Відкриття та ідентифікація потенційних антимеланогенних активних компонентів Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Іюань Луо1, Хуань Ван1, Шуо Лі1, Юе ​​Ву1, Чжіруй Ван1, Шаоцзюнь Чен1 і Хунцзян Чен1,2*

Анотація

фон:Bletilla striata є основним лікарським засобом багатьох класичних формул для відбілювання шкіри в традиційній китайській медицині (ТКМ) і останнім часом широко використовується в косметичній промисловості. Однак його активні інгредієнти досі невідомі, а його волокнисті корені не використовуються ефективно. Метою цього дослідження є виявлення та ідентифікація його потенційних антимеланогенних активних компонентів за допомогою моделі рибок даніо та молекулярного докінгу.

Методи:Theантиоксидантактивності оцінювали за активністю поглинання радикалів 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразилу (DPPH), 2,2′-азино-біс-(3-етилбентіазолін-6-сульфонової кислоти) (ABTS ) активність поглинання радикалів і відновлення залізаантиоксидантаналіз потужності (FRAP). Антимеланогенну активність оцінювалитирозиназагальмівнийдіяльністьin vitro та інгібітор меланіну у рибок даніо. Хімічні профілі були виконані за допомогою надвисокопродуктивної рідинної хроматографії в поєднанні з квадрупольною часпролітною тандемною мас-спектрометрією (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Тим часом потенційні антимеланогенні активні компоненти були тимчасово ідентифіковані за допомогою молекулярного докінгу.

Результати:95-відсотковий етаноловий екстракт волокнистих коренів B. striata (EFB) мав найсильнішу інгібіторну дію на DPPH, ABTS, FRAP і тирозиназу з IC50 5.94 мг/л, 11,69 мг/л, 6,92 ммоль FeSO4/г, і 58,92 мг/л відповідно. Крім того, EFB і 95-відсотковий етаноловий екстракт бульб B. striata (ETB) значно знижували синтез меланіну в ембріонах рибки даніо залежно від дози. 39 хімічних складів, включаючи 24 стильбеноїди, були попередньо ідентифіковані з EFB і ETB. Молекулярний докінг вказав, що 83 (включаючи 60 стильбеноїдів) і 85 (включаючи 70 стильбеноїдів) сполуки виявляють сильнішу спорідненість зв’язування з тирозиназою та аденілатциклазою.

Висновок:Отримані результати підтверджують доцільність використання EFB і ETB як природних засобів для відбілювання шкіри у фармацевтичній і косметичній промисловості.

Ключові слова: Bletilla striata, антиоксидант, антимеланогенна активність, UPLC-Q-TOF-MS/MS, даніо, молекулярний докінг

Клацніть, щоб отримати побічні ефекти та переваги антиоксиданту

Фон

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. – трав'яниста багаторічна рослина, широко поширена в Азії, таких як Китай, Корея, Японія [1]. Висушені бульби B. striata, також відомі як Baiji, вперше описані в Classic of Materia Medica Шеннонга, широко використовувалися як традиційна китайська медицина (TCM) протягом тисяч років у Китаї. У китайських фармакопеях стверджується, що він має в’яжучу дію при гемостазі та знеболюванні, тому його широко використовували для лікування гематемезисів, кровохаркання, травматичних кровотеч, виразок, набряків і потрісканої шкіри [2, 3]. Фармакологічні дослідження показали, що B. striata володіє широким спектром біологічної активності, наприклад ранозагоювальною [4, 5], противиразковою [6, 7], кровоспинною [8],анти-запалення[9], антиоксидант[10], антибактеріальний [11], противірусний проти грипу [12] і проти старіння [13]. При цьому B. striata містить різні класи хімічного складу, в т.чполісахариди[14], бібензили, фенантрени, антрахінони,флавоноїдита 2-ізобутилмалати [3, 15] тощо.

