Виявлення підвищеного рівня тетрагідробіоптерину в зразках сироватки крові пацієнтів з ME/CFS з ортостатичною непереносимістю: пілотне дослідження

Анотація:Міалгічний енцефаломієліт або синдром хронічної втоми (ME/CFS) — це мультисистемне хронічне захворювання, що характеризується сильною м’язовою втомою, болем, запамороченням і туманом у мозку. Багато пацієнтів із ME/CFS відчувають ортостатичну непереносимість (OI), яка характеризується частим запамороченням, легким запамороченням і відчуттям непритомності при збереженні вертикальної пози. Незважаючи на інтенсивне дослідження, молекулярний механізм цього виснажливого стану досі невідомий. ОІ часто проявляється серцево-судинними змінами, такими як зниження церебрального кровотоку, зниження артеріального тиску та зниження частоти серцевих скорочень. Біодоступність тетрагідробіоптерину (BH4), важливого кофактора ферменту ендотеліальної синтази оксиду азоту (eNOS), тісно пов’язана зі здоров’ям серцево-судинної системи та кровообігом. Щоб дослідити роль BH4 у ME/CFS, зразки сироватки пацієнтів із CFS (n=32), пацієнтів із CFS лише з OI (n=10; CFS + OI) та пацієнтів із CFS як з OI, так і дрібноволокнистої полінейропатії (n=12; CFS + OI + SFN) піддавали BH4 ELISA. Цікаво, що наші результати показали, що експресія BH4 є значно високою у пацієнтів зі СХВ, СХВ + ОІ та СХВ + ОІ + SFN порівняно з контрольною групою відповідного віку/статі. Нарешті, аналіз виробництва АФК у культивованих мікрогліальних клітинах із подальшою кореляційною статистикою Пірсона вказав, що підвищений рівень BH4 у зразках сироватки пацієнтів із СХВ + ОІ може бути пов’язаний із реакцією на окислювальний стрес. Ці результати свідчать про те, що регуляція метаболізму BH4 може бути багатообіцяючою мішенню для розуміння молекулярного механізму CFS і CFS з OI.

Цистанхе може діяти як засіб від втоми та підсилення витривалості, і експериментальні дослідження показали, що відвар цистанхе тубулозної може ефективно захищати гепатоцити печінки та ендотеліальні клітини, пошкоджені у плаваючих мишей, що тримають вагу, підвищувати експресію NOS3 та сприяти виробленню глікогену в печінці. синтезу, таким чином проявляючи ефективність проти втоми. Багатий на фенілетаноїд глікозид екстракт Cistanche tubulosa може значно знизити рівень креатинкінази, лактатдегідрогенази та лактату в сироватці крові, а також підвищити рівень гемоглобіну (HB) і глюкози у мишей ICR, і це може відігравати роль проти втоми, зменшуючи пошкодження м’язів. і затримка збагачення молочною кислотою для зберігання енергії у мишей. Таблетки Compound Cistanche Tubulosa значно подовжували час плавання з навантаженнями, збільшували запас глікогену в печінці та знижували рівень сечовини в сироватці після фізичних вправ у мишей, демонструючи свою дію проти втоми. Відвар цистанхісу може підвищити витривалість і прискорити усунення втоми у мишей, що займаються фізичними вправами, а також може зменшити підвищення рівня креатинкінази в сироватці після фізичних навантажень і підтримувати ультраструктуру скелетних м’язів мишей у нормі після фізичних вправ, що вказує на його вплив підвищення фізичної сили та зняття втоми. Цистанхіс також значно подовжив час виживання отруєних нітритами мишей і підвищив стійкість до гіпоксії та втоми.

Натисніть Перевтома

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Ключові слова:ME/CFS; тетрагідробіоптерін; ортостатична непереносимість; дрібноволокниста полінейропатія; ендотеліальний БДУ; активні форми кисню

1. Введення

Міалгічний енцефаломієліт/синдром хронічної втоми (МЕ/СХВ) — це хронічне мультисистемне захворювання, яке характеризується виснажливою м’язовою втомою, болем, запамороченням і туманом у мозку [1,2]. Підгрупа пацієнтів із МЕ/СХУ має важку ортостатичну гіпотензію [3], що характеризується значним падінням артеріального тиску, що викликає запаморочення та непритомність у вертикальному положенні [4]. Цей стан часто називають ортостатичною непереносимістю (НН). Підгрупа пацієнтів з ОІ також відповідає діагностичним критеріям поліневропатії дрібних волокон [5,6], яка діагностується за допомогою фарбування конго червоним на амілоїдоз у зразках біопсії шкіри [7]. Незважаючи на інтенсивні дослідження, молекулярний механізм ОІ невідомий.

