Вторинні метаболіти ціанобактерій як біотехнологічні інгредієнти натуральної антивікової косметики 2

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

2.3.Біологічна активність

2.3.1. Активність поглинання радикалів

Супероксидний аніон-радикал є фізіологічним вільним радикалом, який надзвичайно важливий для організму людини. Якщо під час аеробного дихання відбувається надмірне вироблення цих АФК або коли ендогенні механізми детоксикації виходять з ладу або є недостатніми, існує підвищений ризик окисного пошкодження з серйозними шкідливими наслідками. У цьому сенсі пошук механізмів для пригнічення шкідливого впливу Oz* має ключове значення не лише в галузі косметики, але й у розгляді полегшення та профілактики широкого спектру захворювань. Поведінка екстрактів ціанобактерій щодо поглинання O2" відображена на малюнку 1, а значення ICC наведені в таблиці 6.

Водні екстракти були значно ефективнішими в поглинанні Oz*-, ніж ацетонові екстракти (таблиця 6) і показали дозозалежну активність (рисунок 1), причому прісноводні штами відрізнялися від морських. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 був найефективнішим штамом із найнижчим значенням ICso (65,5 мкг сухого екстракту/мл, п.<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Порівняння антиоксидантної здатності різних ціанобактерій є складним через різні застосовані методи. Morone та його співробітники оцінили здатність екстрактів етанолу (70 об’ємних відсотків) різних штамів ціанобактерій поглинати радикали [26], найнижче значення ICso становило 822,70 мкг/мл для Phormidium sp.LEGE 02 05292, тоді як ні активність була виявлена ​​для Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Лопес та його співробітники повідомили про активність поглинання O2 для Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarctica LEGE13457 і Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 ацетонових екстрактів зі значеннями IC25 319 і 286 мкг/мл, і відсутність активності для Leptolynbbya- як sp.LEGE 13412 [27]. Автори також повідомили про вищу ефективність ацетонових екстрактів порівняно з етаноловими. Інше дослідження, проведене Амаро та його співробітниками, виявило значення IC50 1394 і 826 мкг/мл для Gloeothece sp. і Scenedesmus obliquus (M2-1) відповідно [37]. Результати, отримані тут для ацетонових екстрактів, здаються менш перспективними, ніж ті, про які повідомлялося раніше, навіть незважаючи на те, що вони знаходяться в тому ж порядку величини. З іншого боку, водні екстракти виявили величезний потенціал, який варто використовувати в косметичних цілях у сфері старіння шкіри.

2.3.2. Інгібування ферментів

MMP — це сімейство позаклітинних цинкзалежних ферментів, основною функцією яких є реконструкція та деградація ECM[38], гелеподібного матеріалу, необхідного для утримання клітин разом і забезпечення шляху для поживних речовин і кисню [39]. Зміни в компонентах ECM, таких як колаген і еластин, індуковані MMP, є основою пошкодження шкіри та утворення зморшок [40]. Разом із цими ферментами, пов’язаними зі структурою шкіри та утворенням зморшок, інший бере на себе вирішальну роль у процесі старіння завдяки своїй активності в меланогенезі: тирозиназа. Серед інших факторів вплив ультрафіолетового випромінювання спричиняє накопичення аномальної кількості меланіну через збільшення виробництва АФК. Ці реактивні види впливають на активність меланоцитів, що збільшує перетворення тирозину в меланін шляхом окислення, що призводить до гіперпігментації та нерівних плям на шкірі [41].

Cistanche може омолоджувати старіння

У пошуках природних альтернатив комерційним інгредієнтам проти старіння, зосереджуючись на згаданих вище ферментах, була досліджена активність екстрактів ціанобактерій (рис. 2). Щодо HAase, лише три штами були здатні інгібувати цей фермент, діючи залежно від дози: водний екстракт Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 мкг/мл), а також ацетонові екстракти Cephalothrix lacustris LEGE 15493 і Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, причому два останні досягають лише IC25 (832 і 995 мкг/мл відповідно). Незважаючи на те, що ці значення здаються високими, їх діапазон активності був подібний до діапазону активності референсного препарату кромоглікат натрію（DSCG）（IC50=105 мкг/мл）. Крім того, варто зазначити, що для найвищої тестованої концентрації (1 мг/мл), Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 інгібував цей фермент на 80 відсотків (рис. 2), що робить цей екстракт перспективним косметичним інгредієнтом.

