Диференціальні паттерни мутації VHL у білатеральному ясноклітинному ПКР розрізняють незалежні первинні пухлини та контралатеральне метастатичне захворювання

Мета

Щоб оцінити, чи можна диференціювати пацієнтів із двосторонньою мультифокальною світлоклітинною нирково-клітинною карциномою (ccRCC) за допомогою аналізу мутації VHL на випадки, які являють собою численні незалежно виниклі первинні пухлини або одну первинну пухлину, яка поширилася іпсилатерально, а також на контралатеральну нирку. Природа мультифокального раку нирки за межами відомих спадкових синдромів ще недостатньо вивчена.

Матеріали та методи

ДНК з кількох пухлин на пацієнта оцінювали на наявність соматичної мутації гена VHL та гіперметилювання. Підмножину пухлин із спільними мутаціями VHL було проаналізовано за допомогою цільових аналізів секвенування наступного покоління.

Результати

Ця когорта включала 5 пацієнтів із кількома пухлинами, які продемонстрували спільну соматичну мутацію VHL, що відповідає метастатичному поширенню, включно з контралатеральною ниркою. У кількох випадках це було підтверджено додатковими спільними соматичними мутаціями в генах, асоційованих з ccRCC. На відміну від цього, решта 14 пацієнтів із кількома пухлинами продемонстрували унікальні, непоширені зміни VHL у кожній проаналізованій пухлині, що відповідає незалежно виниклим пухлинам нирок. Жоден із цих останніх пацієнтів не виявив ознак місцевого поширення чи віддалених метастазів.

Висновок

Спектр змін VHL в межах оцінених двосторонніх мультифокальних пухлин ccRCC від одного пацієнта може відрізнити множинне незалежне зростання пухлини від метастазів. Це можна зробити за допомогою доступних на даний момент клінічних генетичних тестів і покращить точність діагностики та прогнозу пацієнта, а також інформує відповідне лікування.

Натисніть тут, щоб отриматипереваги Cistanche

вступ

Світлоклітинний нирково-клітинний рак (ccRCC) є найпоширенішим типом раку нирки, на який припадає 75 відсотків випадків. Прогноз і лікування пацієнтів з ccRCC залежать від клінічної стадії. Якщо захворювання виявлено на ранній стадії та все ще локалізовано в нирці, хірургічне видалення пов’язане з 95-відсотковою 5-10--річною виживаністю. Однак, якщо пухлина поширилася локально або системно, 5-річна виживаність знижується до 67 або 12 відсотків відповідно. Світлоклітинний рак раку найчастіше характеризується двоалельною втратою гена супресора пухлини фон Гіппеля Ліндау, VHL. Механічно це досягається втратою однієї копії хромосоми 3p, включаючи ділянку, що кодує VHL, у поєднанні з мутацією або гіперметилюванням промотора іншої копії VHL. Соматичні зміни генів VHL спостерігаються приблизно в 90 відсотках спорадичних ccRCC, причому генна мутація спостерігається у понад 80 відсотках ccRCC, а гіперметилювання промотору острівця CpG спостерігається приблизно у 8 відсотках ccRCC.

У той час як у більшості спорадичних випадків ccRCC, є лише одне ураження в одній нирці, частка має множинні ураження в одній або обох нирках. Ці пацієнти демонструють двобічний мультифокальний (BMF) ccRCC, і природа цих множинних пухлин може впливати на діагностику та лікування пацієнтів. Виявлення може являти собою одну первинну пухлину, яка поширилася в межах іпсилатеральної нирки або яка метастазувала в контралатеральну нирку. Кілька досліджень досліджували випадки мультифокального ccRCC шляхом порівняння або ступеня втрати 3p, або спектру хромосомних змін серед пухлин в одного пацієнта, щоб показати, що вони мають спільне клональне походження, що відповідає метастатичному поширенню, або що кожна пухлина являє собою подію, що виникає незалежно . Ця сприйнятливість може бути спричинена впливом навколишнього середовища, таким як вплив трихлоретилену (ТХЕ), або внаслідок генетичної зміни зародкової лінії. Відомою причиною двостороннього мультифокального раку нирки є мутація зародкової лінії гена чутливості до ПКР, наприклад VHL, MET, BAP1 або FLCN, пов’язана із синдромом спадкової схильності до пухлини. Найпоширенішим з них є хвороба фон Гіппеля-Ліндау (VHL), спричинена зміною гена VHL в зародковій лінії, що призводить до схильності до двобічного мультифокального ccRCC. У той час як деякі пацієнти з ccRCC BMF матимуть синдром VHL, у багатьох пацієнтів з мультифокальним двостороннім захворюванням не буде діагностовано синдром чутливості до RCC.