B. striata є основним лікарським засобом багатьох класичних формул для відбілювання шкіри в TCM [16], і останнім часом він широко використовується в косметичній промисловості [17]. Однак його активні інгредієнти все ще неясні, і навіть деякі результати досліджень були протилежними. Наприклад, результати дослідження Chenet ін. вказали, що 95-відсотковий етаноловий екстракт B. striata володів вищою інгібіторною активністю щодо тирозинази, ніж його водний екстракт зі швидкістю інгібування 68,36 відсотка in vitro [18], тоді як результат Huang et al. показали, що інгібуюча активність водного екстракту B. striata щодо тирозинази була сильнішою, ніж активність 95-відсоткового етанольного екстракту в межах рівня інгібування 62 відсотків in vitro [19]. Результати досліджень Luetal [20] і Linghuetal [21] продемонстрували, що як водний, так і 95-відсотковий етаноловий екстракт B. striata, особливо його фракціонування хлороформом, можуть пригнічувати ріст клітин B16 і індукувати їх апоптоз залежно від концентрації.

Оскільки випробування інгібування тирозинази та клітинних ліній меланоми in vitro не включали складних фізіологічних умов in vivo, а також поглинання, метаболізму, розподілу та виведення досліджуваного зразка, багато із зразків показали значну інгібіторну активність проти клітинних ліній тирозинази та меланоми в тим не менш, in vivo виявився слабко ефективним або навіть неефективним [22,23]. Глабридин продемонстрував значну інгібіторну дію на тирозиназу з IC50 0.43 мкмоль/л, що було в 176 разів сильніше, ніж у койєвої кислоти. Тим не менш, це не було інгібуючим впливом на пігментацію рибок даніо in vivo [24].

Тим часом волокнисті корені B. striata (FB) були побічними продуктами, що утворилися під час обробки B. striatatuber (TB). Сучасні дослідження показали, що ФБ містить схожі з ТБ сполуки та з підвищеним вмістом фенолів [25]. Крім того, антибактеріальна [26], антиоксидантна та антитирозиназна активність екстракту ФБ була сильнішою, ніж у екстракту ТБ [25]. Однак ресурси ФБ не були ефективно використані та були занедбані на сільськогосподарських угіддях, що призвело до марнування ресурсів ФБ та забруднення навколишнього середовища [27].

Риба даніо (Danio rerio), маленька тропічна прісноводна риба, є новою тваринною моделлю для фармакології

і токсикологічні дослідження in vivo з багатьма перевагами, включаючи низьку вартість, короткий життєвий цикл, високу прозорість, легкість у догляді, високу фертильність і потребу в меншій кількості тестових зразків [28, 29]. Крім того, рибка даніо має пігменти меланіну на поверхні, що дозволяє легко спостерігати за процесом пігментації, і широко використовувалася в антимеланогенних дослідженнях [28, 30].

У цьому дослідженні ми порівняли антиоксидантну та інгібіторну активність тирозинази сирого полісахариду та 95-відсоткового етанольного екстракту туберкульозу та FB in vitro, а також антимеланогенну активність на моделі рибок даніо. Тим часом потенційні антимеланогенні активні компоненти були тимчасово ідентифіковані за допомогою молекулярного докінгу. Ми виявили, що 95-відсотковий етаноловий екстракт туберкульозу (ETB) і FB (EFB) має значну антиоксидантну та антитирозиназну активність і може залежно від дози зменшувати синтез меланіну в ембріонах рибок даніо. Таким чином, ETB і EFB можуть використовуватися як природні засоби для відбілювання шкіри у фармацевтичній і косметичній промисловості.

методи

Хімічні речовини та реактиви

Тирозиназу, 3-(3,4-дигідроксифеніл)-L-аланін (L-ДОФА) та арбутин було придбано у компанії Aladdin Reagent Company (Шанхай, Китай). 2,2-дифеніл{{8 }}пікрилгідразил (DPPH), 2,2′-азино-біс-(3-етилбентіазолін-6-сульфокислота) (ABTS),6-гідрокси-2,5,7 ,8-тетраметилхроман-2-карбонова кислота (тролокс) і 2,4,6-трис (2-піридил)-s-тріазин (TPTZ) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Миссурі, США). Ацетонітрил і метанол (класу HPLC) були придбані у Tedia (Fairfield, OH, USA). Деіонізовану воду готували за допомогою водопровідної системи Milli-Q (18,2 МОм, Millipore, США).

Процедура збору та екстракції рослин

B. striata було зібрано з Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, China). Зразки ваучерів були збережені в Гербарії Фармацевтичного коледжу Чжецзяна (реєстраційний номер 190615). Всю рослину поділяли на бульбиі мочкуваті корені. Згодом їх нарізали на дрібні шматочки та висушили шляхом сублімаційної сушки відповідно.

