таким чином, хоча активація TLR на гліальних клітинах може відігравати певну роль у кліренсі агрегованих або аномальних білків (наприклад, пріонного білка), хронічна активація може бути шкідливою для господаря, що призводить до нейротоксичності та загибелі нейронних клітин [50].

На сьогодні дані про роль TLR в пріонпатогенезі дуже обмежені. Кілька досліджень вимірювали зміни експресії TLR у ЦНС на мишачих моделях, і в одному повідомлялося про зміни експресії TLR у крові ягнят, у всіх випадках використовували тварин, експериментально інфікованих пріонною хворобою [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com