Оцінка різниці між метастатичним або незалежно виниклим захворюванням можлива за допомогою генетичного аналізу пухлин, щоб визначити або загальні спільні генетичні зміни у випадку метастазування, або різноманітні різноманітні генетичні зміни у випадку незалежних подій. Розрізнення цих двох клінічних проявів має вирішальне значення для належного лікування пацієнта. Якщо відбулося метастазування, пацієнта, швидше за все, лікуватимуть від системного захворювання. Навпаки, якби всі пухлини були кількома незалежними явищами в нирках, пацієнта, ймовірно, лікували б від локалізованого захворювання та досліджували на наявність генетичних розладів зародкової лінії, а також розглядали б скринінг членів родини, які потенційно перебувають у групі ризику.

У цьому дослідженні ми використали аналіз мутації гена VHL у ccRCC як генетичний маркер для порівняння пухлин у кожного пацієнта в когорті пацієнтів з двобічним мультифокальним ccRCC, у яких не було відомої генетичної зміни зародкової лінії. Було ідентифіковано дві популяції пацієнтів: з пухлинами, що виникли незалежно, і з метастазами в контралатеральній нирці.

Ефекти цистанхе

Матеріали та методи

1. Пацієнти

Пацієнти були оглянуті у відділенні урологічної онкології (UOB) Національного інституту раку (NCI), Національного інституту здоров’я (NIH) для клінічної оцінки. Пацієнти вважалися такими, що мають сімейний анамнез, якщо вони мають принаймні одного родича першого або другого ступеня з історією світлоклітинного РСС, і ранній початок, якщо їм діагностовано у віці 46 років або молодше. Це дослідження було схвалено Інституційною ревізійною радою Національного інституту раку, і всі пацієнти надали письмову інформовану згоду щодо протоколів відділу урологічної онкології. Усім пацієнтам було присвоєно лабораторією деідентифікований 6-цифровий номер для внутрішнього посилання.

2. ПЛР та секвенування ДНК

ДНК екстрагували з крові та пухлинної тканини за допомогою наборів Promega Maxwell 16 Blood and Tissue DNA Purification Kit (Promega, WI). Секвенування ДНК проводили за допомогою ПЛР з використанням Qiagen Taq PCR Core Kit (Qiagen, MD) відповідно до специфікацій виробника з подальшим двонаправленим секвенуванням за допомогою Big Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA) відповідно до специфікацій виробника. і працювати на генетичному аналізаторі ABI 3130xl або 3730 (Applied Biosystems, CA). Секвенування Sanger проводилося в CCR Genomics Core Національного інституту раку, NIH, Bethesda, MD 20892. Прямі та зворотні послідовності були оцінені за допомогою Sequencher 5.0.1 (Genecodes, MI).

3. Аналіз метилювання ДНК

ДНК піддавали обробці бісульфітом за допомогою набору Qiagen EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, MD) відповідно до специфікацій виробника. Було сконструйовано дві пари праймерів, здатних відпалювати як метильовану, так і неметильовану/перетворену на бісульфіт ДНК поблизу промотору VHL. ПЛР проводили, як зазначено вище, із зовнішніми праймерами, потім другий цикл ПЛР із внутрішніми праймерами, і продукти піддавали двонаправленому секвенуванню, як зазначено вище.