Кілька досліджень повідомляли про потенційний вплив сполук і екстрактів ціанобактерій на активність гіалуронідази, і будь-яке порівняння біологічного потенціалу екстрактів повинно брати до уваги, що метаболізм ціанобактерій зазнає значних коливань залежно від умов культивування, що впливає на хімічний склад екстрактів. Morone та співавт. [26] оцінили дію етанольних екстрактів Tychonema sp. LEGE 07196 і Cyanobium sp. LEGE 07175 на гіалуронідазу та виявив сильнішу інгібіторну активність із значеннями ICso 182,74 і 208,36 мкг/мл відповідно. Також повідомлялося про активність етанолових екстрактів для нерозчинної фракції Spirulina platensis з IC5o 150 мкг/мл [42]. Інше дослідження, проведене Yamaguchi та Koketsu [19], показало, що Nostochopsis lobatus MAC0804NAN продукує велику кількість полісахаридів із високим інгібуючим ефектом (IC50=7.18 мкг/мл). Також повідомлялося, що Arthrospira- похідний пептид може брати участь у інгібуванні гіалуронідази [4]. Разом ці результати підтверджують потенціал сполук і екстрактів ціанобактерій як інгредієнтів для запобігання старінню в космецевтиці.

З огляду на еластазу, лише ацетонові екстракти показали цікаву біоактивність. Leptolyng-bya див. ectocarpi LEGE 11479 знову був найактивнішим (рис. 2), будучи єдиним штамом, який досяг ICso, зі значенням 391 мкг/мл. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 і Leptolyngbya boryana LEGE 15486 досягли лише IC25 із значеннями 126,86 і 99 мкг/мл відповідно. Що стосується гіалуронідази, то найбільш перспективними виявилися морські штами.

Наскільки нам відомо, немає попередніх повідомлень про інгібіторну активність еластази для досліджених тут штамів. Що стосується інших штамів, було виявлено, що Nostoc minutum продукує пептиди типу мікровіридинів і ностопептини з ICso =1.3 і 11.0 мкг/мл [44,45]. Мікровірідини B і мікровіридини, що містяться в Microcystis aeruginosa, також ефективно інгібували еластазу, зі значеннями ICso 0.044 і 0,084 мкг/мл [46]. Більшість доступних даних щодо інгібування еластази зосереджено на ізольованих сполуках, тому порівняти з екстрактами наших штамів важко.

Нерівномірна пігментація шкіри, пов’язана як зі старінням, так і з ультрафіолетовим випромінюванням, залишається основною проблемою старіючого населення та косметичної промисловості. Більшість доступних досліджень є незначними і використовують грибну тирозиназу як ферментативну модель, що ускладнює перенесення результатів на людське середовище, тим не менш, цей фермент має високу схожість і гомологію з людською тирозиназою [47]. Таким чином, ту саму ферментативну модель використовували тут для дослідження потенціалу екстрактів ціанобактерій у інгібуванні тирозинази. Що стосується еластази, то лише ацетонові екстракти здатні інгібувати тирозиназу. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 був найефективнішим (рис. 2), будучи єдиним штамом, який досяг IC#N (989,26±4,3 мкг/мл). Нижче був Leptolyngbya boryana LEGE 15486 з IC25=784 78±4,33 мкг/мл. мл, і, нарешті, Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, причому найбільш багатообіцяючі результати були знайдені для морських штамів.

