Вплив дизельних вихлопів змінює вираження мереж, залучених до нейродегенерації в мозку рибки даніо. Частина 2

Приготування проби білка

Щоб підготувати зразки білка, голови від 80 до 100 анестезованих личинок (5 pdf) ретельно ізолювали та промивали PBS перед перенесенням у буфер для лізису, який складався з 15% попередньо охолодженого TCA/ацетону, що містить 0,07% бета-меркаптоетанолу (ME). )та коктейль інгібіторів протеаз (потребує виробник) загальним об’ємом 500 мкл.

В останні роки спостерігається значний інтерес до впливу зразків білка на пам'ять. Все більше людей починають усвідомлювати важливість дієти для здоров’я, особливо важливу роль білка в організмі людини.

Білки є основним будівельним матеріалом людського організму і відіграють важливу роль в організмі людини. Через це зразки білка стали важливим каналом для багатьох людей у ​​їхній гонитві за здоров’ям і красою. Окрім нарощування м’язів і формування тіла, протеїнові зразки також можуть покращити пам’ять людини.

Деякі вчені вивчали зв'язок між білками і пам'яттю. Вони виявили, що тривале споживання достатньої кількості білка корисно для всіх аспектів фізичного здоров’я, особливо для пам’яті. З’являється все більше доказів того, що споживання білка з їжею має важливий вплив на роботу мозку та пам’ять.

Білок є важливим компонентом нейронів людського мозку, тому щоденне споживання білка має важливий вплив на пам’ять і мислення людей. Тривале споживання білка не тільки задовольняє потреби організму в білку, але й допомагає мозку залишатися активним і здоровим.

Крім того, білок також може допомогти організму підтримувати баланс цукру в крові та підтримувати стабільний настрій. Це дуже важливо для збереження пам'яті та мислення. Таким чином, помірне споживання білка може допомогти поліпшити різні когнітивні функції та емоційний стан організму людини.

Загалом існує тісний зв’язок між зразками білка та пам’яттю. Збільшення споживання білка допомагає підтримувати мозок і тіло здоровими, покращуючи навички мислення та пам’ять. Людям, які потребують поліпшення пам'яті, вкрай необхідно вживати достатню кількість білка. Ми повинні правильно споживати білкову їжу та приділяти увагу розумному харчуванню, щоб підтримувати здорове тіло та гострий розум. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola має антиоксидантну, протизапальну та антистарільну дію, що може допомогти зменшити окислення та запальні реакції в мозку, тим самим захищаючи здоров'я нервової системи. Крім того, Cistanche deserticola також може сприяти росту та відновленню нервових клітин, таким чином покращуючи зв’язок і роботу нейронних мереж. Ці ефекти можуть допомогти покращити пам’ять, навчання та швидкість мислення, а також можуть запобігти розвитку когнітивної дисфункції та нейродегенеративних захворювань.

Клацніть знати добавки для покращення пам’яті

Після короткочасної гомогенізації білки осаджували протягом 12 годин при 20 градусах з подальшим центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 5 хвилин при 4 градусах. Супернатант видаляли, а гранулу білка двічі промивали холодним ацетоном (містить 0.07% ME та суміш інгібіторів протеази). Кінцевий осад білка розчиняли в буфері для лізису, що містив 7,0 М сечовини, і 2,0 М тіосечовини обробкою ультразвуком на льоду.

Зразки розчиненого білка центрифугували при 15,000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 градусах, щоб осадити нерозчинні частинки, і концентрацію кінцевих зразків білка вимірювали за допомогою методу Бредфорда.

Високопродуктивний протеомний аналіз на основі TMT

Зразки були відновлені, алкіловані та розщеплені шляхом послідовного додавання трипсину та протеаз lys-C. Потім пептиди позначали ізобаричними мітками 10-plexTMT відповідно до інструкцій виробника. Мічені зразки змішували, а потім тонко фракціонували за допомогою хроматографії з оберненою фазою високого pH.

Потім окремі фракції аналізували за допомогою РХ-МС/МС за допомогою онлайн-хроматографії з оберненою фазою та тандемної мас-спектрометрії на мас-спектрометрі Thermofsher Fusion Lumos. Дані були отримані за допомогою методу MS3 на основі синхронного відбору прекурсорів, як описано раніше (McAlister et al. 2014). Пошук у базі даних та вилучення інформації про репортерні іони TMT проводили за допомогою програмної платформи MaxQuant (Cox and Mann 2008).

