Космецевтичний потенціал екстрактів, отриманих із залишків рибної промисловості: відходи сардин і тріски Частина 1
Jun 29, 2023
Анотація: рибна промисловість утворює велику кількість відходів (20–75 відсотків (ваги) від загальної ваги виловленої риби). Відновлення біологічно активних сполук із залишків і їх включення в косметику представляє багатообіцяючу ринкову можливість і може сприяти стійкій валоризації сектора. У цій роботі багаті білком екстракти, отримані за допомогою технологій високого тиску (надкритичний CO2 і субкритична вода) з відходів сардини (Sardina pilchardus) і каркасів тріски (Gadus morhua), були охарактеризовані щодо їх космецевтичного потенціалу. Антиоксидантну, протизапальну та антибактеріальну активність оцінювали за допомогою хімічного (аналіз ORAC), ферментативного (інгібування еластази та тирозинази), антимікробної чутливості (Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus та Cutibacterium acnes) та клітинного (у кератиноцитах-HaCaT) аналізів . Екстракти сардин продемонстрували найвищу антибактеріальну активність, а зріз, отриманий за допомогою вищих температур екстракції (250 ◦C) і без етапу знежирення, продемонстрував найнижчі значення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) (1,17; 4,6; {{24} }.59 мг/мл для K. pneumoniae, S. aureus і C. acnes відповідно). Зразки тріски, екстраговані при більш низьких температурах (90 ◦C), були найефективнішими протизапальними засобами (концентрація 0,75 мг/мл знижувала рівні IL-8 та IL-6 на 58% і 47% відповідно). , відносно позитивного контролю). Вміст треоніну, валіну, лейцину, аргініну та загального вмісту білка в екстрактах було підкреслено таким, що сильно корелює з зареєстрованою біоактивністю (R2 більше або дорівнює 0,7). Ці результати підтверджують потенційне застосування екстрактів з відходів рибної промисловості в космецевтичних продуктах з біоактивною дією.
Глікозид цистанхи може також підвищувати активність СОД у тканинах серця та печінки та значно знижувати вміст ліпофусцину та МДА в кожній тканині, ефективно поглинаючи різні реактивні кисневі радикали (OH-, H₂O₂ тощо) та захищаючи від пошкодження ДНК, спричиненого ОН-радикалами. Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche мають сильну здатність поглинати вільні радикали, вищу відновну здатність, ніж вітамін С, покращують активність СОД у суспензії сперми, знижують вміст МДА та мають певний захисний ефект на функцію мембрани сперми. Полісахариди цистанхе можуть підвищувати активність SOD і GSH-Px в еритроцитах і легеневих тканинах експериментально старіючих мишей, викликаних D-галактозою, а також знижувати вміст MDA і колагену в легенях і плазмі і підвищувати вміст еластину, мають хороша очищувальна дія на DPPH, подовжує час гіпоксії у старіючих мишей, покращує активність СОД у сироватці та затримує фізіологічну дегенерацію легенів у експериментально старіючих мишей. Експерименти показали, що цистанша має хорошу антиоксидантну здатність до клітинної морфологічної дегенерації. і має потенціал бути лікарським засобом для запобігання та лікування хвороб старіння шкіри. У той же час ехінакозид у Cistanche має значну здатність поглинати вільні радикали DPPH і має здатність поглинати активні форми кисню та запобігати індукованій вільними радикалами деградації колагену, а також має хороший ефект відновлення при пошкодженні аніонів вільних радикалів тиміну.
Натисніть на добавку Cistanche Tubulosa
【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Ключові слова: валоризація потоків рибних відходів; антиоксидантна активність; протизапальну активність; антимікробна активність; проти старіння; проти гіперпігментації; космецевтика
1. Введення
У постійному пошуку інновацій, особливо щодо активних інгредієнтів, косметична промисловість розвивається та продемонструвала намір замінити компоненти, отримані з нафти, на природні сполуки [1]. Антиоксидантні властивості натуральних активних інгредієнтів можуть допомогти в профілактиці кількох проблем зі шкірою, викликаних окисним стресом і старінням [2,3]. Старіння шкіри може бути спричинене як внутрішніми (такими як запалення або вкорочення теломер), так і зовнішніми (середовищем) факторами [4]. Старіння шкіри призводить до втрати зрілого колагену та змін у позаклітинному матриксі (ECM), що порушує бар’єрну функцію, що призводить до сухого вигляду та сприйнятливості до зовнішніх агресорів, що підвищує ризик шкірних захворювань [5]. Цей процес може бути прискорений декількома ферментами, такими як еластази, матриксні металопротеїнази (ММП) і гіалуронідази, які можуть індукувати деградацію ECM [6], або навіть накопиченням активних форм кисню (АФК), які можуть поставити під загрозу нормальну функцію клітини. [7]. Фактори навколишнього середовища, такі як вплив ультрафіолетового випромінювання, призводять до утворення великої кількості АФК, що викликає ті самі молекулярні та клітинні реакції, що й природне старіння, але з посиленими ефектами. Важливо, що АФК можуть посилювати активність ферментів, пов’язаних зі старінням шкіри або процесами пігментації шкіри [8,9], і, отже, присутність антиоксидантів n відіграє важливу роль у косметичній сфері.