Morone та його співробітники [26] раніше досліджували активність етанольних екстрактів ціанобактерій у тій же моделі, але не виявили активності. Одним із цікавих аспектів є те, що одним із досліджуваних штамів був Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, який показав найкращі результати, ще раз підкреслюючи важливість екстракційних розчинників для отримання цільових біоактивних екстрактів. Що стосується інших досліджених ферментів, опитувань, присвячених ціанобактеріям, також мало для тирозинази. У роботі, проведеній Ябутою та його командою [48], повідомлялося, що гарячий водний екстракт Nostochopsis spp. значно пригнічував активність тирозинази (IC50=250 мкг/мл). Це дуже цікавий результат, враховуючи, що він є результатом водного екстракту, для якого не було виявлено активності в цьому дослідженні. Автори пояснюють результат низькомолекулярними сполуками, що вивільняються з PBP під час термічної обробки, а саме біліновим фрагментом, який діє як потужний поглинач пероксильних радикалів. Інше дослідження оцінювало інгібіторну активність етанолового (IC50=14, 000 мкг/мл) і водного (IC50 =72, 000 мкг/мл) екстрактів Arthrospira platensis. значення були пов’язані з наявністю фенольних сполук, таких як ферулова та кавова кислоти в етанольному екстракті [49].

2.3.3. УФ-захист

Незважаючи на те, що все більше косметичних компаній додають сонцезахисні засоби у свої продукти, все ще важко переконати споживачів у перевагах їх щоденного використання для уповільнення передчасного старіння шкіри. Якщо, з одного боку, щоденне застосування сонцеблокаторів є невеликою вкоріненою звичкою, з іншого боку, існує певний страх перед використанням синтетичних речовин через небажані пов’язані з ними ризики [50]. У зв’язку з цим дослідження природного фотозахисту значно збільшилися за останні кілька років, враховуючи їхній потенціал біологічного розкладу та меншу токсичність, що робить їх більш корисними для людини та навколишнього середовища. Щоб дослідити екстракти ціанобактерій у цій галузі, їхню здатність діяти як сонцезахисні засоби оцінювали in vitro для UVR-B, оскільки це найшкідливіше випромінювання. Результати, отримані для водного та ацетонового екстрактів ціанобактерій, представлені в таблиці 7.

Що стосується ацетонових екстрактів, то найбільш багатообіцяюче значення (19,2) було виявлено для Leptolyngbya boryana LEGE 15486, за яким іде Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10,7), обидва з найнижчою протестованою концентрацією, 200 мкг/мл. Найменш перспективним серед ацетонових екстрактів був Nodosilinea nodulosa LEGE 06104. У водних екстрактах найбільш багатообіцяючі результати були отримані для найвищої протестованої концентрації, з Leptolyngbya boryana LEGE 15486 і Cephalothrix lacustris LEGE 15493, які виділялися зі значеннями SPF in vitro 17,1 і 14,9 відповідно (Таблиця 7).подовження життя cistancheОбговорюючи попередні дослідження в цій галузі, Хоссейн і його команда [51] повідомили, що значення SPF для екстракту Cephalothrix komarekiana становило 2,37. Інша група виявила, що SPF метанольного екстракту Aphanizomenon flos-aquae становив 4 [52]. Однак інформація про концентрацію екстракту, яку використовували автори, була недоступна, що ускладнювало можливі порівняння.

Кількість штамів ціанобактерій, досліджених у сфері косметики, особливо щодо SPF, є дуже малою, враховуючи потенційні можливості цих ресурсів. Представлені тут результати демонструють, що види, які досліджуються, можуть бути хорошими варіантами як біологічні фотозахисні засоби та, можливо, діяти як підсилювачі інших сонцезахисних засобів, які зараз продаються, дозволяючи зменшити концентрацію синтетичних сонцезахисних засобів у формулах. Тому вкрай важливо розширити дослідження цих організмів, особливо їхніх біоактивних екстрактів, які, будучи значно нижчою вартістю, вищою врожайністю та швидшим отриманням, ніж ізольовані сполуки, є екологічно чистішими та економічно привабливішими.