Висушені та порошкоподібні зразки (TB і FB) екстрагували із зворотним холодильником 95-відсотковим етанолом три рази (1,5 години кожного разу). Екстракт фільтрували за допомогою фільтрувального паперу What Man (№1). Фільтрат концентрували досуха в роторному випарнику (Hei-VAP, Heidolph, Німеччина) при 50° і потім сушили за допомогою вакуумної сублімаційної сушарки. Вихід етанольної екстракції TB (ETB) і FB (EFB) становив 5,21 і 6,53 відсотка відповідно. Залишки використовували для вилучення неочищеного полісахариду шляхом диспергування у воді при температурі 80 градусів протягом 4 годин і осадження етанолом [31]. Виходи полісахаридів TB (PTB) і FB (PFB) становили 14,75 і 6,45 відсотка відповідно.

екстракт цистанки

Хімічний аналіз

Хімічний аналіз проводили за допомогою рідинної хроматографії надвисокої продуктивності в поєднанні з тандемною квадрупольною часопролітною мас-спектрометрією (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Хроматографічне розділення проводили на Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, US) з колонкою WatersBEH Shield RP C18 (100×2,1 мм, 1,7 мкм) при 3{ {43}} ступінь . Рухома фаза складалася з 0,1 відсотка мурашиної кислоти у воді (А) та ацетонітрилу (В) з лінійним градієнтом: 0–3 хвилини, 5–16 відсотків В; 3–8 хв, 16–30 відсотків B; 8–10 хв, 30–35 відсотків B; 10–15 хв, 35–55 відсотків B; 15–18 хвилин, 55–80 відсотків B; 18–19 хвилин, 80–5 відсотків B; 19–20 хв, 5% B. Швидкість потоку становила 0,3 мл/хв, а об’єм ін’єкції становив 2 мкл.

Експерименти TOF-MS/MS проводили з використанням мас-спектрометрії AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США), оснащеної іонізацією електророзпиленням (ESI). Виявлення МС проводили методом негативної іонізації. Параметри були встановлені наступним чином: температура джерела і десольватації становили 100 градусів і 450 градусів відповідно; швидкість потоку газу десольватації становила 900 л/год; капілярна напруга 2 кВ; напруга на конусі 40 В; енергія зіткнення 22 еВ; а повний сканспектр був від 100 до 2000 Да.

Антиоксидантні аналізи активності поглинання радикалів DPPH

Активність поглинання радикалів DPPH визначали згідно з Ali et al. з незначними модифікаціями [32]. Коротко, 50 мкл розчину досліджуваного зразка змішували з 150 мклрозчином етанолу LDPPH (0,2мМ) у 96-лункових планшетах і витримували в темряві протягом 30 хв. . Оптичну щільність суміші при 517 нм (A1) оцінювали спектрофотометром для мікропланшетів (Thermo Fisher Scientific, Америка). Холостий розчин без досліджуваного зразка, змішаного з розчином DPPH в етанолі, був визначений як позитивна група (A0). Порожній розчин без DPPH, змішаний з розчином досліджуваного зразка, був встановлений як холоста група (A2). Усі експерименти проводили в трьох повторах. Швидкість поглинання радикалів DPPH розраховували за такою формулою:

Швидкість поглинання радикалів DPPH (відсотки) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 відсотків.

Активність поглинання радикалів ABTS

Здатність ABTS поглинати радикали вимірювали за допомогою методу, описаного Ali et al. [32]. Коротко, водний розчин 7mMABST змішували з 2,45мМ персульфату калію у співвідношенні 1:1 (об’єм/об’єм) та інкубували при кімнатній температурі в темряві протягом 16 годин, щоб отримати вихідний розчин ABST плюс. Базовий розчин розбавляли фосфатно-сольовим буфером (PBS) для регулювання поглинання (0.72±0.2) при 734 нм. 20 мкл досліджуваних зразків у різних концентраціях ретельно змішували з 180 мкл розчину ABTS plus. Реакційноздатні суміші витримували в темряві протягом 5 хвилин і потім вимірювали поглинання (B1) при 734 нм. Поглинання сумішей без досліджуваного зразка та ABST plus були встановлені як B і B відповідно. Усі досліди проводили в трьох повторах. Швидкість поглинання радикалів ABTS розраховували за такою формулою:

Швидкість поглинання радикалів ABTS (відсотки) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 відсотків.

