Вплив дизельних вихлопів змінює вираження мереж, залучених до нейродегенерації мозку рибок даніо. Частина 1

Анотація

Нейродегенеративні захворювання є основною причиною інвалідності у світі, але їх етіологія здебільшого залишається невідомою. Генетичні фактори можуть становити лише меншу частину ризику для більшості цих захворювань, що свідчить про те, що фактори навколишнього середовища відіграють значну роль у розвитку цих захворювань.

Нейродегенеративні захворювання відносяться до типу захворювання, яке викликає дегенерацію клітин головного мозку внаслідок різних причин. До поширених належать хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона тощо. Ці хвороби вражають нейрони в мозку, що призводить до порушення функції мозку та таких симптомів, як пам’ять, мислення та зміни поведінки.

Однак нам не потрібно втрачати своє позитивне ставлення через ці хвороби. Існує багато способів допомогти пацієнтам поліпшити пам'ять і полегшити симптоми. Давайте розглянемо деякі з цих методів:

По-перше, займіться фізичними вправами. Дослідження показують, що фізична активність покращує кровообіг у мозку та збільшує виділення хімічних речовин, таких як дофамін та ендорфіни, які допомагають захистити та покращити функцію нейронів. У той же час фізичні вправи також можуть допомогти зменшити такі проблеми, як тривога, депресія та безсоння, завдяки чому пацієнтам буде приємніше сприймати життя.

По-друге, підтримувати соціальні стосунки. Також дуже важливо, що наші соціальні мережі тісно пов’язані з пов’язаними областями мозку, і соціальна взаємодія може не тільки зменшити стрес, але й покращити здоров’я мозку, підвищуючи відчуття щастя, борючись із депресією тощо.

Нарешті, добре їжте і висипайтеся. Обидва ці аспекти можуть мати важливий вплив на здоров’я мозку. Хороша дієта має не тільки включати достатню кількість поживних речовин, але й уникати багаторазового споживання цукру, насичених жирів і холестерину. Крім того, достатній сон може допомогти боротися з проблемами пам’яті на різних стадіях, особливо такими захворюваннями, як хвороба Альцгеймера.

Одним словом, нейродегенеративні захворювання не означають відмови від сподівань на життя. Зберігаючи позитивне ставлення, необхідно також застосовувати наукові та ефективні методи покращення якості життя. Більше сміху та більше сонячного світла допоможуть вам залишатися здоровими. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola є традиційним китайським лікарським матеріалом, який має багато унікальних ефектів, одним із яких є покращення пам’яті. Ефективність Cistanche deserticola пояснюється багатьма активними інгредієнтами, які він містить, включаючи дубильну кислоту, полісахариди, флавоноїдні глікозиди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними шляхами.

Натисніть «Знай 10 способів покращити пам’ять».

Нещодавно було виявлено, що тривалий вплив забрудненого повітря підвищує ризик розвитку хвороб Альцгеймера та Паркінсона, але молекулярні механізми, за допомогою яких це діє, недостатньо вивчені.

Ембріони рибок даніо, які піддалися впливу екстракту частинок вихлопних газів дизеля (DEPe), призводять до дисфункціональної аутофагії та втрати нейронів. Тут ми піддали ембріони даніо DEPe та провели високопродуктивний аналіз протеомної та транскриптомної експресії в їхньому мозку, щоб визначити патогенні шляхи, спричинені забрудненням повітря. Лікування DEPe змінило кілька біологічних процесів і сигнальних шляхів, пов’язаних з нейродегенеративними процесами, включаючи метаболізм ксенобіотиків, дозрівання фагосом і процесинг амілоїду. Найбільша індукція експресії генів у мозку була в Cyp1A (більше 30-раза).

Релевантність цієї зміни експресії була підтверджена блокуванням індукції за допомогою CRISPR/Cas9, що призвело до різкого підвищення чутливості до токсичності DEPe, підтверджуючи, що індукція Cyp1A була компенсаторним захисним механізмом.

Ці дослідження виявили порушені молекулярні шляхи, які можуть сприяти патогенезу нейродегенеративних розладів. Зрештою, визначення молекулярної основи того, як забруднення повітря підвищує ризик нейродегенерації, допоможе в розробці терапії, що змінює захворювання.

Ключові слова

Забруднення повітря · Деменція · Хвороба Паркінсона · Хвороба Альцгеймера · Транскриптоміка · Протеоміка.

вступ

Забруднення повітря є головним фактором смертності та пов’язане з респіраторними захворюваннями, серцевими захворюваннями, інсультом, раком легенів і діабетом. Нові епідеміологічні дані підтверджують зв’язок між забрудненням повітря та розвитком нейродегенеративних захворювань, у тому числі хвороб Альцгеймера та Паркінсона (AD та Parkinson) (Fu et al. 2019). Існує недостатня кількість досліджень механізмів, за допомогою яких забруднення повітря може підвищувати ризик AD і PD, але деякі з них підтверджують причинно-наслідковий зв’язок (Fu et al. 2019).