BH4 є важливим кофактором метаболізму амінокислот [8]. Амінокислоти, такі як фенілаланін, тирозин і триптофан, перетворюються на важливі клітинні проміжні продукти під дією ферментів гідроксилази. BH4 є важливим кофактором усіх цих ферментів гідроксилаз [9–11]. Відповідно, біодоступність BH4 є критичною для синтезу нейромедіаторів, таких як дофамін і серотонін [10]. Окрім цих ферментів гідроксилаз, BH4 також регулює функцію ферментів синтази оксиду азоту та контролює виробництво оксиду азоту (NO) в ендотелії [12]. Вироблення NO ендотелієм посилює вазодилятативну реакцію, знижує артеріальний тиск і сприяє розслабленню м’язів [13,14]. З іншого боку, за наявності окисного стресу BH4 від’єднується від індукованого eNOS виробництва NO [15] і безпосередньо посилює реакцію мітохондріального стресу в серцевій тканині [16] і скелетних м’язах [17]. Таким чином, регуляція метаболізму BH4 є критичною для серцево-судинної функції та здоров’я кровообігу. Оскільки повідомляється, що пацієнти з ОІ мають серцево-судинні аномалії, ми зацікавлені у вивченні того, чи пацієнти з ОІ змінили метаболізм BH4. Дотепер не було жодного дослідження, яке б досліджувало роль метаболізму BH4 у CFS. Крім того, наше дослідження також досліджує, чи змінили біосинтез BH4 пацієнти з СХУ з ОІ.

Зразки сироватки 66 суб’єктів були включені в дослідження з n=32 CFS і n=34 контрольними. Подвійний сліпий кількісний ELISA був проведений для порівняння рівнів BH4 у здорових пацієнтів із контрольної групи та пацієнтів із CFS. Цікаво, що ми спостерігали сильну регуляцію BH4 у пацієнтів із СХУ порівняно зі здоровими особами контролю. Порівнюючи рівень BH4 між пацієнтами зі СХУ з ОІ (n=10) і відповідними за віком/статтю контрольною групою (n=10), ми також помітили, що пацієнти зі СХУ з ОІ мали значно вищий рівень BH4 в сироватці. Загалом, наш поточний рукопис підкреслює, що підвищення рівня BH4 у сироватці крові у пацієнтів із СХУ може відігравати вирішальну роль у патогенезі ОІ.

2. Результати

Суб'єкти, включені в дослідження. Для кількісного визначення рівня BH4 у зразках сироватки в дослідження було включено загалом 66 людей. Таблиця 1 підсумовує вік, стать, етнічну приналежність та попередні захворювання цих суб’єктів. Чотири суб'єкти з контрольної групи мали ускладнення, пов'язані з раком, і тому були виключені з остаточного аналізу. Мінімальний, медіанний і максимальний вік контрольної групи 18, 64,5 і 82 роки відповідно. Для групи CFS ці значення становлять 26, 59 і 76 років. Діаграма частотного розподілу віку в обох групах показала подібну асимметрию, а наступний тест аналізу Бланда–Альтмана показав, що середнє значення відмінностей було близьким до нуля, що свідчить про відсутність упередженості щодо віку. Контрольна група складалася з 44% чоловіків і 56% жінок, тоді як група CFS складалася з 41% чоловіків і 59% жінок. Усі пацієнти були кавказцями та проживали в географічному регіоні Північної Невади та Каліфорнії.

Популяція пацієнтів з ME/CFS була зареєстрована на основі канадських критеріїв 2003 року та Fakuda для ME/CFS. Вони також відповідали діагностичним критеріям SCID (нова назва ME/CFS, встановлена ​​Інститутом медицини). Контрольні групи були зіставлені за віком/статтю з суб’єктами CFS, які також були запрошені разом із пацієнтами в клініку внутрішньої медицини доктора Петерсона.

Підгрупи CFS + OI та CFS + OI_SFN були встановлені за допомогою записів діагностичного тестування (перегляд медичної карти завершено) і клінічної кореляції. Наприклад, люди з ОІ звернулися до офісу з модифікованим позитивним результатом тесту NASA на знежирення (що показує ОІ), і всі отримали внутрішньовенну терапію збільшення об’єму (фізіологічний розчин). Пацієнтам SFN були взяті зразки біопсії. Для включених суб’єктів CFS + OI + SFN був записаний звіт Mass General Hospital, у якому було виконано фарбування конго червоним для підрахунку щільності нейритів у бічній м’язовій тканині щиколотки.