Порівняння даних TMT між зразками проводили за допомогою MSStats (Choiet al. 2014). Транскриптомний аналіз. Приблизно 80–100 голів виділяли з анестезованих ембріонів (120 годин), промивали PBS і піддавали екстракції загальної РНК за допомогою Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis). , США) реагент, дотримуючись інструкцій виробника.

Якість і кількість РНК оцінювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA), а потім за допомогою біоаналізатора Agilent 2100, щоб забезпечити мінімальну концентрацію 50 нг/мкл і число цілісності РНК (RIN) 8. Підготовку бібліотеки потім проводили за допомогою Illumina HiSeq4000 відповідно до протокол: «Робочий процес підготовки бібліотеки TruSeqStranded Total RNA Library with Ribo-Zero Gold», а зразки секвенували за такими умовами: «Спарений кінцевий цикл, R1=75 цикли (антисмисловий ланцюг), Index=8 цикли, R2=75 цикли (смисловий ланцюг)."

Аналіз даних

Обидва набори даних для протеомних і транскриптомічних досліджень були одночасно завантажені та проаналізовані за допомогою онлайн-інструменту Metascape, який дозволяє анотувати гени для різних видів, включаючи Danio rerio (Zhou et al. 2019). Щоб оцінити внесок зміни профілю протеома або транскриптома на певних шляхах, дані були проаналізовано за допомогою програмного забезпечення Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).

Набори даних, що містять ідентифікатори генів або білків і відповідні значення експресії, були завантажені в додаток. Кожен ідентифікатор було зіставлено з відповідним об’єктом у базі знань Ingenuity.

Було встановлено межу зміни експресії в 1.{1}}кратний для ідентифікації молекул, експресія яких диференційовано регулювалася. Функціональний аналіз визначив біологічні функції та/або захворювання, які були найбільш значущими для набору даних. Для аналізу розглядалися молекули з набору даних, які відповідали порогу та були пов’язані з біологічними функціями. Правосторонній точний критерій Фішера використовувався для обчислення значення p, яке визначає ймовірність того, що кожна біологічна функція та/або хвороба, віднесена до цього набору даних, є лише випадковістю.

Аналіз шляху

Щоб оцінити внесок змін профілю протеома або транскриптома в певних шляхах, обидва набори даних були завантажені в програмне забезпечення IPA (Krämer et al. 2014). Найбільш істотно змінені канонічні шляхи потім були додатково оцінені та інтерпретовані за допомогою ПЛР та вестерн-блоттингу, як описано нижче.

Вестерн-блот

Загалом 25 мкг білків було завантажено на 12% NuPAGE (Novex, CA) і перенесено на PVDF-мембрани (Novex, CA), як описано (MahmoudianSani та ін. 2017; Rafee та ін. 2019). Мембрани блокували 5% знежиреного молока в трис-забуференому фізіологічному розчині та 0,01% твіну 20 (TBST буфер) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім інкубували протягом ночі при 4 градусах або з кролячими поліклональними анти-Cyp1A1 (Abcam, CA) або мишачими моноклональними анти-GAPDH ( Abcam, CA), розведений у буфері TBST, що містить 1% знежиреного молока.

Після промивання в TBST блоти інкубували з вторинними ослячими анти-кролячими антитілами (Abcam, Каліфорнія) або козячими анти-мишачими антитілами (Санта-Круз, Каліфорнія) протягом 2 годин з подальшим проявом із застосуванням вестерн-блот-блот-субстрату Pierce™ ECL Plus ( Thermo Fisher Scientific, США). Смуги візуалізували за допомогою зображення за допомогою сканера LI-COR і проаналізували за допомогою денситометрії (LI_COR Biosciences, NE).

ПЛР в реальному часі

Загальну РНК виділяли з голів за допомогою реагенту TRIzol (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, США), дотримуючись інструкцій виробника, а потім вимірювали за допомогою спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Кількість 1 мкг кожного зразка РНК була зворотньо транскрибована за допомогою iScript™ суперміксу зворотної транскрипції (Bio-Rad, CA), і ПЛР у реальному часі проводилася за допомогою SsoAdvancedUniversal SYBR Green supermix (Bio-Rad, CA), і праймери перераховані у Додатковій таблиці 1. Відносні рівні експресії розраховували за допомогою методу 2−ΔΔCT, а для оцінки значущих відмінностей використовували статистичний Т-тест.

Результати і обговорення

Протеомний і транскриптомний аналізи є двома основними інструментами для розуміння молекулярних механізмів, що лежать в основі хворобливих процесів і реакції на подразники навколишнього середовища (Duan та ін. 2017; García-Estrada та ін. 2013; Jami та ін. 2014a, b, 2015; Kosalková та ін. 2012) . Тут ми провели глибокий аналіз експресії як на транскриптомному, так і на протеомному рівнях у головах ембріонів рибок даніо, які зазнали впливу DEPe.

Голови, що складаються в основному з тканини мозку, були ізольовані, щоб усунути профілі експресії інших тканин, оскільки ми зацікавлені у визначенні внутрішніх патологічних шляхів ЦНС.

Профіль експресії голів рибок даніо

Аналіз профілю дав 11 172 виявлені білки та 14 748 мРНК-мішеней з більш ніж 26 000 кодуючих генів (Howe et al. 2013). Серед 11 172 білків, ідентифікованих у зразках, мічених ТМТ (додаткова таблиця 2), 141 білок був значно активований, а 607 був знижений (додаткова таблиця 3 і рис. 1а). Подібним чином, 367 транскриптів були активовані, а 149 були знижені серед 14 748 транскриптів (додаткова таблиця 4), виявлених в аналізі RNA-seq (рис. 1b і додаткова таблиця 5).
У більшості випадків результати протеомного та транскриптомного аналізів з підвищеною регуляцією були послідовними. Наприклад, найбільш активовані білки включають цитохром P450 Cyp1a, Cyp1c1, гамма-субодиницю білка, що зв’язує гуаніннуклеотид, аннексин, коротку ізоформу плексину B2b, член дегідрогенази/редуктази (сімейства SDR) 13-як 1, S-антиген сітківки/епіфіза (арестин) b і сульфотрансфераза 6B1.

Подібним чином, гени з найвищою транскриптомікурегуляцією включають цитохром P450 (Cyp1a), ліганд 27a хемокіну (мотив C–C), репресор A арил-вуглеводневого рецептора, цитохром P450 (Cyp1b) і глікопротеїн сімейства Rh. Понижена регуляція білків і транскриптів, з іншого боку, не завжди були сильно корельовані.

Наприклад, комплексин 2, спектрин альфа, легкий ланцюг серцевого міозину -1, взаємодіючий білок SEC23, мембранна субодиниця АТФ-синтази EA, цитохром b і NAD-залежна протеїнова деацетилаза є одними з найпоширеніших білків із сильно зниженою регуляцією, тоді як мембранний білок 1a зовнішнього сегмента сітківки , сімейство носіїв розчиненої речовини 5 (йодидний транспортер), гомолог B онкогену вірусу остеосаркоми миші FBJ, комплексин 4c, FOS-подібний антиген 1a, опсин 1 і v-fos демонструють найвище зниження регуляції транскрипції (таблиці 1 і 2).

Антитіла, що розпізнають білки рибок даніо, обмежені, але ми підтвердили зразок цих змін за допомогою вестерн-блот-аналізу. Підвищення регуляції білка Cyp1A та зниження регуляції комплексину 2 (CPLX2) було підтверджено з використанням GAPDH як контролю навантаження (рис. 2a). Більш високі рівні транскрипції TAT і UGT1B1 і нижчі рівні CHNRB і TH2 також були підтверджені qPCR з використанням Elf-alpha як внутрішнього контролю (рис. 2b).

Анотація гена

Є кілька онлайнових біоінформаційних інструментів і програмного забезпечення, які можуть надати корисну інформацію про анотації генів. Серед них у цій роботі використовувався Metascape із можливістю анотації генів Danio rerio (Zhouet al. 2019).

Обидва набори даних для протеомних і транскриптомних досліджень були одночасно завантажені та проаналізовані за допомогою цього онлайн-інструменту. Після об’єднання результатів протеомних і транскриптомних змін у програмному забезпеченні кілька процесів, таких як відповідь на ксенобіотичний стимул, метаболізм ксенобіотиків цитохромом P450 і циркадіанна регуляція експресії генів були виявлені після лікування DEPe (рис. 3a).

Цей аналіз також запропонував пригнічені рівні біологічних процесів, таких як «Зорове сприйняття», «Фототрансдукція» та «інтерналізація рецептора, пов’язаного з білком G». Зміни в профілях експресії, пов’язаних із зором, не були неочікуваними, оскільки лікування DEPe під час раннього розвитку призвело до зменшення очей (дані не показано).

Сигналізація метаболізму ксенобіотиків

Ксенобіотики, які є чужорідними природними або синтетичними хімічними сполуками, можуть викликати клітинну реакцію на стрес, що призводить до диференціації, проліферації, апоптозу або некрозу. Дійсно, організм повинен активно захищатися від ксенобіотиків, а також токсичних ендогенних сполук та їхніх метаболітів за допомогою експресії ферментів і транспортерів, які беруть участь у їх елімінації та детоксикації.

Ці ферменти поділяються на три групи: ферменти фази I (CYP, ALDH, FMO), які вводять полярність у ксенобіотики; Ферменти фази II (UGT, GST, SULT), які забезпечують гідрофільність шляхом кон’югації гідрофільних молекул, таких як сульфат, глюкуронова кислота та глутатіон, із ксенобіотиками; та ферменти фази III (MDR1, OATP2, MRP), які транспортують ксенобіотики або кон’югати, утворені під час фази II до позаклітинної області.

Ці ферменти індукуються через сигнальні каскади, що включають специфічні рецептори (CAR, PXR, AHR) і MAPK-опосередковану активацію факторів транскрипції (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).

За відсутності активаторів конститутивно-активний рецептор (CAR) знаходиться в цитоплазмі у вигляді комплексу з CCRP і HSP90. Але коли присутній активатор, CAR транслокується в ядро ​​і зв’язується з RXR, утворюючи гетеродимер і далі зв’язується з декількома варіантами повторного мотиву, такими як DR3, DR4, ER6 і ER8, і сприяє регуляції експресії генів (додаткова таблиця 2).

Наш протеомний аналіз виявив активацію метаболізму ксенобіотиків. Дійсно, чітка регуляція CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (гемоксигеназа 1), CAT (каталаза) і CES1 (карбоксилестераза 1) свідчить про індукцію фази I метаболізму, у той час як підвищена експресія UGT1A1 (UDP глюкуронозилтрансфераза сімейства 1 член A1) і GSTP1 ( глутатіонS-трансфераза pi 1) вказує на активацію Фази II метаболізму.

Цікаво, що зниження регуляції сульфаттрансфераз, таких як SULT1A1 (член 1 сімейства сульфотрансфераз 1A), SULT1C2 (член 2 сімейства сульфотрансфераз 1C) і SULT2B1 (член 1 сімейства сульфотрансфераз 2B), свідчить про те, що підвищення гідрофільності в метаболізмі фази II переважно відбувається через кон’югацію з глюкуроновою кислотою та глутатіоном , але не сульфатної кон’югації (рис. 4).

Результати транскриптомного дослідження досить узгоджені, оскільки CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 і UGT1A1 активуються на рівнях РНК. Однак SULT2B1 демонструє активацію на рівні РНК (хоча недостатньо представлений на рівнях білка).

Це може бути наслідком залучення інших механізмів, які індукують деградацію або інактивацію ферментів сульфаттрансферази після лікування DEPe. Що особливо дивно, так це те, що ці зміни в метаболізмі ксенобіотиків відбулися в головах (імовірно, мозку) риб. Експресію ксенобіотичних генів було описано в нервовій системі ссавців, але це перше повідомлення про їх виявлення в мозку рибок даніо (McMillan and Tyndale 2018).

Ці висновки узгоджуються з подібним дослідженням, проведеним Шанкаром та його співробітниками, які перевіряли вплив різних груп поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ) навколишнього середовища на розвиток ембріонів і додатково оцінювали вплив кожного режиму лікування на профіль транскриптому.

На всьому тілі 48 ембріонів після запліднення (hpf) вони показали активацію Cyp1a як на рівні транскрипції, так і на рівні білка, що є раннім надійним біомаркером ксенобіотичної активації AHR і подальших транскриптомних змін (Shankar et al. 2019).

NRF2-опосередкована відповідь на окислювальний стрес

Окислювальний стрес може викликати апоптоз і некроз, і вважається, що він бере участь у нейродегенерації (Ahmadinejad et al. 2017; Jami et al. 2014b, 2015). Основною захисною реакцією клітин на оксидативний стрес є індукція антиоксидантних і детоксикуючих ферментів.

Фактор 2 (Nrf2), пов’язаний із 2-ядерним фактором і еритроїдом, зв’язується з промоторними елементами антиоксидантної відповіді (ARE) і активує їх транскрипцію. Неактивний Nrf2 зв'язується з актинзв'язуючим білком Keap1 і утримується в цитоплазмі.

Спровокований окислювальним стресом, Nrf2 фосфорилюється у відповідь на шляхи протеїнкінази С, фосфатидилінозитол 3-кінази та MAP-кінази. Потім фосфорильований Nrf2 може переміститися в ядро ​​і зв’язати ARE для трансактивації детоксикаційних і антиоксидантних ферментів (додаткова таблиця 3) (Ma 2013).

For more information:1950477648nn@gmail.com