У 2018 році світове споживання риби, за оцінками ФАО, становило 20,5 кг на піту [10], що призводить до великої кількості побічних продуктів, переважно шкіри та кісток. Утворені залишки відповідають 20–75 відсоткам (мас./мас.) загальної ваги виловленої риби, що потенційно може призвести до екологічних проблем [11,12]. Однак ці залишки все ще містять значну кількість ліпідів, білків і мінералів і повинні бути відповідним чином оцінені. Останніми роками екстракти з відходів рибної промисловості продемонстрували такі активні властивості, як антигіпертензивні, антиоксидантні, антимікробні, нейропротекторні, антигіперглікемічні, проти старіння та протизапальні [13–19]. Атлантична тріска (Gadus rhea) і сардина (Sardina pilchardus) є одними з найбільш споживаних риб у Португалії, а рослини, отримані з її залишків, показали багатообіцяючий нутрицевтичний потенціал, такий як антиоксидантна, антипроліферативна або протизапальна дія [11,20–22]. Однак, оскільки використання та валоризація відходів рибної промисловості все ще знаходяться на ранній стадії, є багато можливостей для дослідження можливостей промисловості для перетворення цих відходів у високоцінні ринкові біопродукти, включаючи косметичні інгредієнти.
У попередній роботі ми досліджували використання технологій високого тиску (надкритичний CO2 і субкритична вода) для виділення біоактивних фракцій з відходів сардин і тріски з багатообіцяючою користю для здоров’я [11,22]. Для відходів сардин ми продемонстрували, що шляхом застосування першого етапу з надкритичним вуглецем (ScCO2) (для видалення ліпідної фракції) з подальшим процесом екстракції субкритичною водою (SW) можна отримати білкові гідролізати з високим антиоксидантним потенціалом та антипроліферативним ефектом у клітини колоректального раку [22]. Субкритичну водну екстракцію/гідроліз ми також застосували для отримання збагачених білками, пептидами та амінокислотами екстрактів із каркасів тріски, і ми показали, що нижчі температури обробки (90 ◦C) сприяють екстракції сполук із протизапальним потенціалом в епітеліальних клітинах кишечника людини модель [11]. Більшість білків, присутніх в екстрактах тріски, є колагеном і колагеновими фрагментами. Інші сполуки включають незначну кількість ліпідів, золи та деяких цукрів. Екстракти сардин були багаті пептидами та амінокислотами, а також були присутні ліпіди, зола та цукри. Оскільки білки та пептиди, отримані з риби, можуть стати важливим ресурсом для косметичної промисловості, це дослідження спрямоване на подальшу оцінку активного потенціалу цих екстрактів, отриманих з відходів переробки риби та побічних продуктів, викликаних оцінкою їхнього космецевтичного потенціалу [23] . З цією метою було застосовано низку хімічних, ферментативних і клітинних аналізів, щоб дослідити антиоксидантну, антистарільну, антигіперпігментаційну, протизапальну та антимікробну дію екстрагованих зразків. Також були проведені кореляційні дослідження для визначення основних біоактивних компонентів з космецевтичним потенціалом.
2. Матеріали та методи
2.1. Реагенти
3,4-дигідрокси-1-фенілаланін (L-DOPA), грибна тирозиназа, свиняча панкреатична еластаза (PPE) типу III, N-сукциніл-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN), Tris ({ {11}}аміно- 2-гідроксиметилпропан-1,3-діол), 2,20 -азобіс (2-метилпропіонамідин)дигідрохлорид (AAPH) і 20 , 70 -дихлорфлуоресцеїну діацетат (DCFH-DA) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Миссурі, США). Бульйон Мюллера Хінтона (CAMHB) із скоригованим вмістом кальцію був придбаний у BD (Sparks, MD, США). Мозково-серцева інфузія (BHI) була придбана у Avantor (Раднор, Пенсільванія, США). Пакети AnaeroGen™ Compact були придбані в Oxoid (Гемпшир, Великобританія). PrestoBlue™, модифіковане середовище Ігла Дульбекко (DMEM), термоінактивовану фетальну бичачу сироватку (FBS) і пеніцилін-стрептоміцин були отримані від Invitrogen (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Іморталізована людська непухлинна клітинна лінія кератиноцитів HaCaT була отримана від Cell Line Service (Eppelheim, Німеччина). Набори для розробки людського IL-8 та IL-6 Mini TMB ELISA були отримані від Peprotech (Лондон, Великобританія). Усі інші реагенти та розчинники, використані в даному дослідженні, були аналітичного класу та придбані у доступних постачальників.