Рівень BH4 високий у зразках сироватки пацієнтів з ME/CFS: загалом 32 суб’єкта CFS та 34 контрольних суб’єкти були включені в дослідження (таблиця 1) для вимірювання рівня BH4 у сироватці за допомогою конкурентного ELISA. Стандартна крива BH4 ELISA була експоненціальною кривою з негативним нахилом, яка була отримана з шести зростаючих концентрацій стандартів BH4 (5, 10, 25, 50, 10{{52 }} і 150 нг/мл). Нахил і переріз стандартної кривої використовували для вимірювання абсолютних рівнів BH4 від значення OD. Серійне розведення зразків сироватки з подальшим аналізом ELISA BH4 показало, що розведення сироватки 1:2 дало найбільш контрастні результати порівняно з порожнім або фоновим. Тому всі зразки сироватки піддавали розведенню 1:2. Цікаво, що подвійний сліпий аналіз ELISA з наступним непараметричним U-тестом Манна–Уітні [* p < 0,05 (=0,033); U=304.5] показали, що рівні BH4 були значно вищими у n=32 пацієнтів із CFS порівняно з n=28 контрольними суб’єктами (рис. 1A). Чотири суб’єкти (n=4) у контрольній групі були виключені через наявні у них ракові захворювання. Оскільки суб’єкти були включені випадковим чином незалежно від їхнього віку та статі, далі ми хотіли проаналізувати кореляцію рівня BH4 із віком та статтю суб’єктів. Відповідно, непараметричний кореляційний аналіз Спірмена (Рисунок 1B) показав, що не було кореляції між рівнем BH4 і віком суб’єктів» (Спірмен r=−0,1657; p=0.1835). Далі ми порівняли рівень BH4 між чоловіками та жінками (Малюнок 1C). Щоб оцінити значущість між чоловіком і жінкою (ефектор №1 — стать), а також між контрольною групою та CFS (ефектор №2 — стан здоров’я), було проведено двосторонній аналіз ANOVA. Відповідно, суб’єкти чоловічої та жіночої статі не виявили суттєвої різниці в рівнях BH4 (p > 0,05; =0.3496). Проте була значна різниця в BH4 між контрольною групою та суб’єктами CFS (p <0,05; =0.0375) незалежно від статевої різниці.

Оскільки поточна когорта суворо обмежена однією географічною територією, етнічною приналежністю та практикою одного лікаря, попарний порівняльний аналіз BH4 між випадками та контрольною групою, що відповідає віку та статі, буде більш переконливим. Всього було порівняно 15 пар (рис. 1D). Непараметричний ранговий тест Вілкоксона з підібраними парами показав, що пацієнти зі СХУ мали значно вищий BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >альфа ({{0}}.05)]. Оскільки всі CFS і контрольні зразки були зіставлені за віком і статтю, було проведено попарний порівняльний аналіз. Подальший парний t-тест (t1, 9=3.834; ** p < 0.01=0.004) показав, що зразки сироватки CFS + OI мали значно вищий BH4 порівняно з контрольними зразками сироватки (рис. 2C). ). Тест кумулятивної статистики колонки (рис. 2D) також показав, що 7 із 10 пацієнтів із СХВ + ОІ мали значно вищі рівні BH4, ніж медіана (=99,63 нг/мл). З іншого боку, лише 2 з 10 суб’єктів контрольної групи мали BH4 вище середнього значення. У сукупності ці дані свідчать про те, що пацієнти зі СХВ + ОІ мали значно більший BH4 порівняно з контрольними суб’єктами.

Підгрупа пацієнтів із СХВ (n=12) має як OI, так і SFN. Порівняння рівнів BH4 (рис. 3A) між здоровими суб’єктами контрольної групи та суб’єктами CFS + OI + SFN показало, що пацієнти з CFS + OI + SFN мали значно вищий рівень BH4 [t1,22=2.371; * стор<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Порівнюючи рівні BH4 у пацієнтів із СХВ і ОІ, ми спостерігали, що зразки сироватки крові пацієнтів із СХВ та ОІ (n=14) мали вищі рівні BH4 (Рис. 4A) порівняно з контрольними суб’єктами (n {{ 6}}). Аналіз графіка QQ показує, що розподіл даних є нормальним в обох групах (Малюнок 4B), що свідчить про те, що параметричний тест можна застосувати для порівняння середніх. Відповідно, непарний t-критерій для аналізу значущості середнього між групами виявив сильну різницю [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Статистичні дані у стовпчику вибраної когорти (n=22) показали, що 9 із 14 пацієнтів із СХВ + ОІ мали вищі рівні BH4 у сироватці порівняно з медіаною 119,7 нг/мл (рис. 4C). Взяті разом, наші результати свідчать про те, що пацієнти із СХУ та ОІ мають підвищені рівні BH4 у сироватці. У сукупності наш поточний рукопис визначає BH4 як потенційний біомаркер, що передається через кров, для пацієнтів із CFS + OI та CFS + OI + SFN.