Аналіз антиоксидантної дії, що знижує залізо (FRAP)

Відновну активність двовалентного заліза визначали згідно з процедурами Kosakowska et al. [33]. 300мМ ацетатний буфер, 10мМ TPTZ (2,4,6-трис (2-піридил)-s-триазин) і 20мМ FeCl3 змішували при (об./об./об.) Співвідношенні 10:1:1 доготують робочий реактив. 100 мкл кожного розчину тестового зразка змішували зі 100 мкл робочого реагенту TPTZ, інкубували при 37 градусах протягом 20 хвилин і визначали поглинання при 593 нм. Тим часом серія стандартних розчинів FeSO4 в діапазонах концентрацій 0–1000 мкг/мл була використана для підготовки калібрувальної кривої. Відновну здатність заліза розраховували при утворенні інтенсивного синього комплексу Fe2 плюс -TPTZ. Результати виражали як Fe2 плюс антиоксидантна здатність (ммоль FeSO4/г екстракту).

Інгібіторна активність тирозинази

Інгібіторну активність тирозинази визначали спектрофотометричним методом з використанням L-ДОФА як субстрату [34]. Коротко, 50 мкл розчинів зразків у різних концентраціях змішували з 50 мкл тирозинази (200 одиниць/мл, розчиненої у фосфатному буфері рН 6,8) у 96-лунці. чашки та інкубували протягом 15 хвилин при 25 градусах. Потім реакцію ініціювали додаванням L-DOPA (50 мкл). Після 30-хвилинної інкубації при 25° абсорбцію при 490 нм (Aa) визначали за допомогою мультисканового мікропланшетного спектрофотометра (ThermoFisher Scientific, Америка). Аналогічно, поглинання лунок із зразком без тирозинази (Ab) і контрольних лунок з ферментом, але без зразка (Ab) були виявлені одночасно. Інгібіторну активність тирозинази розраховували за наступним рівнянням:

Рівень пригнічення тирозинази (відсотки)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 відсотків.

IC50 розраховували за допомогою рівняння GraphPad Prism, як показано нижче:

Y=хв. плюс (макс. − мін.)/1 плюс 10(x−logIC50) × нахил пагорба

X представляв концентрацію інгібітора; Y представляє дані інгібування (відсотки) разом з їх мінімальними (мін.) і максимальними (макс.) значеннями; Схил пагорба є коефіцієнтом ухилу.

Цистанхе пригнічує активність тирозинази.

Інгібітор меланіну у рибок даніо

Рибок даніо лінії АВ дикого типу (наданих Hunter Bio-technology, Inc., Ханчжоу, провінція Чжецзян) містили у риб’ячій воді (0.2% швидкорозчинної океанічної солі в деіонізованій воді, pH 6,9–7,2, провідність 48{ {18}}–510 мСм/см і твердість 53,7–71,6 мг/л CaCO3) у 14/10 годинному світловому/темрявому періоді при постійній температурі 28±0,5 градуса, і годували живими соляними креветками двічі на день. Ембріони даніо були отримані з природного нересту та зібрані протягом 30 хвилин. Аналіз рибок даніо був акредитований Асоціацією з оцінки та акредитації догляду за лабораторними тваринами (AAALAC). Це дослідження було схвалено IACUC (Інституційним комітетом з догляду та використання тварин) компанії Hunter Biotechnology, Inc., а номер схвалення IACUC був 001458.

Ембріони на стадії 6 годин після запліднення (hpf) обробляли кожен екстракт у шести концентраціях (10, 30, 62,5, 125, 250 і 500 мг/л) протягом 72 годин для оцінки максимальної нелетальної концентрації (MNLC). ). У результаті MNLC всього екстракту становили більше 62,50 мг/л. 10 ембріонів поміщали в 6-лунку та піддавали впливу досліджуваних зразків у концентраціях 10 і 30 мг/л від 6 hpf до 54 hpf (48-годинна експозиція ). ДМСО (0,05% об./об.) і арбутин (10 і 30 мг/л) використовували як нормальний і позитивний контроль відповідно.