2.4. Дискримінація екстрактів ціанобактерій за допомогою PCA аналізу

Останніми роками зріс пошук біологічно активних сполук з природних джерел, які можна використовувати як інгредієнти в косметиці. Крім того, що сполуки, отримані з ціанобактерій, є потенційно менш токсичними та повністю піддаються біологічному розкладанню, вони доступні з відновлюваних джерел і можуть бути отримані за низькою ціною в контрольованому середовищі.cistanche нзКласифікація біологічно активних екстрактів відповідно до їх хімічного складу та біологічної активності може бути корисною для виявлення потенційних взаємозв’язків. У зв’язку з цим було застосовано аналіз головних компонентів (PCA), враховуючи хімічний склад екстрактів ціанобактерій і біоактивність найвищої концентрації, протестованої в кожному аналізі (рис. 3). Як можна помітити, 72,99 відсотка варіабельності можна пояснити першими двома параметрами: PCl становив 50.41 відсотка дисперсії, тоді як PC2 відповідав за 22,58 відсотка. Було виділено три групи (рис. 3A). ): Gl, за участю водного екстракту Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2, що включає водні екстракти Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 і Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; і G3, що включає всі ацетонові екстракти. Згідно з малюнком 3B, Gl хімічно відрізняється від інших зразків через вміст PE; Водні екстракти Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 і Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 згруповані за вмістом PC, APC і загальних білків (G2), тоді як усі ацетонові екстракти знаходяться в одній групі (G3) завдяки до вмісту в них каротиноїдів, а також хлорофілу А та його похідних. Сполуки за межами ферментативної активності відображаються з площинами, утвореними з позитивною віссю PCl (рис. 3B). Можна помітити, що зразки з більш високим вмістом хлорофілу а і каротиноїдів тісно пов'язані з інгібуванням еластази і тирозинази. Це демонструє сильна позитивна кореляція між каротиноїдами та еластазою (0,725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). Загалом аналіз PCA дозволив згрупувати екстракти відповідно до біологічної активності, яка проявляється у сфері старіння шкіри, що призвело до висновку, що екстракти ацетону є більш ефективними в інгібуванні ферментів, відповідальних за розпад шкіри. дермального матрикса та втрати структури шкіри, тоді як водні екстракти ефективніші в поглинанні вільних радикалів і захисті шкіри від шкідливого впливу УФ-випромінювання.

Наскільки нам відомо, це перший випадок, коли було встановлено зв'язок між хімічним складом і біологічною активністю екстрактів цих штамів ціанобактерій.

3. Матеріали та методи

3.1. Виробництво біомаси ціанобактерій

Чотири штами ниткоподібних ціанобактерій, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 і Leptolyngbya boryana LEGE 15486, з бразильських прісноводних екосистем, і Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 і Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 з португальських морських екосистем були використані в цьому дослідженні. Штами зберігалися в Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE CC) у Міждисциплінарному центрі морських та екологічних досліджень (CIIMAR). Для цілей виробництва біомаси була встановлена ​​схема збільшення масштабу культури, починаючи з 40 мл під лабораторним контролем. в контрольованих умовах, послідовно масштабованих до 4 л. Штами вирощували в середовищі Z8 [53], доповненому 10 мкг/л вітаміну B12 і 25 г/LNaCl для морських штамів. Культури підтримували при 25 градусах з інтенсивністю світла 10 мкмоль фотонів м-2 с-4 і з фотоперіодом 14 годин світла:10 годин темряви. Свіжу біомасу збирали через 120 або 150 днів росту (залежно від штаму) за допомогою фільтрації, заморожували, ліофілізували та зберігали при -20 градусах до приготування екстракту.

3.2. Приготування екстрактів

З кожного штаму послідовно готували два різних екстракти: ацетоновий і водний. Спочатку готували ацетоновий екстракт, використовуючи 2 г сухої біомаси. Біомасу суспендували в ацетоні та екстрагували протягом 10 хвилин в ультразвуковій ванні (Fisherbrand [FB15053, Лафборо, Великобританія). Після екстракції ацетоном отриманий осад залишили сушитися у витяжній шафі, а потім екстрагували 70 мл дистильованої води, дотримуючись тієї ж процедури. Клітинний дебрис видаляли центрифугуванням при 10,00×× g Gs протягом 5 хвилин при 4 градусах у мікроцентрифузі HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA). Супернатанти з кожної екстракції випарювали при зниженій температурі тиску (роторний випарник BUCHIR-210) (ацетоновий екстракт) або заморожений і ліофілізований (водний екстракт). Екстракцію відповідним супернатаром повторювали 3 рази. Сухі екстракти зберігали при -20 градусах до подальшого хімічного та біологічного аналізу.