Підвищені рівні BH4 можуть бути пов’язані з підвищеним окислювальним стресом: щоб зрозуміти функціональну важливість підвищеного рівня BH4 у сироватці, ми дослідили здатність зразків сироватки пацієнтів із СХУ з ОІ індукувати АФК (n=10). Мікрогліальні клітини, введені DCFDA, обробляли зразками сироватки, розведеними у співвідношенні 1:2, з 10 CFS + OI та 10 контрольних груп, відповідних за віком/статтю, протягом 90 хвилин з подальшим вимірюванням виробництва АФК за допомогою флуоресцентного рідера планшетів (Наприклад: Em { {12}} нм/535 нм), як описано в розділі «Матеріали та методи». Як ми повідомляли раніше [18], аналіз гістограми показав, що здатність зразків сироватки CFS + OI до утворення АФК була значно вищою, ніж у контрольних зразках сироватки (рис. 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0,0205)]. Оскільки всі точки даних в обох групах були нормально розподілені (рис. 5B), ми провели параметричний тест, щоб вивчити значущість середнього між групами. Цікаво, що кореляційний статистичний аналіз Пірсона в цій когорті показав, що існує помірно позитивна кореляція між рівнями BH4 і виробництвом АФК, що свідчить про те, що підвищені рівні BH4 у зразках сироватки CFS + OI можуть бути пов’язані з посиленням окислювальної реакції (рис. 5C).

Взяті разом, наш поточний рукопис підкреслює, що пацієнти зі СХУ пов’язані з підвищеним рівнем BH4 у сироватці крові та що підвищення регуляції спостерігалося більш значно у пацієнтів із СХУ та ОІ. Крім того, підвищений рівень BH4 може бути пов’язаний з реакцією на окислювальний стрес, що підкреслює потенційну роль метаболізму BH4 у патогенезі СХУ та СХУ з ОІ (рис. 5D).

3. Обговорення

Біосинтез тетрагідробіоптерину (BH4) є жорстко регульованим метаболічним процесом у здоров’ї, а його аномальна експресія пов’язана з рядом захворювань. Його дефіцит призводить до метаболічного дефіциту метаболізму амінокислот [19,20], порушення регуляції дофаміну [21] і порушення кровотоку [22,23] і пов'язаний з гіпертонією, діабетом, атеросклерозом, старінням і інші метаболічні порушення. З іншого боку, посилений біосинтез BH4 погіршує виробництво мітохондріальної енергії [24], індукує окислювальний стрес [25] і посилює порушення аутофагії [26]. Підвищення BH4 також пов’язане зі зниженням артеріального тиску [27] шляхом індукції вазодилятативної відповіді через активацію ендотеліального NOS [28]. Таким чином, посилений біосинтез BH4 може безпосередньо сприяти зниженню артеріального тиску або гіпотонії. Дослідження показує, що дефіцит BH4 послаблює спричинену LPS гіпотензію у мишей [23]. До цього часу роль метаболізму BH4 не досліджувалася у пацієнтів із СХВ, зокрема пацієнтів із СХВ із ОІ. Тому нашою метою було оцінити експресію BH4 у сироватці крові в цій популяції пацієнтів. Дивно, але наш аналіз ELISA показав, що зразки сироватки пацієнтів із СХУ мали значно вищі рівні BH4 порівняно зі здоровими контрольними суб’єктами відповідного віку та статі. Відповідно, кореляційна статистика Спірмена показала, що не було суттєвої кореляції підвищення регуляції BH4 щодо віку та статі, зводячи нанівець можливості або пов’язаного з віком або статтю порушення біосинтезу BH4 у цих пацієнтів.

Далі ми помітили, що зразки сироватки пацієнтів із СХВ + ОІ також показали значне підвищення BH4 порівняно зі зразками сироватки контрольної групи відповідного віку та статі. Наші сукупні статистичні дані показали, що 7 із 10 пацієнтів із СХВ + ОІ мали надзвичайно високі рівні BH4, що свідчить про те, що підвищення рівня BH4 у сироватці може бути пов’язане з патогенезом ОІ. Результат був додатково підтверджений, коли підгрупа пацієнтів із CFS + OI з полінейропатією дрібних волокон (SFN) також продемонструвала високу експресію BH4 у зразках сироватки порівняно з контрольною групою відповідного віку та статі. Цікаво, що порівняння рівнів BH4 у сироватці крові лише у пацієнтів із СХУ та пацієнтів із СХУ з ОІ показало, що рівень BH4 у пацієнтів з ОІ був значно підвищений.