2.2. Зразки
Екстракти, використані в цій роботі, були розроблені в наших попередніх дослідженнях, зосереджених на оптимізації процесу [11,22]. Коротко кажучи, каркаси тріски були поставлені Pascoal and Filhos SA (Gafanha da Nazaré, Португалія) і складалися з хребта риби та прикріплених м’язів. Відходи сардин, виготовлені з голів, хребтів і нутрощів, були поставлені компанією Conservas A Poveira SA (Póvoa de Varzim, Португалія). Приблизний склад використовуваної сировини був представлений у наших попередніх роботах [11,22]. Білок (47 вагових відсотків) і зола (39 вагових відсотків) були основними компонентами каркасів тріски з невеликою кількістю ліпідів і вуглеводів (2 вагових відсотків і 0,3 вагових відсотків відповідно). Встановлено, що колаген є основним білком у каркасах тріски, і в цьому випадку на його частку припадає бл. 65 відсотків загального вмісту білка у вихідних відходах. Навпаки, сардина є жирною рибою, тому її відходи набагато багатші ліпідами, ніж риба тріски. У відходах від сардини вміст ліпідів становив 26% за масою та вміст білка 52% за масою, решта становила зола (17% за масою) і вуглеводи (3% за масою).
Екстракти з каркасів тріски (Cf1, Cf2, Cf3 і Cf4) і відходів сардин (S1, S2 і S3), відібрані для цієї роботи, були отримані за технологією високого тиску в лабораторному апараті, як описано раніше [11,22]. ,24], використовуючи умови, підсумовані в таблиці 1. Коротко, 60 г мелених каркасів тріски або відходів сардин (знежирених або незнежирених) завантажували в реактор високого тиску, який поміщали в духовку. Водяний насос увімкнули на бажану швидкість потоку (приблизно 10 мл/хв), а тиск встановили на 100 бар. Як тільки тиск досягав цього значення, електрична духовка вмикалася, і експеримент починався. Різні екстракти збирали протягом 30 хв при різних температурах (90–250 ◦C). Екстракти S1 і S3 були отримані після процесу знежирення відходів сардин ScCO2 перед екстракцією SW. Експерименти з екстрагування докритичної води були продубльовані. Для кожного екстрагованого зразка 25 мл відбирали в трьох примірниках, ліофілізували та зважували, щоб обчислити відповідний вихід екстракції. Аналітичні дані — вміст білка — виражаються як середнє ± стандартне відхилення (SD) трьох примірників. Інформація щодо характеристики цих екстрактів з точки зору вмісту білка, амінокислотного профілю, основних мінеральних сполук або токсичних і важких металів описана в наших попередніх роботах [11,22].
Базові розчини Cf1, Cf2, Cf3, Cf4 і S2 готували в Milli-Q H2O в концентрації 100 мг/мл. Інші зразки, а саме S1 і S3, були розчинені в ДМСО (300 і 550 мг/мл відповідно) через їх нижчу розчинність у воді. Зразки заморожували і зберігали при -20 ◦C до подальшого використання. Для клітинних аналізів зразки попередньо стерилізували теплом (121 ◦C, 15 хв) в автоклаві (Tuttnauer 3870 el, Бреда, Нідерланди).
2.3. Аналіз здатності до поглинання радикалів кисню (ORAC).
Аналіз ORAC проводили для оцінки антиоксидантної здатності зразків до пероксильних радикалів (ROO•) за методом, розробленим Huang et al. [25], з деякими коригуваннями, як повідомлялося раніше [26]. Коротко кажучи, у чорний 96-лунковий мікропланшет 150 мкл динатрію флуоресцеїну (0,3 мкМ) додавали до 25 мкл розведень зразків та інкубували протягом 10 хвилин при 37 ◦C. Після цього реакцію ініціювали додаванням 25 мкл 2,20 - азобіс (2-амідинопропан) дигідрохлориду (AAPH, 153 мМ) і флуоресценції (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20) нм) вимірювали протягом 40 хвилин при 37 ◦C у флуоресцентному зчитувальному пристрої для мікропланшетів FLx800 (FL800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, США). Стандартну криву готували з використанням 5, 10, 20, 30 і 40 мкМ (6-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2- карбонової кислоти (Trolox )). Усі розчини готували у фосфатно-сольовому буфері (PBS), 75 мМ, pH 7,4. Результати виражені в мікромолях еквівалентної антиоксидантної здатності Trolox на грам екстракту (мкмоль TEAC/г екстракту).