3.3. Клітинний аналіз

3.3.1. Культура клітин

Кератиноцити людини HaCAT (ATCC), фібробласти миші 3L1 (ATCC) і ендотеліальні клітини людини hCMEC (надані Dr. POCouraud (INSERM)) використовували для оцінки цитотоксичності. Клітинні лінії культивували в модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Глазго, Великобританія), доповненому 10 відсотком (v) фетальної бичачої сироватки (Gibco), 1 відсотком пеніциліну-стрептоміцину (Pen-Strep 100 МО). /мл і 10 мг/мл відповідно) (Gibco) і 0,1 відсотка амфотерицину В (Gibco). Підтримку клітин і аналізи проводили при 37 градусах у зволоженій атмосфері 5 відсотків CO2, а культуральне середовище оновлювали кожні два дні. При 80-90 відсотковому злитті клітин прилиплі клітини промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином (PBS, Gibco), відокремлювали експрес-ферментом TrypLEX (1×) (Gibco), пропускали для підтримки та висівали для запланованих аналізів.

3.3.2. Цитотоксичність — аналіз МТТ

Життєздатність клітин оцінювали за зниженням {{0}}(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію броміду (MTI, Sigma-Aldrich, Німеччина), як повідомлялося раніше [26]. Усі клітинні лінії (ендотеліальні клітини, фібробласти та кератиноцити) висівали в 96-лункові планшети з щільністю 1,0 × 10 клітин/мл, 3,3 × 104 клітин/мл і 2,5 × 104 клітин/мл відповідно.розмір пеніса cistancheЧерез 24 години клітинної адгезії культуральне середовище видаляли, і клітини витримували протягом 24 і 48 годин у свіжому середовищі, що містило різні екстракти ціанобактерій у п’яти серійних концентраціях від 12,5 до 200 мкг/мл. Для ацетонових екстрактів вихідні розчини готували в диметилсульфоксиді (DMSO) (Gibco) і розбавляли DMEM перед впливом на клітини так, щоб максимальна концентрація DMSO не перевищувала 1 відсоток. Водні екстракти готували в PBS і розбавляли DMEM перед експозицією клітин. Негативним контролем був PBS, а контролем загибелі клітин був DMSO 20%. Після інкубації проводили аналіз цитотоксичності MIT. Коротко, 20 мкл розчину МТТ додавали до кожної лунки та інкубували при 37 градусах протягом 3 годин. Після інкубації середовище обережно видаляли, а солі формазану фіолетового кольору розчиняли в ДМСО. Оптичну густину зчитували при 550 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Synergy HT з кількома виявленнями (Biorek, Бад-Фрідріхсхалл, Німеччина), що працює за допомогою програмного забезпечення GEN51M. Аналіз проводили в чотирьох повторах і усереднювали. Для відтворюваності кожен аналіз незалежно повторювали щонайменше тричі. Цитотоксичність виражали як відсоток життєздатності клітин, враховуючи 100-відсоткову життєздатність у контрольному розчиннику.

3.4. Хімічний профіль екстрактів ціанобактерій

3.4.1. Загальний вміст фенолів (TPC)

Для визначення TPC екстрактів використовували колориметричний аналіз, заснований на методології Фоліна-Чокальтеу [54] з невеликими модифікаціями. Ацетонові екстракти розчиняли в ДМСО, а водні екстракти – у воді. Коротко, 25 мкл кожного екстракту （10мг/мл） було повністю змішано з 25 мкл реагенту Фоліна-Чокальтеу （Sigma-Aldrich）20{{20}} мкл розчину NagCO3 і 500 мкл деіонізованої води. Для холостої проби реактив Фоліна-Чокальтеу замінили деіонізованою водою. Оптичну щільність утвореного забарвленого продукту вимірювали при 725 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Бад-Фрідріхсхалль, Німеччина), що працює за допомогою програмного забезпечення GEN51M. Стандартні криві для кількісного визначення TPC були отримані з використанням семи концентрацій галової кислоти (GA) (від 0,025 до 0,5 мг/мл), приготованих у тому самому розчиннику, що й екстракти для тестування (y=2.097x＋0.01560 R²{{ 22}}.9989, для ацетону, і y=2.204x＋0,01401,R2=0.9982, для води, де «y» означає поглинання, а «x» — концентрацію) . Було проведено три незалежні визначення в дублікатах. Загальний вміст фенолів виражали як мкг GA еквівалентів (GAE) на мг сухого екстракту.