Як підвищений BH4 сприяє патогенезу ME/CFS? Існує кілька шляхів, за допомогою яких підвищення BH4 може безпосередньо сприяти патогенезу ME/CFS (рис. 5D). По-перше, повідомляється, що підвищення регуляції BH4 викликає мітохондріальне порушення енергетичного метаболізму через інгібування комплексу I і IV ланцюга транспортування електронів, що призводить до зниження потенціалу мітохондріальної мембрани, вивільнення цитохрому С і апоптозу [24]. Також повідомляється, що вплив BH4 викликає окислювальний стрес [29]. Хоча фізіологічно BH4 підтримує вироблення ендотеліального NO шляхом активації eNOS, окислення BH4 супероксидом відокремлює його від eNOS, що викликає окислювальний стрес у серцевій тканині та впливає на здоров’я серцево-судинної системи (рис. 5C). На підтвердження, наші результати продемонстрували, що підвищені рівні BH4 у зразках сироватки CFS + OI мали позитивну кореляцію зі здатністю індукувати АФК. Крім того, BH4 також активує мішені кінази рапаміцинового комплексу1 (mTORC1) у ссавців, щоб порушити аутофагію. Раніше ми повідомляли, що активація mTORC1 і подальше порушення аутофагії можуть бути пов'язані з патогенезом ME / CFS. Повідомлялося, що як mTORC1-залежне порушення аутофагії [18], так і мітохондріальний дефіцит енергетичного метаболізму [30] сприяють патогенезу ME/CFS. Таким чином, підвищення рівня BH4 у зразках сироватки пацієнтів з ME/CFS може спричинити окислювальний стрес і посилити роз’єднання eNOS, а потім серцево-судинний стрес, гіпотензію, мітохондріальну токсичність і порушення аутофагії у пацієнтів із CFS.

4. Матеріали та методи

Збір зразків: Збір зразків, деідентифікація та план зберігання обговорювалися раніше [18]. Коротко, зразки крові та анкетні дані були зібрані під наглядом доктора Деніела Петерсона (Sierra Internal Medicine, Інклайн-Віллідж, Невада, США) (Western IRB) №20201812. Зразки крові центрифугували, а зразки сироватки брали на аліквоти, а потім негайно заморожували при -80 ◦C. Кожному зразку було присвоєно унікальний ідентифікаційний номер і записано як у блокноті, так і в Microsoft Excel із датою та підписом відповідно до протоколу, затвердженого IRB. Потім зразки були доставлені в наш дослідницький центр у Вісконсіні на сухому льоду протягом ночі. Після отримання зразки були негайно оброблені та досліджені. Анкети та деідентифіковані клінічні дані зберігаються в безпечній серверній базі даних Redcap з обмеженим доступом, якою керує дослідницький персонал і клінічний співробітник Sierra Internal Medicine. Записи пацієнтів зберігалися згідно з правилами політики конфіденційності, встановленими Sierra Internal Medicine. Підгрупи пацієнтів з ME/CFS у групах OI та OI + SFN були встановлені за допомогою сліпого перегляду карт, а післялабораторний аналіз був підтверджений клінічним PI. Четверо хворих на рак були сліпо включені в цей аналіз і служили в якості позитивного контролю за захворюванням.

Діагностичні критерії ОІ включали відповідні знахідки (результати таблиці нахилу серця) з огляду клінічної карти. Крім того, під час забору крові стипендіат завершив аналіз NASA. Діагноз SFN був встановлений за допомогою огляду клінічної карти та гістологічного дослідження біопсії шкіри, взятої з претібіальної області. Біопсії шкіри були незалежно оцінені в Массачусетській лікарні загального профілю для морфометричного визначення епідермальних нервових закінчень для вивчення щільності нейритів на поверхні шкіри.

Конкурентний ELISA BH4: рівень BH4 вимірювали та кількісно визначали у зразках сироватки пацієнтів із ME-CFS та здорових контрольних осіб відповідного віку відповідно до інструкцій виробника (набір для конкурентного ELISA людини BH4; постачальник: MyBioSource, Inc, Сан-Дієго, Каліфорнія 92195, США; Cat # MBS733839). Набір був валідований у нашій лабораторії (Perkin Elmer Victor X3 multimodal plate-reader, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) і мав стандартну криву (R2=0.98) і чутливість до 1 нг/мл концентрація щодо позитивного контролю. Коротко кажучи, зразки сироватки розбавляли розчинником для аналізу (або 1× PBS), а потім піпетували на мікропланшет, попередньо покритий поліклональним антитілом проти BH4. Після 30 хвилин інкубації із зразком до планшета додавали кон’югат BH4-HRP та інкубували ще 1 годину при 37 ◦C. Залишкові зразки сироватки декантували та промивали на планшеті 1× промивним буфером (альтернативно, 1× PBS-T) тричі по п’ять хвилин за допомогою багатоканальної піпетки. Після промивання кожна лунка реагувала з субстратом ТМВ протягом 10 хв у темряві. Розвиток кольору відбувається після 10 хвилин інкубації субстрату в умовах струшування. Кон’югат BH4-HRP конкуруватиме з сироватковим BH4 за зв’язування з первинним антитілом із покриттям. Отже, чим більше сироватки BH4 у зразку, тим менше буде зв’язування BH4-HRP і, таким чином, генеруватиме менше кольору. Загалом було зібрано 66 зразків сироватки (34 контрольних + 32 пацієнтів із ME-CFS) (подробиці в розділі «Отримання зразків») згідно з відповідними інституційними нормативними вказівками та проаналізовано в умовах GLP. Розподіл вибірки був випадковим, а аналіз був подвійним сліпим, як описано в розділі «Обґрунтування розміру вибірки».