Синхронізовані ембріони збирали та спостерігали під стереомікроскопом (SZX7, Olympus, Японія), оснащеним цифровою камерою (VertA1, Китай). Накопичення меланіну, прямо пов’язане з ділянками пігментації рибок даніо, було розраховано за допомогою програми маніпулювання зображеннями GNUI (версія GIMP 2.10.2) і виражено у відсотках відносно негативного контролю (накопичення меланіну 100 відсотків) [28, 30].

Дослідження молекулярного докінгу

158 сполук, виділених з B. striata в літературі [2], включаючи 19 глікозидів, 28 бібензилів, 19 фенан-тренів, 18 біфенантренів, 23 дигідрофенантренів, 5 антоціанів, 11 стероїдів, 8 тритерпеноїдів, 12 фенолових кислот, 5 хінонів, і 10 інших сполук були використані як ліганди. 3D-структури були намальовані ChemBio3D і оптимізовані за допомогою MM2 і Autodock Tools. Тривимірну кристалічну структуру тирозинази (PDBID: 5M8N) і аденілатциклази (PDB ID: 5IV3) було отримано з RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Усі молекули води та гетероатоми були видалені з кристалічних структур за допомогою Chimera та MGL Tools. Нарешті, Autodock

Віна використовувався для стикування рецепторного білка з лігандами з малими молекулами. Параметри док-сайту рецепторного білка були встановлені як -36,700, 7,034, -19,104 і -17,467, - 22,807, 2,786, відповідно, відповідно до вихідного ліганду мімозину та LRE1 [35]. Щоб досягти вищої точності обчислень, було згенеровано 20 параметрів вичерпності для кожного рецептора, і конформація з найвищою спорідненістю була обрана як остаточна конформація стикування та візуалізована в Pymol2.3. Тим часом вихідні ліганди мімозин і LRE1 були взяті як позитивний контроль [36].

In silico Прогноз ADMET

3 найкращі результати від B. striata мали кращу афінність зв’язування з тирозиназою та аденілатциклазою, були піддані аналізу ADMET. QikProp у Schrodingersuite використовувався для розрахунку їхніх фізичних властивостей і характеристик, пов’язаних із ліками, зокрема молекулярної маси (MW), прогнозованого коефіцієнта розподілу октанол/вода (QPlogPo/w), прогнозованої розчинності у воді (QPlogS), прогнозованої уявної Caco-2 клітини проникність для кишково-кров’яного бар’єру (QPPCaco), прогнозований коефіцієнт розподілу мозок/кров (QPlogBB), прогнозована проникність шкіри (QPlogKp), прогнозована IC50 для блокування каналів HERGK plus (QPlog HERG) і прогнозована оральна абсорбція людини. Властивості оцінювали на основі правила п'яти Ліпінського та літератури [37, 38].

Моделювання молекулярної динаміки

Для вивчення стабільності та динамічних коливань комплексу ліганд-білок у змодельованому біологічному середовищі та подальшої перевірки результатів докінгу сполуку блестрин D (75) було обрано як ліганд для дослідження моделювання молекулярної динаміки (MD) на основі результат молекулярного докінгу. Комплекс блестрину D з тирозиназою та аденілатциклазою проводили моделювання МД і запускали протягом 100 нс, використовуючи водний режим TIP3P. Значення середньоквадратичного відхилення (RMSD) атомів основного ланцюга білка по відношенню до початкової структури були розраховані для вивчення стабільності білка протягом періоду моделювання [39].

Результати

Хімічний склад

Типові базові пікові хроматограми ETB і EFB показані на рис. 1. Для ідентифікації компонентів використовувалося програмне забезпечення PeakView. Молекулярна формула була точно визначена з похибкою маси 10 ppm. Точну молекулярну масу та фрагменти використовували для ідентифікації компонентів відповідно до літератури та безкоштовної бази даних хімічної структури, такої як ChemSpider і Massbank. У результаті 39 хімічних складів, включаючи 24 стильбеноїди (бібензили, фенантрени та їх похідні), 6 глікозидів, 4 фенолокислоти, 3 хінони, 1 стероїд та 1 іншу сполуку були попередньо ідентифіковані з EFB та ETB. У той же час, їх відносну напівкількісну оцінку проводили шляхом вимірювання площі піків кожної сполуки в режимі MS з використанням екстрагованих іонних хроматограм [40]. Детальна інформація ідентифікації та їх відносний вміст (теплова карта світла, чим темніший колір, тим вищий концентрація) були підсумовані в таблиці 1.