4. Аналіз Oncomine і TruSight Oncology 500

Вибрані пухлини з клінічно показаних хірургічних втручань були обрані для аналізу за допомогою Oncomine Comprehensive Assay v3 (ThermoFisher, MA) або пізнішої версії TruSight Oncology 500 (Illumina, CA), аналізів секвенування наступного покоління, здатних виявляти одиничні нуклеотидні варіації, варіації кількості копій, злиття генів та інделі від 161 до 523 генів, що викликають рак, відповідно. Фіксовані формаліном, залиті парафіном зразки були оброблені відділом молекулярної діагностики лабораторії патології NCI.

Стандартизований Cistanche

Обговорення

Здатність краще характеризувати пацієнтів з двосторонніми мультифокальними пухлинами нирки дозволить краще вести пацієнтів і може привести до нових уявлень про генетичну природу світлоклітинної нирково-клітинної карциноми. Загалом про еволюцію двостороннього мультифокального ccRCC відомо відносно мало. Частота двобічного та/або мультифокального ПКР при появі або протягом року після первинного виявлення пухлини відносно низька, і зазначена частота значно варіюється від 0.8% до 5,4%. Потрібні подальші дослідження більших когорт з універсальними діагностичними критеріями, щоб встановити точну частоту ccRCC BMF. Wiklund та ін. повідомили, що РСС BMF частіше зустрічається у молодих пацієнтів, а Syed та ін. продемонстрували підвищення частоти при більш тривалому спостереженні. Кілька досліджень досліджували, чи є мультифокальний РСС локальним метастазом чи подіями, що виникають незалежно, шляхом порівняння або ступеня втрати 3p, або спектру хромосомних змін між пухлинами в одного пацієнта. Miyake та інші та Junker та інші продемонстрували спільні моделі втрати хромосоми 3p або хромосомних змін між пухлинами в одного пацієнта, що відповідає метастатичному поширенню, тоді як Ji та інші продемонстрували різні ступені втрати 3p серед пухлин від 2 різних пацієнтів, що відповідає незалежному виникненню пухлини в обох випадках. Кілька повідомлень про випадки показують докази метастатичного поширення з 1 нирки на контралатеральну нирку, надниркові залози або область нирок.

У поточному дослідженні у всіх пацієнтів розвинулися пухлини обох нирок. Метахронна хвороба була більш поширеною (4/5; 80 відсотків) у групі, яка продемонструвала контралатеральні метастази, ніж у тих, у яких пухлини росли незалежно (3/14; 21 відсоток), але як синхронна, так і метахронна контралатеральна хвороба спостерігалася в обох когортах . Аналіз моделі мутації VHL серед пухлин у кожного пацієнта дозволив визначити всіх пацієнтів як таких, що мають занепокоєння щодо метастатичного захворювання або локалізованих двосторонніх пухлин нирок, які ймовірно виникли незалежно. Пацієнти з метастатичним захворюванням мали спільну зміну VHL серед усіх пухлин, тоді як пацієнти з незалежно виниклими пухлинами нирки мали різні зміни VHL у різних пухлинах.

Пацієнти, які продемонстрували спільну мутацію VHL у множинних пухлинах нирок, могли бути результатом мутацій VHL мозаїцизму зародкової лінії, а не метастазів. У цьому випадку мутація зародкової лінії може бути присутня лише в клітинах нирки або навіть у частині клітин нирки, але не присутня в білих кров’яних клітинах, оцінених в аналізі крові, або в клітинах щік із мазка зі щоки. За стандартним тестуванням у пацієнта буде негативна зародкова лінія, але така сама мутація VHL може бути присутня в багатьох незалежно виниклих пухлинах. Цей принцип нещодавно було продемонстровано на пацієнтах з пухлиною Вільмса, які мали мутації на ранніх стадіях розвитку, що призвело до двосторонніх мультифокальних пухлин із спільною мутацією драйвера. Важливо, що було також показано, що в цьому сценарії незалежні пухлини розвиватимуть унікальні додаткові мутації в міру розвитку пухлини. Загалом мозаїцизм є рідкісним явищем і малоймовірним у цьому дослідженні, оскільки 3 пацієнти продемонстрували пухлини зі спільними додатковими соматичними генними мутаціями (MTOR і ARID1A для пацієнта 3; PBRM1, SETD2 і NFE2L2 для пацієнта 4; PBRM1 і KDM5C для пацієнта 5), які можна поділити лише через метастази, а не через мозаїцизм. Крім того, у 2 пацієнтів із спільними мутаціями VHL (пацієнти 2 і 3) також було проведено секвенування прилеглої нормальної тканини нирки, яка не виявила ознак мутації VHL. Нарешті, у 4 з 5 пацієнтів (пацієнти з 1 по 4) розвинулися метастази поза нирками