Обґрунтування розміру вибірки та статистичний аналіз: Розмір вибірки було обґрунтовано за допомогою наступного рівняння. Розмір вибірки {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z – це z-оцінка, яка становить 1,28 для потужності 0.8. p – частка населення; для 95% довірчого інтервалу p буде {{20}}.95. ε – похибка, яка становить 0,05. Тому, щоб досягти значущості різниці середніх між групами при р < 0,05, було включено загальну кількість n=32 зразків на групу. Для порівняння між контрольною групою та пацієнтами зі СХВ + ОІ було включено n=10 зразків на групу. Подібний розмір вибірки був включений під час порівняння контрольної та контрольної +OI + SFN груп. Обчислення розміру вибірки було виконано на основі ε=0.05 і p=0.99. Для перевірки значущості середнього значення між двома групами було прийнято непараметричний U-критерій Манна-Уїтні, коли дві групи відображали ідентичні та нормальні розподіли даних; в іншому випадку було виконано параметричний непарний t-тест. Для парного аналізу між групами було виконано параметричний парний t-тест, якщо точки даних з обох груп були нормально розподілені; в іншому випадку для оцінки значущості між групами проводили ранговий тест Вілкоксона. Двосторонній дисперсійний аналіз із застосуванням post hoc Бонферроні або Тьюкі був застосований для перевірки значущості середнього в більш ніж двох групах, враховуючи стать (чоловічий чи жіночий) і стан здоров’я (здоровий або CFS) як ефектори. Усі статистичні аналізи проводили в програмному забезпеченні GraphPad Prism версії 9.5.1 (733) (Бостон, Массачусетс 02110, США).

АФК аналіз:Людські ембріональні мікрогліальні клітини HMC3 вирощували та пасували з повним середовищем DMEM. Коротко, клітини HMC3 поміщали в 96-лунковий планшет для флуорометричного дослідження ROS. Клітини вирощували до 75–80% конфлюентності та інкубували із зондом DCFDA (Cat# ab113851; Abcam, Кембридж, Великобританія) протягом 45 хвилин при 37 ◦C у темряві. Стандартне середовище замінювали 100 мкл (розведення 1:2=50 мкл сироватки + 50 мкл середовища) середовища, доповненого сироваткою, протягом 90 хвилин для досягнення оптимального значення флуоресценції. Наприкінці інкубаційного періоду середовище було аспіровано, а потім виміряно збудження-випромінювання з використанням наборів фільтрів 485 нм і 535 нм у пристрої для зчитування планшетів PerkinElmer Victor X3 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Авторські внески:AR задумав ідею, спроектував, провів дослідження та написав рукопис. CGG провела дослідження та написала рукопис. RW допомагав із забором зразків крові та веденням карток пацієнтів. DP є клінічним PI, який відповідав за збір біозразків, анкети та затвердження IRB. Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування:Цю роботу підтримала Simmaron Research Inc., некомерційна дослідницька організація 501C, Incline Village, NV 89451, завдяки коштам від Ramsay Award 2023 до AR ініціативи Solve ME та Foundation Hesse Sibylla, Квебек, Квебек, Канада.

Заява інституційної наглядової ради:Жодна частина цієї дослідницької статті, включаючи зображення та тексти, не була опублікована або відтворена раніше в жодній книзі, статті чи іншій опублікованій літературі. Зображення оригінальні і не скопійовані з інших джерел. Це не клінічне випробування, а інституційне обсерваційне дослідження. Збір біозразків, вказівки щодо опитування, ведення записів та генерація унікальних ідентифікаційних номерів було виконано Western IRB, протокол № 20201812 (поточна дата оновлення № 21.07.23).

Заява про інформовану згоду:Усі автори дали свою згоду на публікацію цієї оглядової статті.

Заява про доступність даних:Немає електронної таблиці даних, пов’язаної з цим документом. Немає даних в електронному сховищі.

