Виділення нових фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів із Cistanche Salsa під контролем дереплікації та їх інгібуюча активність щодо виробництва NO в макрофагах

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля більш

Анотація:

Дереплікація дозволяє швидко ідентифікувати відомі та невідомі сполуки в рослинних екстрактах. У цьому дослідженні ми провели дереплікацію на основі рідинної хроматографії та мас-спектроскопії (LC-MS), використовуючи дані ESI плюс QTOF-MS для аналізуфенілпропаноїд-заміщені глікозиди, основні активні компоненти Cistanche salsa (CA Mey.) Beck. Використовуючи тільки TOF-MS, підструктури цих сполук можуть бути однозначно підтверджені на основі характерних моделей фрагментації різних виробництв. Профілювання C. salsa на основі ВЕРХ-МС також дозволило виявити новіфенілпропаноїд- заміненийглікозиди зця рослина. З них п'ять нових фенілпропаноїд-заміщенихдиглікозиди, названі цистанзальсидами A–E (5, 6, 12, 17 і 18), були виділені. Їхні структури були з'ясовані за допомогою спектроскопічних методів, включаючи аналіз ЯМР та МС. Усі ізоляти перевіряли на інгібіторну активність щодо продукції NO в клітинах RAW 264.7, стимульованих LPS. З досліджуваних сполук сполуки 5, 11, 13 і 18 показали помірну інгібіторну активність щодо індукованої NO-синтази. Сполуки 11, 13 і 18 також інгібували фосфорилювання NF-κB в макрофагах. Жодна зі сполук не виявилася суттєвоюцитотоксичність. 

Ключові слова:дереплікація; фенілпропаноїд-заміщені диглікозиди; цистанче сальса; протизапальні ліки

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

вступ

Cistanche salsa (CA Mey.) Beck, що належить до родини Orobanchaceae, є паразитичною рослиною, яка отримує своє харчування з кореня Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) та інших пустельних рослин [1]. Ця рослина використовується в традиційній медицині для лікування неврастенії, сексуальної дисфункції та ниркової недостатності [2,3]. У попередніх фітохімічних дослідженнях повідомлялося, що вся рослина C. salsa містить різні типи сполук, включаючи фенілетаноїдні глікозиди та іридоїдні глікозиди [4–7]. Основними діючими компонентами рослини є фенілетаноїдні глікозиди, такі як актеозид і ехінакозид [8]. Екстракти C. salsa показали корисні властивості, включаючи імуномодулюючу, протипухлинну та протизапальну дії [9,10]. Дереплікація — це процес, за допомогою якого тестуються суміші зразків, щоб відрізнити невідомі складові від відомих сполук. Стратегії дереплікації базуються на аналітичних методах і пошуку в базі даних для ідентифікації вторинних метаболітів на ранніх етапах процесу фітохімічних досліджень [11]. Серед аналітичних методів цінну інформацію про хімічну структуру вторинних метаболітів може надати ESI-QTOF-MS (іонізаційна електророзпилювальна квадрупольна мас-спектроскопія з часом польоту). Було продемонстровано, що фракціонування, кероване дереплікацією на основі РХ-МС, дозволяє видобувати та очищати цільові метаболіти з сирих екстрактів рослин з високою ефективністю [12–15]. У цьому дослідженні була проведена дереплікація на основі РХ-МС з використанням даних ESI плюс TOF-MS для аналізу фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів, основних активних компонентів C. salsa. Дані TOF-MS можуть запропонувати підструктури цих сполук на основі характерних моделей фрагментації різних іонів-продуктів. На основі цієї дереплікації було проаналізовано профілі РХ-МС фракції етилацетату (EtOAc) і водорозчинної фракції. Фракцію EtOAc піддали стратегії дереплікації для подальшого розділення, що призвело до виділення п’яти нових фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів і 13 відомих сполук (рис. 1). Було підтверджено, що попередньо передбачені структури фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів були правильно зіставлені з їхніми реальними структурами. Крім того, досліджували протизапальну дію ізолятів.