Слід зазначити, що пацієнт 5 ще не продемонстрував ознак віддалених метастазів. Хоча його найбільша пухлина становила 4,8 см, і його можна вважати групою підвищеного ризику метастатичного поширення, спостереження про те, що всі 7 його нещодавно видалених пухлин мають спільні мутації VHL, а більшість — мутації PBRM1 і KDM5C, підвищує підозру щодо віддалених метастазів ще більше. Як наслідок, за цим пацієнтом у подальшому будуть проводити особливо ретельне та ретельне спостереження.

Таблетки цистанхи і цистанхи сухі

Пацієнти з самостійно виниклими пухлинами нирки продемонстрували збагачення сімейної історії раку нирки та раннього початку захворювання, обидва з яких є показниками успадкованих змін зародкової лінії. Усі пацієнти мали негативний результат скринінгу щодо відомих патогенних варіацій гена раку нирки, що свідчить про те, що можуть бути альтернативні невідомі генетичні причини. Було також показано, що транслокація зародкової лінії із залученням хромосоми 3p підвищує ризик ccRCC і пов’язана з двостороннім мультифокальним захворюванням. Транслокації не виявляються цільовими масивами генів і потребують аналізу каріотипу. Таким чином, пацієнти з самостійно виниклими пухлинами нирок, які проявляються без мутацій у відомих генах сприйнятливості до РСС, також повинні пройти скринінг на транслокації хромосоми 3p. Аналіз каріотипу був доступний для 12 з 14 пацієнтів з незалежно виниклими пухлинами нирок у цьому дослідженні, але відповідних транслокацій не спостерігалося. Подальше обстеження цих пацієнтів на предмет додаткових змін зародкової лінії може виявити нові гени сприйнятливості до РСС, а аналіз спектра мутацій VHL дозволяє відібрати цих пацієнтів.

Стає все більш поширеним проведення цільового аналізу мутації гена раку на пухлинах пацієнтів або біопсіях, і ці аналізи часто включають ген VHL, а також додаткові гени, асоційовані з ccRCC, такі як PBRM1, BAP1, SETD2 і ARID1A. Таким чином, рутинна двостороння біопсія двосторонніх ниркових утворень може забезпечити простий і ефективний метод розрізнення контралатеральних метастазів і незалежно виникаючих мультифокальних пухлин, на відміну від аналізів на основі хромосомних змін, які проводилися раніше, що дозволяє отримати подальше підтвердження у пацієнтів з метастатичне захворювання. Кілька недавніх досліджень підкреслили внутрішньопухлинну гетерогенність, присутню в ccRCC, і це може заплутати аналіз біопсії, оскільки в ділянці зразка може бути відсутнім мутація, яка присутня лише в деяких областях пухлини, і це дасть неточні результати. Перевага оцінки мутації VHL полягає в тому, що вона присутня в більшості ccRCC і є ранньою стовбуровою мутацією, яка буде присутня у всій пухлині, тому біопсія майже завжди повинна бути інформативною.