Конфлікт інтересів:AR, CGG, RW і DP є співробітниками Simmaron Research INC, некомерційної дослідницької організації 501C. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Скорочення

ME/CFS=Міалгічний енцефаломієліт або синдром хронічної втоми; OI=Ортостатична непереносимість; SFN=дрібноволокниста полінейропатія; BH4=тетрагідробіоптерин; eNOS=ендотеліальна синтаза оксиду азоту; NO=Оксид азоту. ROS=Активні форми кисню. ME/CFS=Міалгічний енцефаломієліт або синдром хронічної втоми; OI=Ортостатична непереносимість; SFN=дрібноволокниста полінейропатія; BH4=тетрагідробіоптерин; eNOS=ендотеліальна синтаза оксиду азоту; NO=Оксид азоту; і ROS=Активні форми кисню.

Список літератури

1. Лім, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Лі, SW; Лі, Ш.; Сон, К. Г. Систематичний огляд і мета-аналіз поширеності синдрому хронічної втоми/міалгічного енцефаломієліту (CFS/ME). J. Перекл. Мед. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Син, К.-Г. Огляд поширеності хронічної втоми в усьому світі. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Нательсон, Б.Х.; Lin, J.-MS; Блейт, М.; Хан, С.; Чен, Ю.; Унгер, Е.Р. Фізіологічна оцінка ортостатичної непереносимості при синдромі хронічної втоми. J. Перекл. Мед. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Бейтмен Л.; Бестед, AC; Бонілла, HF; Чхеда, Б.В.; Чу, Л.; Куртін, Дж.М.; Демпсі, TT; Діммок, М.Е.; Доуелл, ТГ; Felsenstein, D. Міалгічний енцефаломієліт/синдром хронічної втоми: Основи діагностики та лікування. У матеріалах клініки Майо; Elsevier: Амстердам, Нідерланди, 2021; С. 2861–2878.

5. Басанцова, Н.Ю.; Старшинова, А.А.; Дорі, А.; Зінченко Ю.С.; Яблонський П.К.; Shoenfeld, Y. Визначення нейропатії дрібних волокон, діагностика та лікування. Нейрол. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Шенфельд, Ю.; Рябкова В.А.; Шайбенбоген, С.; Гілка, Л.; Мартінес-Лавін, М.; Ікеда, С.; Гайдеке, Х.; Ватад, А.; Брагацці, NL; Чепмен, Дж. Комплексні синдроми хронічного болю, втоми та когнітивних порушень, пов'язаних з аутоімунною дисавтономією та нейропатією дрібних волокон. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Леонарді, Л.; Адам, К.; Beaudonnet, G.; Бове, Д.; Cauquil, C.; Ні, А.; Морассі, О.; Бенмалек, А.; Трассард, О.; ЕханізЛагуна, А.; та ін. Відкладення амілоїду в шкірі та втрата нервових волокон як маркери початку та прогресування нейропатії при спадковому транстиретиновому амілоїдозі. Євро. Дж. Нейрол. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Номура, Т.; Sumi-Ichinose, C. Метаболізм тетрагідробіоптерину: його актуальність у моноамінергічних нейронах та неврологічних розладах. Chem. Рек. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Ся, Т.; Грей, Д.В.; Shiman, R. Регулювання фенілаланін гідроксилази печінки щурів. III. Контроль каталізу за допомогою (6R)-тетрагідробіоптерину та фенілаланіну. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Нагацу, Т.; Нагацу, І. Тирозингідроксилаза (TH), її кофактор тетрагідробіоптерин (BH4), інші ферменти, пов'язані з катехоламінами, та їхні людські гени про ліки та генну терапію хвороби Паркінсона (PD): історичний огляд та перспективи. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Савада, М.; Сугімото, Т.; Мацуура, С.; Nagatsu, T. (6R)-Тетрагідробіоптерин підвищує активність триптофангідроксилази в зрізах щурів. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Чень, Д.-Д.; Чен, Л.-Й.; Се, Ж.-Б.; Шу, К.; Ян, Т.; Чжоу, С.; Юань, Х.; Chen, AF Регуляція тетрагідробіоптерином окисно-відновної функції eNOS. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Хігаші, Ю.; Сасакі, С.; Накагава, К.; Кімура, М.; Нома, К.; Хара, К.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Осіма, Т.; Chayama, K. Tetrahydrobiopterin покращує пов'язане зі старінням порушення ендотелій-залежної вазодилатації за рахунок збільшення виробництва оксиду азоту. Атеросклероз 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Ікло, XH; Стефенсон, Л.Л.; Хіабані, КТ; Zamboni, WA Ефекти добавки BH4 після тривалої ішемії в скелетних м'язах. Мікрохірургія 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Ян Ю.-М.; Хуан, А.; Кейлі, Г.; Сан, Д. Роз’єднання eNOS і ендотеліальна дисфункція у старих судинах. Am. J. Physiol.-Heart Circ. фізіол. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Карбач С.; Венцель, П.; Вайсман, А.; Мунцель, Т.; Daiber, A. Роз'єднання eNOS при серцево-судинних захворюваннях - роль окислювального стресу та запалення. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Сіндлер, А.Л.; Дельп, доктор медичних наук; Рейес, Р.; Ву, Г.; Мюллер-Делп, Дж. М. Вплив старіння та фізичних вправ на роз’єднання eNOS в артеріолах опору скелетних м’язів. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Готтшальк, Г.; Петерсон, Д.; Нокс, К.; Мейнард, М.; Вілан, RJ; Рой, А. Підвищений рівень ATG13 у сироватці крові пацієнтів з ME/CFS стимулює відповідь на окислювальний стрес у клітинах мікроглії через активацію рецептора кінцевих продуктів прогресуючого глікування (RAGE). мол. Стільниковий. Неврологія. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Блау, Н.; Тоні, Б.; Спада, М.; Ponzone, A. Tetrahydrobiopterin і спадкові гіперфенілаланінемії. Турок. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Бірнбахер, Р.; Шайбенрайтер, С.; Блау, Н.; Bieglmayer, C.; Фріш, Х.; Вальдхаузер, Ф. Гіперпролактинемія, засіб контролю лікування дефіциту тетрагідробіоптерину: ендокринні дослідження у хворої дівчини. педіатр. рез. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Хайленд, К.; Касім, С.; Егамі, К.; Арнольд, Л.; Jinnah, H. Дефіцит тетрагідробіоптерину та втрата дофаміну в генетичній мишачій моделі хвороби Леша-Найхана. Ж. Наслідувати. Метаб. дис. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Лі, Л.; Чен, В.; Резван, А.; Джо, Х.; Harrison, DG. Дефіцит тетрагідробіоптерину та роз’єднання синтази оксиду азоту сприяють атеросклерозу, спричиненому порушенням кровотоку. Артеріосклер. Тромб. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Старр, А.; Нанді, М.; Ченнон, К.М.; McNeill, E. Дефіцит тетрагідробіоптерину ендотеліальних клітин послаблює індуковану ЛПС судинну дисфункцію та гіпотензію. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Чой, HJ; Лі, С.Й.; Чо, Ю.; Ні, Х.; Кім, SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopterin викликає мітохондріальну дисфункцію в дофамінергічних клітинах: наслідки для хвороби Паркінсона. Нейрохім. Міжн. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Лі, С.Й.; Місяць, Ю.; Хі Чой, Д.; Джин Чой, Х.; Hwang, O. Особлива вразливість мезенцефальних дофамінергічних нейронів щурів до тетрагідробіоптерину: значення для хвороби Паркінсона. нейробіол. дис. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Квак, С.С.; Сук, Дж.; Чой, JH; Ян, С.; Кім, JW; Сон, С.; Chung, JH; Хонг, YH; Лі, DH; Ан, Дж. К.; та ін. Індукція аутофагії дефіцитом тетрагідробіоптерину. Автофагія 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Покерт, М.; Шер, С.; Редді, У.; Чіма, Ф.; Niessner, C.; Кольм, П.; Джонс, ДП; Хупер, К.; Тейлор, WR; Харрісон, Д.; та ін. Тетрагідробіоптерін: нова антигіпертензивна терапія. Дж. Хум. гіпертензії. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Ченнон, К. Тетрагідробіоптерин: регулятор ендотеліальної синтази оксиду азоту при судинних захворюваннях. Trends Cardiovasc. Мед. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Фенг Ю.; Фенг, Ю.; Гу, Л.; Лю, П.; Цао, Дж.; Чжан, С. Критична роль метаболізму тетрагідробіоптерину (BH4) у модулюванні радіочутливості: вісь BH4/NOS як ангел чи диявол. Фронт. Онкол. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Мандарано, AH; Майя, Дж.; Giloteaux, L.; Петерсон, DL; Мейнард, М.; Gottschalk, CG; Хансон, М. Р. Пацієнти з міалгічним енцефаломієлітом/синдромом хронічної втоми демонструють змінений метаболізм Т-клітин і асоціації цитокінів. Дж. Клін. Розслідувати. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Відмова від відповідальності/Примітка видавця:Твердження, думки та дані, що містяться в усіх публікаціях, належать виключно окремим авторам (авторам) і авторам (учасникам), а не MDPI та/або редакторам (редакторам). MDPI та/або редактор(и) відмовляються від відповідальності за будь-яку шкоду людям або майну, спричинену будь-якими ідеями, методами, інструкціями чи продуктами, згаданими у вмісті.

【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】