3.4.2.Загальні білки

Загальну концентрацію білка визначали за допомогою набору для аналізу білка BCA (#23227, Thermo-Scientific). Водні екстракти готували у воді, тоді як ацетонові екстракти готували в ДМСО. Коротко кажучи, у 96-лунковому планшеті, 25 мкл кожного екстракту (1 мг/мл) змішували з 200 мкл робочого реагенту. Оптичну густину вимірювали при 562 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Німеччина), що працює через програмне забезпечення GEN5IM. Стандартна крива (y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999 і y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99, де «y» означає абсорбцію, а «x» означає концентрацію) було отримано для кожного екстракту з використанням дев’яти концентрацій альбуміну (BSA) (від 25 до 2000 мкг/мл) для кількісного визначення білків. Три незалежні експерименти проводили в трьох повторах. Загальний вміст білка виражали як мкг еквівалентів бичачого сироваткового альбуміну (BSA) на мг сухого екстракту.

3.4.3.Пігменти

Пігменти, присутні як у водному, так і в ацетоновому екстрактах, кількісно визначали спектрофотометрично. Хлорофіл а та його похідні були кількісно визначені за допомогою калібрувальної кривої, отриманої за допомогою комерційного стандарту (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), де "y" відноситься до абсорбції, а "x" стосується концентрації. Загальний вміст каротиноїдів кількісно визначено як -каротин (Sigma-Aldrich) за його калібрувальною кривою （y=17.133x＋0,0099; R²=0.990, де "y" означає абсорбцію, а "x" означає концентрацію). Загальну концентрацію каротиноїдів виражали як мкг -каротину на мг сухого екстракту. Калібрувальні криві для обох стандартів були отримані з використанням п’яти різних концентрацій (від 0,001 до 0,025 мг/мл). Спектрофотометричні визначення проводилися в 96-лункових планшетах при 450 нм для -каротину та 663 нм для хлорофілу а, використовуючи зчитувач мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Німеччина), що працює через програмне забезпечення GEN5TM.

Вміст PBP визначали спектрофотометрично шляхом вимірювання абсорбції водних екстрактів на різних довжинах хвиль (562, 615 і 645 нм) і застосовуючи відповідні формули, як описано раніше Pagels et al. [34]: Водні екстракти ресуспендували до кінцевої концентрації 0,5 мг/мл. Експеримент проводили в трьох повторах, і результати виражали в мкг/мг сухого екстракту. 3.5.Біологічна активність

3.5.1. Поглинання супероксидного аніон-радикалу (O2*-).

Аналіз поглинання вільних радикалів Oz*- проводився для оцінки антиоксидантного потенціалу екстрактів ціанобактерій, згідно з Барбозою та його співробітниками [55], з незначними модифікаціями. Водні екстракти готували у воді, тоді як ацетонові екстракти готували в ДМСО. Для кожного екстракту було підготовлено п’ять серійних розведень і протестовано, щоб оцінити поведінку екстрактів і значення IC50. Усі реагенти розчиняли у фосфатному буфері （19 мкМ, рН 7,4）. Об’єм 50 мкл кожного розведення змішували з 50 мкл 166 мкМ розчину відновленої форми -нікотинамідаденіндинуклеотиду (NADH) і 150 мкл 43 мкМ нітротетразолію блакитного хлориду (NBT) у 96-лунковому планшеті. Після додавання 50 мкл 2,7 мкМ феназинметосульфату（PMS） активність поглинання радикалів у зразках контролювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Бад-Фрідріхсхалл, Німеччина), який керував програмним забезпеченням GEN51M, у кінетичній функції, при кімнатній температурі протягом 2 хв при 562 нм. Три незалежні аналізи проводили в трьох повторах. GA використовували як позитивний контроль. Результати виражали як відсоток поглинання радикалів у порівнянні з необробленим контролем. Результати для розрахованих значень IC50 були виражені як середнє значення ± стандартне відхилення (мкг/мл) принаймні трьох незалежних аналізів, проведених у двох примірниках. Значення IC50 і відповідні криві доза-реакція були розраховані за допомогою програмного забезпечення Graphpad Prism@ (Сан-Дієго, Каліфорнія, США; версія 9, для MacOS).