Важливість можливості відрізнити пацієнтів із метастатичним захворюванням або локалізованими незалежно виниклими пухлинами нирки полягає в тому, що вони будуть лікуватися по-різному та потенційно матимуть чітко різні результати. Хоча докази метастазування поза ниркою є переконливими, візуалізація пацієнтів із ccRCC BMF не дозволяє точно визначити. У цьому дослідженні цю проблему найкраще ілюструють пацієнти 4, 9 та 19, оскільки всі 3 мали двобічне захворювання з великою пухлиною в одній нирці та меншою пухлиною або пухлинами в контралатеральній нирці та відсутні синхронні ознаки уражень за межами нирки. нирка. Без аналізу мутацій VHL єдиною помітною особливістю є те, що пацієнт 19 мав наймолодший початок у віці 36 років, а пацієнт 9 мав останній початок у віці 62 роки. Оцінка спектру мутацій VHL показала, що обидва пацієнти 9 і 19 мали різні зміни VHL у різні пухлини, що відповідають самостійно виниклим пухлинам нирки. Навпаки, пацієнт 3 мав однакову спільну мутацію VHL у всіх пухлинах, що відповідає спільному походження та контралатеральним метастазам. Це було підтверджено спільною наявністю спільних додаткових соматичних мутацій у MTOR та ARID1A у всіх пухлинах пацієнта 3. Таким чином, пацієнтів 9 і 19 можна лікувати хірургічним видаленням пухлин і регулярним наглядом, тоді як пацієнта 3 можна лікувати системною терапією, яка підходить для пацієнта з метастатичним захворюванням.

Підсумовуючи, аналіз зміни VHL у BMF ccRCC може допомогти відрізнити контралатеральні метастатичні пухлини нирки від локалізованих, незалежно виникаючих пухлин нирок, і це можна використовувати для впливу на лікування пацієнта та результат.

Список літератури

1. Linehan WM, Walther MM, Zbar B. Генетична основа раку нирки. J Urol. 2003; 170 (6 Pt 1): 2163–2172.

2. Чин А.І., Лам Дж.С., Фіглін Р.А., Беллдегрун А.С. Стратегії спостереження за пацієнтами з нирково-клітинною карциномою після нефректомії. Преподобний Урол. 2006; 8: 1–7.

3. Shao N, Wan F, Abudurexiti M, Wang J, Zhu Y, Ye D. Причини смерті та умовне виживання нирково-клітинної карциноми. Передній онкол. 2019; 9: 591.

4. Gnarra JR, Tory K, Weng Y та ін. Мутації гена супресора пухлини VHL при карциномі нирки. Нат Генет. 1994;7:85-90.

5. Нікерсон ML, Jaeger E, Shi Y та ін. Покращена ідентифікація змін гена фон Гіппеля-Ліндау в світлоклітинних пухлинах нирок. Clin Cancer Res. 2008; 14: 4726–4734.

6. Дослідження атласу геному раку n. комплексна молекулярна характеристика світлоклітинної нирково-клітинної карциноми. природа 2013;499:43-49.

7. Zbar B, Brauch H, Talmadge C, Linehan M. Втрата алелів локусів на короткому плечі хромосоми 3 при нирково-клітинному раку. природа 1987;327:721-724.

8. Ricketts CJ, Linehan WM. Мультирегіональне секвенування з’ясовує еволюцію світлоклітинної нирково-клітинної карциноми. Стільниковий. 2018;173:540-542.

9. Сайєд Дж. С., Нгуєн К. А., Холфорд Т. Р., Хофманн Дж. Н., Шуч Б. Фактори ризику метахронного двостороннього нирково-клітинного раку: спостереження, епідеміологія та аналіз результатів. Рак. 2019;125:232-238.

10. Crispen PL, Lohse CM, Blute ML. Мультифокальна нирково-клітинна карцинома: клініко-патологічні особливості та наслідки пухлин

11. Wiklund F, Tretli S, Choueiri TK, Signoretti S, Fall K, HO Adami. Ризик двостороннього раку ниркових клітин. J Clin Oncol. 2009; 27: 3737-3741.

12. Ji Z, Zhao J, Zhao T, Han Y, Zhang Y, Ye H. Незалежне походження пухлини у двох випадках синхронної білатеральної світлоклітинної нирково-клітинної карциноми. Sci Rep. 2016; 6: 29267.