Накопичення білкових включень у мозку є універсальною ознакою нейродегенеративних розладів і, ймовірно, є загальним шляхом, що веде до дисфункції нейронів і смерті. Наприклад, утворення бета-амілоїдних (A-бета) і тау-структур є патологічними ознаками AD і агрегатів -синуклеїну (-syn) або тілець Леві при БП (Ross and Poirier 2004; Woulfe 2008).

Зміни в протеостазі, здається, принаймні частково лежать в основі утворення цих агрегатів, але точні механізми все ще невідомі та можуть відрізнятися в окремих людей залежно від генетичних факторів і факторів ризику середовища. Ми знаємо, що підвищена експресія або знижена деградація A-betaor-syn може призвести до AD і PD (Bostancıklıoğlu 2019; Johnson et al. 2019).

Іншими поширеними ознаками нейродегенеративних розладів є запалення та окислювальний стрес. Активована мікроглія, запальні клітини в ЦНС, може бути легко оцінена при розтині головного мозку AD і PD і, ймовірно, сприяє патогенезу нейродегенерації (Kannarkat et al. 2013). Вважається, що це запалення та, можливо, мітохондріальна дисфункція призводять до окислювального стресу, який також оцінюється на розтині мозку (Picca та ін. 2020).

Більшість механістичних досліджень забруднення повітря та нейродегенерації на сьогоднішній день зосереджені на запаленні (Jayaraj et al. 2017). Здається, забруднення повітря посилює як запалення ЦНС, так і окислювальний стрес у мозку тварин і людини (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b and c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Йокота та ін. 2013a, b).

Особливий інтерес представляють висновки про те, що забруднене повітря посилює експресію деяких запальних генів у нюховій цибулині (OB) мишей, області мозку, де патологія БП спостерігається на дуже ранніх стадіях захворювання (Levesque та ін. 2011a, b; Yokota та ін. 2013a). . Запалення також спостерігалося у собак, які живуть у містах, порівняно з собаками, які живуть у сільській місцевості, і автори припустили, що ці зміни були спричинені високим рівнем забруднення повітря (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Ті ж автори також припустили, що -syn накопичується в мозку людей, які живуть у містах, через забруднення повітря (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). У недавньому дослідженні на моделі рибок даніо було повідомлено, що вплив DEPe викликає нейротоксичність і значне зменшення кількості нейронів через порушення аутофагії (Barnhill et al. 2020).

DEPe містить багато токсичних компонентів забруднення повітря і зазвичай використовується для моделювання впливу в системах культур клітин (Costa та ін. 2014; Hesterberg та ін. 2010; Levesque та ін. 2011b). Аутофагія є важливим внутрішньоклітинним механізмом видалення та знищення неправильно згорнутих білків і пошкоджених органел.

Дійсно, точна аутофагічна активність необхідна для клітинного гомеостазу, а дисфункціональна аутофагія в нейронах призводить до змін у виживанні та нейродегенерації (Kesidou та ін. 2013). У багатьох із цих досліджень є чіткі обмеження, але всі вони свідчать про те, що вплив забрудненого повітря підвищує ризик AD. та ПД. Наше розуміння механізмів, за допомогою яких забруднення збільшує цей ризик, обмежене, але ультрадрібні частинки та кілька компонентів забрудненого повітря можуть потрапляти в мозок або безпосередньо через нюхову цибулину через легені через кровотік (Kilian and Kitazawa 2018).

Ці частинки складаються з вуглецевого ядра та адсорбованих сполук, таких як поліциклічні ароматичні вуглеводні, метали, нітрати, сульфати та інші елементи, і складають значну частку забруднювачів повітря, особливо в міських районах. Багато з цих сполук були причетні до окисного стресу та клітинного токсичність додає правдоподібності причинно-наслідковому зв’язку забруднення повітря та нейродегенерації.

Детальні міждисциплінарні дослідження, включаючи клітинні та тваринні моделі, можуть дати розуміння причин захворювання та спрямувати майбутні терапевтичні підходи (Cannon and Greenamyre 2011). Серед модельних організмів, які використовуються для досліджень in vivo, Danio rerio (зебра) є потужною моделлю для вивчення токсикології, молекулярної генетики, токсикогеноміки та відкриття ліків.

Більшість біологічних шляхів є висококонсервативними у хребетних, і більшість функціональних генів людини мають гомологи у рибок даніо (Vaz et al.2018). Крім того, ембріони рибок даніо розвиваються швидко та незалежно, що дозволяє проводити аналіз на будь-якій бажаній стадії розвитку. Ці особливості разом із швидким розмноженням і низькою вартістю розведення роблять рибок даніо сприятливою моделлю для вивчення токсичних ефектів впливу навколишнього середовища.