Результати і обговорення

Фенілпропаноїд-заміщені диглікозиди, виділені з C. salsa, зазвичай мають структури на основі дисахаридних глікозидів, які складаються з глюкози та рамнози з Rha (1→3) Glc-зв’язком і одним цинамоїльним замісником, наприклад кумарова кислота (Cou), кавова кислота. кислоти (Caf) і ферулоїлової кислоти (Fer), у положенні C-4 або C-6 глюкози. Аглікон зазвичай приєднується до C-1 положення глюкози. Часто повідомлялося про структури фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів з ацетильною групою в C-2 глюкози [6,12,16]. Для виконання дереплікації шаблони MS-фрагментації цих сполук аналізували за допомогою ESI-QTOF-MS у позитивному режимі. У спектрах МС усі фенілпропаноїд-заміщені диглікозиди дають піки іонів адукції при [M плюс NH4] плюс, [M плюс K] плюс і [M плюс Na] плюс, що забезпечило молекулярну масу та формулу. Структуру фрагментних іонів можна знайти за послідовними втратами залишків аглікону та глікозиду ([M плюс H − Aglycone] plus, [M plus H − Aglycone − Rha] plus та [M plus H − Aglycone – Рисунок 1. Структури сполук 1–18 2. Результати та обговорення Фенілпропаноїд-заміщені диглікозиди, виділені з C. salsa, зазвичай мають структури на основі дисахаридних глікозидів, які складаються з глюкози та рамнози з Rha (1→3) Glc-зв’язком та одним циннамоїльним замісником, такі як кумарова кислота (Cou), кавова кислота (Caf) і ферулоїлова кислота (Fer), у положенні C-4 або C-6 глюкози. Аглікон зазвичай приєднується до C{{24 }} положення глюкози Часто повідомлялося про структуру фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів з ацетильною групою в C-2 глюкози [6,12,16].Для виконання дереплікації, шаблони фрагментації MS цих сполук були проаналізовані позитивним режимом ESI-QTOF-MS. У спектрах MS всі фенілпропаноїд-заміщені дигліко сторони створювали піки іонів адукції при [M плюс NH4] плюс, [M плюс K] плюс і [M плюс Na] плюс, що забезпечувало молекулярну масу та формулу. Структуру фрагментних іонів можна знайти за послідовними втратами залишків аглікону та глікозиду ([M плюс H − Aglycone] plus , [M plus H − Aglycone − Rha] plus і [M plus H − Aglycone – Rha − Glc (або Acetyl) -Glc)] плюс ), які були корисні для передбачення типу цинамоїльного замісника та цукрів. Фрагментні іони при m/z 163 кофеоїльної групи, m/z 147 кумароїльної групи або m/z 177 ферулоїльної групи дають характерний сигнал цинамоїльного замісника у фенілпропаноїд-заміщених диглікозидах [4,15] ( малюнок 2). Аналіз іонів фрагментів надасть корисну інформацію для ідентифікації структур фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів. Однак їх ізомери не можна диференціювати лише за допомогою МС-спектрометрії. Для точної ідентифікації їхньої повної структури потрібні спектри ЯМР.

Усі ізоляти перевіряли на їхню інгібуючу дію на ЛПС-індуковану продукцію NO в клітинах RAW 264.7. Дексаметазон використовувався як позитивний контроль, і його IC50 становила 7.0 мкМ. З протестованих сполук сполуки 5 (IC50 42.7 ± 6.6 мкМ), 11 (IC50 37.3 ± 2.2 мкМ), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} ± 4.0 мкМ) і 18 (IC50 27.9 ± 0,8 мкМ) показали помірну інгібіторну активність щодо індуцибельної NO-синтази, тоді як інші сполуки були неактивними в цьому аналізі (IC50 значення > 100 мкМ). Щоб перевірити, чи ці сполуки мали цитотоксичність, життєздатність клітин вимірювали за допомогою аналізу МТТ. У результаті жоден із них не виявив значної цитотоксичності (додатковий малюнок S6-1). Ці чотири сполуки були відібрані для оцінки їх інгібіторної активності проти шляху NF-κB у клітинах RAW 264.7, стимульованих LPS. Стимуляція клітин RAW 264.7 LPS викликала фосфорилювання IκB і NF-κB (p65) після 0,5 години інкубації. Фосфорилювання NF-κB (p65) було значно знижено при попередній обробці сполуками 11, 13 і 18, як показано за допомогою вестерн-блот аналізу (Фігура 5). Таким чином, сполуки 11, 13 і 18 можуть виявляти протизапальну дію через інгібування NF-κB у макрофагах.

Матеріали та методи

Оптичні обертання вимірювали цифровим поляриметром Jasco P-2000 (Jasco, Токіо, Японія). УФ-спектри записували на спектрометрі Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, Великобританія). ІЧ-спектри записували за допомогою спектрофотометра Jasco FT/IR-4200. Квадрупольна часпролітна мас-спектрометрія високої роздільної здатності з іонізацією електророзпиленням (HR-ESI-qTOF-MS) була виконана на Q-TOF LC/MS Agilent 6530 Accurate-Mass, оснащеному серією Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Пало-Альто, Каліфорнія, США). Для збору даних використовувалося програмне забезпечення MassHunter Workstation.

1D (H і 13C) і 2D ('H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) ЯМР-спектри були отримані за допомогою Jeol LA 300 (Jeol, Токіо, Японія), Bruker AVANCE-400, Спектрометри Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 і Bruker AVANCE 800 HD у поєднанні з кріозондом (Bruker, Ettlingen, Німеччина). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA, USA) використовували як розчинник для ЯМР і контрольні піки (6H 2,50 і δc 39,5). Колонкову хроматографію （CC） проводили з використанням Sephadex LH-20(25-100 um; Pharmacia, Uppsala, Швеція) або Kieselgel 60 силікагель (40-63 um,230-400 mesh, Art. 9385; Merck, Дармштадт, Німеччина). Тонкошарову хроматографію (ТШХ) проводили на попередньо покритих пластинах із силікагелем Kieselgel 60 F254 (Art.5715; Merck). Плями на ТШХ виявляли за допомогою УФ-лампи при 254 нм і 365 нм (VL-4.LC, 365). /254; Вільбер Лурма, Торсі, Франція). Рідинну хроматографію середнього тиску (MPLC) проводили на флеш-колонці з кремнеземом RediSep 120g (lsco, Lincoln, NE, USA) і силікагелі Kiesegel 60 (40-63 um, 230-400 меш, Art.9385; Merck ) за допомогою компаньйона Combiflash (Isco). Системою рідинної хроматографії високого тиску (ВЕРХ) була ВЕРХ Gilson, оснащена насосом Gilson 321 і детектором UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, США), з використанням напівпрепаративних колонок ODS (Luna 5 um C18 （2） 100). Å, id 250×10 мм, 5 мкм, Phenomenex Inc, Торранс, Каліфорнія, США; Hypersil GOLDrM aQ 175A, id250 × 10 мм, 5 мкм, Thermo ScientificTM, Hennigsdorf, Німеччина; Inno C18column 120 A, id 250 × 10 мм, 5 мкм, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Аналітичний RP- Система ВЕРХ була альянсом Waters 2695 із детектором 996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Мілфорд, Массачусетс, США), а використовуваною колонкою була колонка HypersilTM BDS C18 (130 A, id150 × 4,6 мм, 5 мкм, Thermo НауковийTM). Мурашину кислоту було придбано у Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Сеул, Корея). Розчинники класу HPLC були придбані у Fisher Scientific Korea Ltd. (Сеул, Корея). HSOA, Na, CO та розчинники першого класу для екстракції, фракціонування та ізоляції були придбані у Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Сеул, Корея). Гідрохлорид метилового ефіру L- та D-цистеїну та о-толілізотіокванат були придбані в Tokyo Chemical Industry (Токіо, Японія).

Висновки

У цьому дослідженні ми виділили та з’ясували структури п’яти нових фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів, названих цистансалсидом AE (5,6, 12, 17 і 18), на додаток до виділення та ідентифікації 13 відомих сполук, використовуючи стратегію дереплікації. Відомі сполуки були визначені як ліпедозид AI(1)[21], 2'-ацетилактеозид (2)[22], ізоцистанозид C(3)[15], османтузид B (4)[21], епімеридинозид A(7) [15], цистанозид D(8)[23], сальсазид B(9) [6l, тубулозід E (10)[16]цистанозид M(11)[15], ізомартинозид(13) [24], сальсазид C(14) )[6], джіонозид C(15)[25] і сальсасид F (16)[6]. Їхні структури були встановлені шляхом аналізу великої кількості спектроскопічних даних і порівняння з даними, представленими в літературі. Було підтверджено, що попередньо передбачені структури фенілпропаноїд-заміщених диглікозидів були правильно зіставлені з їхніми реальними структурами.

У аналізі інгібування NO сполуки 5 （IC50 42.7±6,6 мкМ）, 11（IC50 37.3±2.2 мкМ）,13 （IC50 40.0 ±4.0 мкМ） і 18（ICs0 27.9±0.8uM показали помірну інгібіторну активність. Було виявлено, що з цих сполук сполуки 11, 13 і 18 інгібують фосфорилювання NF-kB у макрофагах і, таким чином, можуть проявляти протизапальну активність, що має бути доведено в подальших експериментах.

Витяг із: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ («Ліцензія»). Незважаючи на положення та умови ProQuest, ви можете використовувати цей вміст відповідно до умов Ліцензії.