3.5.2. Інгібування гіалуронідази

Тест на інгібування гіалуронідази був дещо модифікований у порівнянні з тим, що запропоновано Ferreres та ін.【56】. Коротко, 25 мкл кожного екстракту (9 мг/мл), 175 мкл гіалуронової кислоти (ГК) (0.7 мг/мл) і 25 мкл гіалуронідази (ГАази) (90{{ 14}} Од/мл у NaCl0,9 відсотка ） змішали в реакційній пробірці. Водні екстракти готували у воді, а ацетонові екстракти готували в ДМСО. Після 30 хвилин інкубації при 37 градусах реакцію зупиняли додаванням 25 мкл тетраборату натрію (0,8 М у воді) з подальшою інкубацією протягом 3 хвилин при 90 градусах на водяній бані. Реакційні пробірки охолоджували до кімнатної температури, а потім додавали 375 мкл розчину DMAB[4-(диметиламіно)бензальдегіду]. Після 20 хвилин інкубації при 37 градусах оптичну щільність утвореного забарвленого продукту вимірювали при 560 нм у пристрої для зчитування мікропланшетів Synergy, HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Німеччина), що працює за допомогою програмного забезпечення GEN5IM. Негативний контроль проводили за відсутності екстракту. Динатрію кромоглікат (DSCG) використовували як позитивний контроль.

Три незалежні аналізи проводили в трьох примірниках, і результати виражали як відсоток інгібування ферменту в порівнянні з необробленим контролем.

3.5.3. Інгібування еластази

Аналіз інгібування еластази підшлункової залози свиней проводили відповідно до Mota та співавторів [57] з невеликими модифікаціями. Водні екстракти готували у воді, тоді як ацетонові екстракти готували в ДМСО. Коротко кажучи, у 96-лунковому планшеті 50 мкл екстракту змішували з 90 мкл буфера HEPES (0,1 М), 10 мкл субстрату N-сукциніл-Ala-Ala-Ala п-нітроаніліду（100 мкМ）, 70 мкл ацетатного буфера（200 мМ） і 30 мкл еластази（1 Од/мл） Планшет інкубували при 37 градусах 10 хвилин, і абсорбцію продукту реакції вимірювали при 405 нм у пристрої для зчитування мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Бад-Фрідріхсхалл, Німеччина), що працює через GEN51M. Негативний контроль проводили за відсутності екстракту, а аскорбінову кислоту використовували як позитивний контроль.порошок цистанчіТри незалежні аналізи проводили в трьох повторах. Результати виражали як відсоток інгібування ферменту порівняно з необробленим контролем.

3.5.4. Інгібування тирозинази

Аналіз інгібування тирозинази проводили відповідно до Adhikari та ін. [58]. з невеликими доопрацюваннями. Коротко кажучи, у 96-лунковому планшеті 20 мкл кожного екстракту змішували з 100 мкл тирозинази （30 ОД/мл у фосфатному буфері）. Водні екстракти готували у воді, тоді як ацетонові екстракти готували в ДМСО. Суміш інкубували при 30° протягом 8 хв. Потім додали 80 мкл розчину L-DOPA （L-3,4-дигідроксифенілаланіну） (2,5 мМ у фосфатному буфері) і негайно встановили поглинання (T0, поглинання за час «нуль») виміряно за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів Synergy HT Multi-detection (Biotek, Bad Friedrichshall, Німеччина), що працює через програмне забезпечення GEN5TM, при 475 нм. Визначення абсорбції при T0 (до утворення продукту реакції) дозволило усунути можливі перешкоди через природне забарвлення досліджуваних екстрактів. Після 8 хвилин інкубації при 30 градусах абсорбцію вимірювали знову (T8). Відсоток інгібування тирозинази в присутності екстрактів ціанобактерій розраховували порівняно з необробленим (негативним) контролем, де різниця між абсорбцією (T{ {21}}T0) відповідає 100 відсоткам активності ферменту. Негативний контроль проводили за відсутності екстракту, а койєву кислоту використовували як позитивний контроль. Три незалежні аналізи проводили в трьох повторах. Результати виражали як відсоток інгібування ферменту порівняно з необробленим контролем.