Щоб краще зрозуміти молекулярні механізми, що стоять за патогенезом захворювання, було розроблено широкий спектр високопродуктивних підходів до профілювання експресії генів. Протеоміка на основі мас-спектрометрії та високопродуктивне секвенування РНК мають особливу перспективу у визначенні цікавих біологічних шляхів. Ці методи широко використовувалися для розуміння реакції клітинних і тваринних моделей на подразники навколишнього середовища (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

У цьому дослідженні ми провели аналіз експресії впливу лікування DEPe як на профілі протеомів, так і на транскриптоми в головах ембріонів рибок даніо. Виділення зразків із голови, яка в основному складається з тканини головного мозку, дозволило отримати більш специфічні для тканини профілі та мінімізувати ефекти, що походять від інших тканин. Тут ми описуємо змінену експресію генів і профілі білків у кількох шляхах, пов’язаних із нейродегенерацією в головах рибок даніо, які зазнали DEPe. Ці результати дають нове розуміння можливих механізмів, за допомогою яких забруднення повітря підвищує ризик AD і PD.

Матеріал і методи

Лікування риб і CRISPR/Cas9-генна нокдаун

Усі дослідження були схвалені Комітетом з прав тварин UCLA. Рибок даніо (AB) розводили за допомогою світлової стимуляції протягом 1 години, і загальну кількість 200 яєць інкубували протягом 24 годин при 28 градусах. Отримані ембріони декоріонували в проназі (2 мг/мл) і обробляли або DEPe (стандартні довідкові матеріали, NIST, Gaithersburg, MD) у кінцевій концентрації 20 мкг/мл, або носієм до 5 днів після запліднення (DPF).

Цю концентрацію було вибрано, оскільки вона призвела до втрати нейронів, як повідомлялося раніше, але без значної смертності (Barnhillet al. 2020). Нокдаун-рибу Cyp1A підготували наступним чином. Використовуючи інструменти, доступні на http://crispr.mit.edu, РНК CRISPR (Cyp1A-crRNA ) був розроблений на основі розташування відповідних сайтів PAM у першому екзоні гена Cyp1A.

Найкращий дизайн був придбаний у IDT DNA (www.idtdna.com) разом зі стандартною CRISPR-Cas9 tracrRNA. CrRNA для Cyp1Agene і tracrRNA окремо ресуспендували в 10 мМ трис-ЕДТА, щоб отримати кінцеву концентрацію 100 мкМ. Потім tracrRNA об’єднували з crRNA в 1 × дуплексному буфері (100 мМ ацетату калію; 30 мМ HEPES, pH 7,5; IDT ДНК), щоб отримати кінцеву концентрацію 10 мкМ. Суміш нагрівали до 95 градусів протягом 5 хвилин на киплячій водяній бані та повільно охолоджували до кімнатної температури, щоб забезпечити відпал комплементарних нуклеотидних послідовностей incrRNA і tracrRNA і утворення функціональної направляючої РНК (gRNA).

Потім об’єм 3 мкл відпаленої gРНК об’єднали з таким же об’ємом одноланцюгової ДНК донора (ssDNA; 200 мкМ), як послідовність матриці для мутантного Cyp1A. Кількість 3 мкг нуклеази Cas9 (IDT) у буфері для ін’єкцій 1 × (5 мМ KCl; 0,1 М фосфат натрію, pH 6,8) додавали до суміші для утворення кінцевих комплексів CRISPR/Cas9рибонуклеопротеїн (Cyp1A-RNP).

Для приготування Scramble RNP (SC-RNP) специфічну Cyp1A-crRNA було замінено на комерційну Scramble-crRNA без мішені в геномі. Ця послідовність усіх олігонуклеотидів, використаних у цій роботі, наведена в Додатковій таблиці 1. Яйцям вводили під стереомікроскопом приблизно 3 нл ін’єкційної суміші RNP.

Було виконано п’ять біологічних ін’єкцій (кожна реплікація включала 400–600 яєць, ін’єкційних Cyp1A-RNP, і 100–200 ін’єкцій SC-RNP), і всі мікроін’єкції були завершені протягом 60 хвилин. Яйця поміщали в пластикові чашки Петрі діаметром 100 мм і інкубували при 28 градусах у воді для яєць. Виживаність ембріонів контролювали протягом 7 днів.

Зображення риб, що вижили, були переглянуті на оцінку вади розвитку. Кожну личинку оцінювали сліпим способом на наявність 4 вад розвитку, включаючи вад розвитку голови, вад розвитку хвоста, серцевий набряк і набряк жовтка. Личинки з усіма 4 вадами розвитку отримували 4 бали, тоді як личинки, що нормально розвивалися, отримували 0. Для оцінки достовірних відмінностей використовували статистичний Т-критерій.

For more information:1950477648nn@gmail.com