Антиоксидантна здатність

Добре відомо, що ультрафіолетове А (UVA)-опромінення може індукувати виробництво активних форм кисню (АФК) і сприяти надмірному меланогенезу в клітинах шкіри. Природні поліфеноли були інгібіторами утворення АФК і могли відповідати за антимеланогенну активність рослинних екстрактів [41]. , 42]. Таким чином, у цьому дослідженні антиоксидантну здатність оцінювали за допомогою DPPH, активності поглинання радикалів ABTS і FRAPassay. Результати (таблиця 2 і рис. 2) показали, що EFB (IC50=5.94 мг/л) має найсильнішу активність поглинання радикалів DPPH in vitro порівняно з PTB(IC50=548.24 мг/л) , PFB (IC50=285.81 мг/л) і ETB(IC50=65.25 мг/л). Подібна тенденція спостерігалася в аналізі ABTS і FRAP. 95-відсоткові спиртові екстракти TB і PB мали сильнішу антиоксидантну активність in vitro, ніж їх сирі полісахариди. Крім того, EFB демонструє сильнішу антиоксидантну активність, ніж ETB, що узгоджується з результатами попередніх досліджень [25].

Інгібіторна активність тирозинази

Тирозиназа була ключовим ферментом, що обмежує швидкість у шляху біосинтезу меланіну, і її широко використовували для виявлення потенціалу натуральних продуктів із ефектом проти меланогенезу [43]. Результати (рис. 3) показали, що ETB і EPB мають сильнішу інгібіторну дію на тирозиназу, ніж PTB і PPB in vitro, що узгоджується з результатами попередніх досліджень [25]. EFB продемонстрував сильнішу інгібуючу дію на тирозиназу залежно від дози (від 20 до 200 мг/л) з IC50=58.92 мг/л, ніж ETB(IC50=75.44 мг/л) і позитивну сполуку арбутин (IC{ {11}}.02 мг/л).

Інгібітор меланіну у рибок даніо

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), що вказує на те, що носій 0,05% ДМСО не вплинув на виробництво меланіну в ембріонах рибок даніо. Однак після впливу досліджуваних зразків і арбутину протягом 48 годин ембріони рибок даніо демонстрували різний ступінь відкладення меланіну (рис. 3B, 4), за винятком групи PFB 10 мг/л. Помітно, що відносний вміст меланіну в групах ETB 10 мг/л (78,38 відсотка) і 30 мг/л (64,72 відсотка) був значно нижчим, ніж у групах PTB 10 мг/л (93,06 відсотка) і 30 мг/л (82,02 відсотка) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Молекулярний докінг

Тирозиназа є ферментом, що обмежує швидкість біосинтезу меланіну: гідроксилювання тирозину до 3,4-дигідроксифенілаланіну (ДОФА) та окислення ДОФА тодопахінону. Тому тирозиназу розглядають як критичну мішень для розвитку інгібіторів меланогенезу [44]. Крім того, аденілатциклаза є ключовим ферментом цАМФ-індукованого меланогенезу. Зв’язування меланотропіну альфа-поліпептиду (-MSH) з рецепторами MC1R викликало активацію аденілатциклази, підвищення рівня цАМФ, регуляцію експресії гена тирозинази, а згодом і збільшення синтезу меланіну [45]. Тому ми провели дослідження молекулярного докінгу 158 сполук, виділених з B. striata раніше [2], з тирозиназою та аденілатциклазою. Енергії зв’язування досліджуваних лігандів з тирозиназою та аденілатциклазою були підсумовані в таблиці S1. Було 83 (включаючи 6 0 стильбеноїдів) і 85 (включаючи 70 стильбеноїдів) сполук, які виявляють сильнішу спорідненість зв’язування з тирозиназою та аденілатциклазою, порівняно з вихідними лігандами мімозином (– 6,4 ккал/моль) та LRE1 (– 8,5 ккал). /моль). 1,8-біс(п-гідроксибензил)-4-метоксифенантрен-2,7-діол (56), блестрин D (75) і 2,7-дигідрокси -1,6-біс(п-гідроксибензил)-4-мет-окси-9,10-дигідрофенантрен (93) були першими трьома лігандами до тирозинази з енергією зв’язку −10,2, 10,0 і 9,7 ккал/моль відповідно. Хоча блестрин D(75), блестрин B (73) і 3,3′-дигідрокси-5-метокси-2,5′,6-трис(п-гідроксибензил)бібензил (42) були трьома найкращими лігандами до аденілатциклази з енергією зв’язування – 12,1, – 11,9 і – 11,6 ккал/моль, відповідно. Їх теоретичні афінності зв’язування та взаємодії ліганд-амінокислота були підсумовані в таблиці 3.

Слід зазначити, що блестрин D (75), сполука біфенантрену, проникає в зв’язувальну кишеню тирозинази та аденілатциклази (рис. 5) і демонструє значну спорідненість зв’язування як з тирозиназою, так і з аденілатциклазою. Взаємодія Ван-дер-Воллса сприяє загальному значенню енергетичної взаємодії, тоді як гідроксильна група утворює водневі зв’язки із залишками амінокислот Glu 451, Arg114 тирозинази та Val 167 аденілатциклази, відповідно (таблиця 3 і рис. S1). Сполука 93 також демонструє значну спорідненість зв’язування. по відношенню до тирозинази через утворення 6 водневих зв'язків із амінокислотними залишками Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 і Gln236.

In silico Прогноз ADMET

Прогнозовані значення кількох важливих параметрів разом із їх допустимим діапазоном підсумовано в таблиці 4. Окрім QPlogS 3,3′,5-триметоксибібензилу, блестрину B і блестрину D, а також QPlogBB 3,3′,{{6} }триметоксибібензил, усі інші розраховані властивості ADMET трьох найкращих результатів були в межах очікуваного діапазону, тим часом QPlog HERG усіх трьох найкращих результатів був меншим за -5, що вказує на те, що вони мали лікарський потенціал для використання людиною. QPlog Kp усіх трьох найкращих результатів як для тирозинази, так і для аденілатциклази, за винятком 3,3′,5-триметоксибібензилу, були у сприятливому діапазоні, що вказує на те, що ці сполуки можуть легко проникати в шкіру.

Молекулярно-динамічне моделювання

Діаграма RMSD показала, що значення RMSD комплексу білок-ліганд істотно не коливалися протягом усього періоду моделювання. Значення RMSD (рис. 6A) блестрину D з тирозиназою та аденілатциклазним комплексом були визначені в межах від 1,5 до 2,8 Å та від 2.0 до 3,6 Å відповідно. Значення RMSF відображає гнучкість моделювання кожного залишку. Залишки з вищими значеннями RMSF показали, що вони більш гнучкі (рис. 6B). Було виявлено, що значення RMSF амінокислотних залишків у ділянках петлі сильно коливаються. Хоча залишки активного сайту зберігали невелике значення RMSF (менше 1.0Å), наприклад Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 і Arg230 в тирозиназі, і Val167, Leu102, Phe45, Lys95 і Leu166 в аденілатциклазі, вказуючи на те, що кишені для палітурки залишалися стабільними. Молекулярні взаємодії блестрину D з тирозиназою та аденілатциклазою показано на рис. 7.

Вільні енергії зв’язку були розраховані методом узагальненої площі поверхні молекулярної механіки (MM-GBSA) [39]. Прогнозована вільна енергія зв’язування блестрину D з тирозиназою та аденілатциклазою становила –96,94 ккал/моль і –139,69 ккал/моль відповідно, що означає, що взаємодії зв’язування були спонтанними (таблиця 5). Крім того, сприяння зв’язуванню ліганду включали неполярну сольватну взаємодію, ван-дер-ваальсову та електростатичну взаємодію.

Варто зазначити, що типи та вміст хімічних компонентів у EFB були більшими, ніж у ETB. Площі піків усіх ідентифікованих сполук у EFB були приблизно вдвічі більші, ніж у ETB. Мілітарин був найпоширенішою сполукою як в EFB, так і в ETB, яка володіла значною антиоксидантною, протизапальною та нейропротекторною активністю, і була обрана як хімічний маркер для контролю якості B. striata у виданні Китайської фармакопеї 2020 р. [46]. Відносна площа піку militarine в EFB (38,39×106) була трохи вищою, ніж у ETB (30,48×106). Гастродин є добре відомою сполукою в багатьох китайських фітопрепаратах, таких як Gastrodia elata, яка виявляє значний інгібуючий ефект тирозинази та поглинання радикалів [30]. Відносна площа піку гастродину в EFB (1,43 × 106) була трохи нижчою, ніж у ETB (2,17 × 106).