3.5.5. Сонцезахисний фактор (SPF)

Сонцезахисний фактор in vitro визначали згідно з Rohr та співавторами [59] з невеликими змінами. Водні екстракти готували у воді, тоді як ацетонові екстракти готували в ацетоні. Коротко, абсорбцію 2 мл кожного екстракту (20 і 1000 мкг/мл) вимірювали на спектрофотометрі (від 290 до 320 нм, 5 на 5 нм). SPF розраховувався за формулою, запропонованою Мансуром [60]: де EE（A） – спектр ефекту еритеми, I （A） – спектр сонячної інтенсивності, Abs（λ） – абсорбція екстракту, а CF – поправка коефіцієнт (28), визначений за допомогою комерційного сонцезахисного крему з відомим значенням SFP 30.

3.6. Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою статистичного програмного забезпечення IBM SPSS (версія 23.0 для macOS, IBM Corporation, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015). Дані аналізували на нормальність і однорідність дисперсій за Колмогоровим-Смирновим і Левеном тести, потім піддані односторонньому дисперсійному аналізу з використанням HSD Тьюкі (чесно суттєва різниця) як постдокументальний тест або непарному t-тесту. Тест кореляції Пірсона використовувався для порівняння нормалізованих даних експресії між хімічними профілями та біологічною активністю екстрактів ціанобактерій.

3.7. Аналіз основних компонентів (PCA)

PCA використовувався для перетворення ряду потенційно корельованих змінних у ряд відносно незалежних змінних, які можна ранжувати на основі їх внеску в пояснення варіації всього набору даних [61]. Відносно важливі компоненти багатовимірних візерунків можна успішно ідентифікувати. Вихідні багатовимірні дані можуть бути відображені в нижчому вимірному просторі, і тому складність проблеми класифікації високовимірного шаблону значно зменшується [62]. Для цього дослідження розпізнавання образів на основі PCA було виконано за допомогою статистичного програмного забезпечення IBM SPSS (версія 23.0 для macOS, IBM Corporation, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США, 2015). Матриця даних складалася з метаболітів, присутніх у водному та ацетоновому екстрактах чотирьох штамів ціанобактерій, і їхньої активності при найвищій протестованій концентрації.

4. Висновки

Виявилося, що біологічна активність екстрактів ціанобактерій, проаналізованих тут, чітко корелює. Відповідно до наявності біологічно активних PBP, водні екстракти були найефективнішими для захисту від УФ-променів, що, разом із їхньою здатністю поглинати радикали, пропонує їх як перспективні інгредієнти для використання в композиціях проти старіння, спрямованих на запобігання старінню шкіри, що посилюється зовнішніми факторами. З іншого боку, ацетонові екстракти виявилися більш ефективними в інгібуванні активності ферментів, відповідальних за деградацію дермального матриксу та втрату структури шкіри, тому вони більш придатні для лікування вікового старіння шкіри.екстракт цистанчі сальсиСхема послідовної екстракції, яку ми пропонуємо, може виявитися вигідною, дозволяючи отримувати хімічно різні біоактивні екстракти шляхом монетизації біомаси ціанобактерій, що робить процес більш стійким та економічно привабливим. Загалом, екстракти ціанобактерій виявилися гідними подальшого використання в області старіння шкіри, спрямованої на пошук натуральних, безпечних і стійких інгредієнтів для косметичних формул.

Ця стаття взята з Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs