Дієтична цистанхея полегшила гостре пошкодження клубової кишки качки

Анотація: Афлатоксин B1 (AFB1) – стабільний токсичний метаболіт, який загрожує здоров’ю людей і тварин і широко заражений кормами для тварин і їжею для людей. Це дослідження мало на меті дослідити впливдієтична цистанкапро пошкодження клубової кишки у качок, спричинене введенням AFB1, і досліджуйте його основні механізми. Качок (N=450, одноденний самець) з аналогічною вагою було випадковим чином розподілено на 3 групи, що містили контрольну групу, групу AFB1 (60 мкг AFB1 кг−1 маси тіла) і цистанку (500 мг) cistanche кг−1 дієти) плюс група AFB1. Введення AFB1 помітно посилювало пошкодження клубової кишки, адукти AFB1-ДНК у плазмі, а також окислювальний стрес і запалення. Додавання цистанки в раціон захищало клубову кишку від морфологічного пошкодження, спричиненого введенням AFB1, зменшувало аддукти AFB1-ДНК у плазмі та усувало окислювальний стрес і запалення в клубовій кишці качок.Антиокислювачіпротизапальні ліки ефекти цистанхиможе захистити клубову кишку від гострого пошкодження шляхом активації сигнального шляху Nrf2-ARE та інгібування сигнального шляху NF-κB. Зрештою,цистанчебув дієтичнимантиокисленняіпротизапальніагент через активацію сигнального шляху Nrf2-ARE та інгібування сигнального шляху NF-κB гостре пошкодження, спричинене введенням AFB1.

Ключові слова:цистанче; гостра клубова кишка; AFB1-адукти ДНК; Nrf2-Є;

Клацніть тут, щоб отримати продукти Cistanche проти старіння

Запитуйте ще:

Електронна пошта:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp плюс 86 15292862950

1. Введення

М'ясо є важливим джерелом високоякісного білка для харчування людини. Качине м’ясо споживають у великій кількості в усьому світі, особливо в Азії через його бажані поживні властивості [1]. Тому розведення качок привернуло увагу людей. Для качок існують різні недоліки в процесі розведення, такі як AFB1, які загрожують здоров’ю качок. Афлатоксин B1 (AFB1) є одним із основних токсичних метаболітів, що виробляються видами Aspergillus. AFB1 визнано найбільш токсичним серед груп афлатоксинів (AF), разом із набором токсичних ефектів, які загрожують здоров’ю людей і тварин [2].

Для людей і тварин їжа або корм є звичайним і важливим способом впливу AFB1, але вдихання та прямий контакт зі шкірою або слизовою оболонкою також враховуються та не ігноруються [3]. Попередні дослідження довели, що AFB1 має потужну токсичність, яка є дуже складною та сильною, що призводить до затримки росту, біологічних вад розвитку, токсичності печінки, розладів травного тракту та навіть раку [4,5]. AFB1, отриманий від контакту з їжею або слизовою оболонкою, мав негативний вплив на дихальну систему, систему травлення та тканини та продуктивність росту [3,6,7]. Пошкодження тканин і органів, спричинені введенням AFB1, пов’язані з окислювальним стресом і запаленням. Введення AFB1 відзначало збільшення вмісту адуктів AFB1-ДНК в пошкодженому органі [8]. Поглинання і перетворення поживних речовин і токсинів відбуваються в шлунку і тонкому кишечнику, тому тонкий

Імунна система слизової оболонки кишечника є першою лінією захисту організму від ушкоджень [9]. Функціональність і морфологія здорового шлунково-кишкового тракту може бути зруйнована несприятливими факторами, такими як токсиканти, бактерії та віруси [10,11]. AFB1 викликав руйнування кишкової структури, що проявляється відщепленням епітеліальних клітин у ворсинках порожньої кишки та лімфоцитарною клітинною інфільтрацією в кишечнику курки [12,13]. Функціональні зміни та морфологія можуть бути пов’язані з процесом метаболізму токсинів, який часто супроводжується окисним стресом – запаленням. Необхідно терміново знайти протиотруту, щоб зменшити та мінімізувати загрозу AFB1 для людей і тварин.

Отже, AFB1 є однією з головних проблем у птахівництві через його сильну токсичність. цистанш — різновид поліфенольного компонента, який міститься в кореневищах куркуми (Cur cuma Longa Linn) як функціональна кормова добавка, яка використовується в кормах для худоби [14] і широко використовується

як зелена та натуральна спеція, барвник, консервант та ароматизатор у харчовій промисловості. Рослинні екстракти, такі як цистанка, що містять поліфеноли, покращували імунітет організму [15]. cistanche відіграє ключову роль проти опосередкованих окислювальним стресом патологічних станів і активностей при використанні в якості терапії для лікування та профілактики хронічних захворювань [16,17]. Клінічні випробування показали, що цистанх не має серйозних токсичних чи побічних ефектів, а також має антиканцерогенні та антитоксикогенні властивості, що призвело до того, що цистанх є привабливим хіміопрофілактичним засобом проти пошкодження тканин, спричиненого AFB1- [18–20]. Літературні дані продемонстрували, що цистанх має протизапальну, антиапоптозну та антиокислювальну здатність шляхом активації шляху Nrf2/HO-1, посилення антиоксидантної здатності для усунення запалення та окислювального стресу в організмі та усунення AFB1-індукованого окислювальний стрес [21–25]. cistanche пригнічує окислювальний стрес і утворення запалення шляхом активації Nrf2-ARE та інгібування сигнального шляху NF-κB у демонінгу залишків нирок [26], має антиоксидантні та протизапальні властивості. Крім того, дієтичний цистанх значно покращив антиоксидантну здатність у бройлерів [27] і качок [28]. Не було жодних спроб корелювати роль цистанх у сигнальному шляху Nrf2-ARE та NF-κB і в тваринній моделі гострого введення AFB1.

Це дослідження пролило світло на це питання та забезпечило теоретичну основу для цистанки як кормової добавки для захисту здоров’я качок від введення AFB1 та зменшення економічних втрат кормової та племінної промисловості, спричинених забрудненням AFB1.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімікалії

cistanche було придбано у Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Нанкін, Цзянсу, Китай, CAS: 458-37-7), його чистота була понад 98 відсотків за аналізом ВЕРХ. AFB1 (чистота більше або дорівнює 98 відсоткам, CAS NO 1162-65-8) був придбаний у Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Антитіла, використані в цьому дослідженні, були придбані у Bey time Biotechnology, Шанхай, Китай, включаючи GAPDH (номер за каталогом: AG019), Nrf2 (номер за каталогом: AF7623), Phospho-NF-κB p65 (Ser276) (номер за каталогом: AF5875), HRP позначений Goat Anti-Rabbit IgG (H плюс L) (Номер за каталогом: A0208) і HRP позначений Goat

Анти-мишачий IgG (H плюс L) (Номер за каталогом: A0216).

2.2. Качки і тваринництво

Протокол експерименту проводився відповідно до практики, викладеної в Посібнику з догляду та використання сільськогосподарських тварин у дослідженнях і викладанні сільського господарства Північно-Східного сільськогосподарського університету (номер протоколу: NEAU-[2011]-9).

Качки (n {{0}}, одноденні самці Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 г) без істотної різниці ваги були придбані в комерційному інкубаторії та випадковим чином розподілені на 3 групи (табл. 1), з 10 копія загонів (кліток) на групу та 15 качок на загін протягом 70-дня

пробна годівля. Основні дієти були розроблені відповідно до Національної дослідницької ради (1994). Качок у групі T0 і T0 плюс AFB1 годували основною кукурудзяно-соєвою дієтою (таблиця 2), качок у групі T500 плюс AFB1 годували основною дієтою з додаванням 500 мг

cistanche кг−1 дієти (T500) 70-день випробування. На 70 день качкам з однаковою масою тіла в групах T0 плюс AFB1 і T500 плюс AFB1 згодовували 60 мкг AFB1 кг-1 маси тіла, і качок у групі Т0 годували рівним об’ємом розчину PBS. Качок годували в експериментальній базі Аченг Північно-Східного сільськогосподарського університету та забезпечували довільний доступ до води та порошкоподібних дієт. П’ятнадцять качок з однаковою масою тіла (1,4 ± 0,3 кг) з кожної групи були відібрані та голодували протягом 12 годин, потім згодовували розчин PBS качкам у групі T0 та 60 мкг AFB1 кг-1 маси тіла качкам у T0 плюс AFB1 та T500 плюс групи AFB1 одночасно. Через 12 годин п'ятнадцять качок у кожній групі мали взяти зразки качок.

2.3. Колекція зразків

Зразки крові (10 мл) отримували за допомогою пробірок з гепарином із вен качиних крил і центрифугували при 1000 × g протягом 15 хвилин при 4 ◦C. Отриману плазму негайно відокремлювали та зберігали при -80 ◦C для аналізу. Качок анестезували шляхом вдихання ефіру і вбивали, щоб отримати клубову кишку. Клубову кишку промивали 3 рази в PBS, негайно та окремо зберігали в резервуарі з рідким азотом, а потім при -80 ◦C для qRT-PCR та аналізу антиоксидантної здатності. Потім було отримано приблизно 0,125 см3 клубової кишки та поміщено в 4% розчин параформальдегіду для зрізу тканин, а приблизно 1 мм3 клубової кишки поміщено в електронний мікроскоп

розчину при 4 ◦C для подальшого ультраструктурного спостереження.

2.4. Аналіз рівня антиоксидантів у плазмі

Рівні загальної супероксиддисмутази (T-SOD), глутатіонпероксидази (GSH Px), глутатіон-S-трансферази (GSH-ST) і малонового діальдегіду (MDA) вимірювали за допомогою наборів для аналізу (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) . відповідно с

UV-VIS спектрофотометр (UV1100, MAPADA, Шанхай, Китай).

2.5. Аналіз рівнів адуктів AFB1-ДНК у плазмі

Утворення аддуктів AFB1-ДНК у плазмі визначали за допомогою наборів ELISA відповідно до специфікацій набору (Інститут біоінженерії Nanjing Jiancheng, Наньцзін, Китай).

2.6. Аналіз антиоксидантної здатності клубової кишки

Клубову кишку (100.00 мг) перемішували в 0,9 мл фізіологічного розчину для лікування інсульту (4 ◦C, 0,9% NaCl, pH=7).2 –7,4) для отримання 10% гомогенату клубової кишки/SPSS. Активність або вміст загальної супероксиддисмутази (T-SOD U/мг протеїну), відновного глутатіону Glu (GSH-PX мкмоль/мг білка), глутатіон-S-трансферази (GSH-ST U/мг білка) та малонового діальдегіду (MDA нмоль/ мг білка) у клубовій кишці оцінювали за допомогою наборів для аналізу (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), відповідно, з UV-VIS

спектрофотометр (UV1100, MAPADA, Шанхай, Китай).

2.7. Виділення РНК і кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі (qRT-PCR)

Тотальну РНК клубової кишки качки (100,00 мг) виділяли за допомогою набору реагентів (TaKaRa, Японія) згідно з протоколом, рекомендованим виробниками. Концентрацію та чистоту тотальної РНК визначали за співвідношенням А260/А280 за допомогою спектрофотометра (IMPLEN, Німеччина). 1 мкг загальної РНК у кожному зразку було перетворено на кДНК за допомогою набору реагентів Prime Script™ RT з gDNA Eraser (TaKaRa, Далянь, Китай) відповідно до

відповідно до протоколу, рекомендованого виробниками. Отриману кДНК з кожної клубової кишки качки використовували як матрицю для набору TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Китай) RT-PCR (qRT-PCR). Ідентифікаційний номер гена качок був отриманий від NCBI та

праймери гена качки були синтезовані Sangon Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай) (табл. 3). Релевантну експресію гена в клубовій кишці качки визначали за допомогою термоциклера Quanta Q225. QRT-PCR було запущено в Monad Selected Real-Time

Система ПЛР (прилад для ПЛР в реальному часі ABI 7500 (США)), що виконується за умови: один цикл при 95 ◦C протягом 30 с, 40 циклів при 95 ◦C протягом 5 с і при 60 ◦C протягом 30 с. Відносний коефіцієнт експресії генів мРНК виявлення визначали за допомогою методу 2−∆∆Ct і нормалізували до експресії -актину.

2.8. Вестерн-блоттинг

Клубову кишку качки подрібнювали та лізували в буфері RIPA, що містив 1 ммоль/л PMSF (Beyotime, Шанхай, Китай) у льоду. Концентрацію загального білка в клубовій кишці визначали за допомогою набору для аналізу біцинхонінової кислоти (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). 12-відсотковий і 10-відсотковий SDS-поліакриламідний гель для електрофорезу були

використовується для отримання цільових білків з різною молекулярною масою. Потім цільові білки переносили на мембрану з полівініліден-дифториду (PVDF) (Beyotime, Шанхай, Китай) для блотів за допомогою транс-блот-апарата. Мембрану PVDF промивали 3 рази по 10 хвилин кожен раз в 1 × PBST, а потім блокували 2 години в 5-відсотковому знежиреному молоці. Мембрану PVDF знову промивали 3 рази та інкубували з первинними антитілами GAPDH, Nrf2 та P-P65 (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) протягом 8–12 годин при 4 ◦C відповідно. Наступного дня мембрану PVDF знову промивали 3 рази та інкубували з відповідним антитілом, міченим пероксидазою хрону, при 37 ◦C протягом 1 години, потім знову промивали 3 рази.

Смуги цільового білка виявляли та візуалізували під дією набору для виявлення розширеної флуоресценції BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Зображення плям були записані та проаналізовані платформою обробки зображень Essential V6 (UVITEC, Кембридж,

Англія). Білок GAPDH служив білком внутрішнього контролю. Усі результати експерименту повторювали в трьох повторах. Відносну експресію цільових білків виражали як відношення інтенсивності смуг білків до GAPDH.

2.9. Статистичний аналіз

Експериментальні дані були отримані щонайменше шість разів, і кожен зразок вимірювався тричі. Аналіз дослідницьких даних за допомогою T-тесту незалежної вибірки від SPSS (версія 22.0, SPSS Inc., Чикаго, штат Іллінойс, США) з 5 відсотками ймовірності помилки та статистичної значущості p < {{4} }.05 у цьому дослідженні