95-відсоткові спиртові екстракти TB і PB мали сильнішу антиокислювальну активність in vitro, ніж їх сирі полісахариди. Крім того, EFB виявляють сильнішу антиоксидантну активність, ніж ETB, що узгоджується з результатами попередніх досліджень [25]. Це явище можна пояснити тим, що EFB містить вищий рівень антиоксидантних сполук, таких як мілітарин і стильбеноїди (природні рослинні поліфеноли). Наприклад, відносна площа піку 4,8,4′,8′-тетраметокси-[1,1′-біфенантрену]-2,7,2′,7′-тетролу, біфенантрену з чотирма фенольними гідроксильними групами, було 9,15×106 у FB, тоді як воно становило 0,01×106 дюймів ТБ.

У цьому дослідженні PPB і PTB показали незначну активність інгібування тирозинази залежно від дози. Проте було продемонстровано, що у водному екстракті PB (містить PPB) активності не виявлено [25]. Це явище може бути наслідком різної підготовки зразка. Водний екстракт PB використовувався для оцінки інгібіторної активності тирозинази в експерименті Jiang [25], тоді як у цьому дослідженні водний екстракт був осаджений етанолом для отримання неочищеного полісахариду.

Останнім часом модель рибки даніо широко використовується для оцінки ефекту проти меланогенезу in vivo [47, 48]. Арбутин, гідрохінонова глюкозидна сполука, наявна в різних рослинах, яка комерційно використовується в косметичній промисловості, була встановлена ​​як позитивний контроль. Активність ETB і EFB проти меланогенезу була сильнішою, ніж у арбутину, що вказує на те, що ETB і EFB можна застосовувати як засоби для освітлення шкіри в косметичній промисловості.

Відносна площа піку блестрину D в EFB (1,91 × 106) приблизно в чотири рази перевищує таку в ETB (0,46 × 10). Відносна площа піку сполуки 56 (8,73 × 106) і 93 (0,64 × 106) в EFB також є значно вищою, ніж у ETB (менше 0,01 × 106 і 0,10 × 106). Це може бути однією з причин, чому EFB виявляє сильнішу антимеланогенну дію, ніж ETB. Цікаво відзначити, що три перші ліганди до тирозинази та аденілатциклази належать до стильбеноїдів (бібензилів, фенантренів та їх похідних). Стилбеноїди є природними рослинними поліфенолами, які привернули великий інтерес в останні роки через їх чудову біоактивність, таку як протизапальна, антимікробна та антиоксидантна активність [49]. Ресвератрол є найпоширенішим стильбеноїдом. Попереднє дослідження показало, що ресвератрол і його похідні можуть значно пригнічувати каталітичну активність, експресію генів і посттрансляційні модифікації тирозинази. Таким чином, вони продемонстрували потенційну користь як освітлювачі шкіри та засоби проти старіння в косметиці [41, 50].

Цистанхе виявилася потенційно корисною як засіб для освітлення шкіри та запобігання старінню в косметиці.

Для отримання додаткової інформації натисніть на зображення.

Висновки

У цьому дослідженні систематично досліджували антиоксидантну та антимеланогенну дію неочищеного полісахариду з бульби B. striatatuber (PTB) і волокнистих коренів (FPB), а також 95-відсоткового етанового екстракту бульби B. striata (ETB) і волокнистих коренів (EFB). . Результати показали, що EFB має найсильнішу активність поглинання радикалів DPPH, ABTS і активність щодо відновлення тривалентного заліза. Крім того, ETB і EFB можуть значно зменшити активність тирозинази in vitro та синтез меланіну в ембріонах рибок даніо залежно від дози. Молекулярний докінг показав, що існує велика кількість сполук, переважно належачих до стильбеноїдів, які виявляють сильнішу спорідненість зв’язування з тирозиназою та аденілатциклазою порівняно зі спорідненістю зв’язування вихідного ліганду. Отримані результати підтверджують доцільність використання ETB і EFB як природних засобів для відбілювання шкіри у фармацевтичній і косметичній промисловості.