13. Міяке Х, Накамура Х, Хара І та ін. Мультифокальна нирково-клітинна карцинома: ознаки спільного клонального походження. Clin Cancer Res. 1998; 4: 2491-2494.

14. Юнкер К., Трам К., Шліхтер А., Мюллер Г., Хіндерманн В., Шуберт Дж. Клональне походження мультифокальної нирково-клітинної карциноми, визначене мікросателітним аналізом. Журнал урології. 2002; 168: 2632-2636.

15. Уеллс Г.М., Шрот В., Браух Х., Росс Е.А. Двостороння нирково-клітинна карцинома, пов’язана з набутою мутацією VHL і тривалим впливом трихлоретилену. Клін Нефрол. 2009;71:708–713.

16. Лінехан В.М. Генетична основа двостороннього раку нирки: наслідки для оцінки та лікування. J Clin Oncol. 2009; 27: 3731-3733.

17. Linehan WM, Srinivasan R, Schmidt LS. Генетична основа раку нирки: метаболічне захворювання. Nat Rev Urol. 2010; 7: 277-285.

18. Linehan WM, Ricketts CJ. Метаболічні основи раку нирки. Semin Cancer Biol. 2013;23:46–55.

19. Latif F, Tory K, Gnarra J та ін. Ідентифікація гена-супресора пухлини хвороби фон Гіппеля-Ліндау. Наука. 1993; 260: 1317-1320.

20. Choyke PL, Glenn GM, Walther MM, Patronas NJ, Linehan WM, Zbar B. von Hippel-Lindau disease: генетичні, клінічні та візуалізаційні особливості. Радіологія. 1995;194:629-642.

21. Kechrid M, Malik GH, Al-Mohaya S, et al. Нирково-клітинний рак контралатеральної нирки з вторинними пухлинами в жовчному міхурі через вісім років після нефректомії. Saudi J Kidney Dis Transpl. 2000; 11: 587-592.

22. Wang K, Wang J, Sun JI та ін. Нирково-клітинна карцинома з метахронними метастазами в контралатеральні наднирники та сечовий міхур: опис випадку. Oncol Lett. 2015; 10: 2749–2752.

23. Ахмед Х.К., Бапір Р., Абдула Г.Ф., Хассан КМС, Алі Р.М., Саліх М.А. Одиночний контралатеральний метастаз нирковоклітинної карциноми надниркових залоз через 15 років після радикальної нефректомії: опис випадку та огляд літератури. Int J Surg Case Rep. 2019;58:33–36.

24. Coorens THH, Treger TD, Al-Saadi R та ін. Ембріональні попередники пухлини Вільмса. Наука. 2019;366:1247-1251.

25. Foulkes WD, Polak P. Двосторонні пухлини - успадковані чи набуті? N Engl J Med. 2020;383:280-282.

26. Коен А. Дж., Лі Ф. П., Берг С. та ін. Спадковий нирково-клітинний рак, асоційований з хромосомною транслокацією. N Engl J Med. 1979;301:592-595.

27. Фостер Р.Е., Абдулрахман М., Морріс М.Р. та ін. Характеристика транслокації 3;6, пов’язаної з нирково-клітинною карциномою. Гени Хромосоми Рак. 2007;46:311-317.

28. Gerlinger M, Horswell S, Larkin J та ін. Геномна архітектура та еволюція світлоклітинних нирковоклітинних карцином, визначених мультирегіональним секвенуванням. Нат Генет. 2014;46:225-233.

29. Turajlic S, Xu H, Litchfield K та ін. Детерміновані траєкторії еволюції впливають на ріст первинної пухлини: TRACERx Renal. Стільниковий. 2018;173:595-610. e511.

Кеті Д. Воке, Крістофер Дж. Рікеттс, Адам Р. Метваллі, Пітер А. Пінто, Рабіндра Гаутам, Марк Раффельд, Марія Дж. Меріно, Марк В. Болл і В. Марстон Лінехан