2.4. Ферментативні аналізи
2.4.1. Тест на інгібування еластази
Цей аналіз базувався на роботі Wittenauer та ін. [27] з деякими модифікаціями, як описано раніше [6]. Інгібіторну активність еластази визначають спектрофотометричним методом з використанням еластази підшлункової залози свині (PPE) і N-сукциніл-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) як ферменту-субстрату, шляхом моніторингу вивільнення p-нітроаніліну при 41{ {19}} нм. PPE розчиняли в 100 мМ Трис (2-аміно-2-гідроксиметил-пропан-1,3-діол)-HCl буфері (pH=8.0) до концентрації 1 мг/мл і зберігають при 20 ◦C в аліквотах. У день аналізу відбирали аліквоту і розводили в буфері до концентрації 0,03 ОД/мл, 10 мкл завантажували в лунки мікропланшетів разом із 100 мкл трис-HCl буфера та 30 мкл кожного зразка. Після 20 хв попередньої інкубації при 25 ◦C реакцію ініціювали додаванням 40 мкл субстрату AAAPVN (0,55 мМ). Оптичну здатність вимірювали протягом 20 хвилин після додавання AAAPVN на спектрофотометрі BioTek Instruments EPOCH 2 для зчитування мікропланшетів. Обчислення проводили, як описано в рівнянні (1), де A контроль і Asample представляють поглинання при 410 нм за відсутності або присутності зразка відповідно. Оскільки ДМСО використовувався для розчинення зразків S1 і S3, цей розчинник також був протестований і використаний як контроль для цих зразків. Потенціал екстрактів інгібувати еластазу оцінювали при зростанні концентрацій, щоб визначити дозозалежні співвідношення та встановити значення напівмаксимальної інгібуючої концентрації (IC50), що вказує на здатність кожного зразка інгібувати ферментативну активність до 50 відсотків.
Усі результати виражені як середні значення IC50 з нижньою та верхньою межами 95-відсоткового довірчого інтервалу, отримані щонайменше з трьох незалежних експериментів.
2.4.2. Тест на інгібування тирозинази
Потенціал інгібування тирозинази екстрактів оцінювався спектрофотометрично з використанням тирозинази грибів і L-DOPA як субстрату [28]. Тирозиназа перетворює L-DOPA на допахінон, який послідовно циклізується з утворенням допахрому. Утворення допахрому можна спостерігати шляхом вимірювання поглинання при 475 нм. Субстрат додавали до ферменту в присутності розведень зразків до кінцевої концентрації 30 U/мл тирозинази та 2,5 мМ L-DOPA. Оскільки ДМСО використовувався для розчинення зразків S1 і S3, цей розчинник також був протестований і використаний як контроль для цих зразків. Після інкубації при 37 ◦C протягом 30 хвилин абсорбцію вимірювали при 475 нм на мікропланшетному спектрофотометрі BioTek Instruments EPOCH 2. Усі реагенти готували в натрій-фосфатному буфері (SPB; 0,1 М, рН 6,8), отриманому змішуванням двоосновного дигідрату фосфату натрію та моногідрату одноосновного фосфату натрію, і розрахунки проводили, як описано в рівнянні (1). Усі результати виражені як середні значення IC50 з нижньою та верхньою межами 95-відсоткового довірчого інтервалу, отримані щонайменше з трьох незалежних експериментів.
2.5. Тестування на антимікробну чутливість
Цільовими мікроорганізмами, обраними для аналізів антибактеріальної активності, були грамнегативні бактерії Klebsiella pneumoniae CECT 8453 і грампозитивні бактерії Staphylococcus aureus ATCC 6538 і Cutibacterium acnes ATCC 6919T. Для K. pneumoniae CECT 8453 і S. aureus ATCC 6538 аналізи проводили відповідно до методу мікророзведення бульйону за рекомендаціями CLSI M07-A10, як описано раніше Rodrigues et al. [29]. Коротше кажучи, вихідні розчини екстракту розподіляли в круглодонний мікротитраційний 96-лунковий планшет і 2-кратно розводили в бульйоні Мюллера Хінтона з відрегульованим вмістом кальцію (CAMHB; BD, Sparks, MD, USA), щоб отримати діапазон концентрацій розчинів. Інокулят готували методом вирощування для отримання гомогенної суспензії в сольовому розчині. Відкоригований інокулят додатково розбавляли в CAMHB, щоб гарантувати, що після інокуляції кожна лунка містила приблизно 5 × 104 КУО. Планшети інкубували в аеробних умовах при 37 ◦C протягом 16-20 годин. Для C. acnes аналізи проводили, як описано раніше, з використанням бульйону мозково-серцевої інфузії (BHI) (Avantor, Radnor, PA, США) замість CAMHB та шляхом інкубації мікротитраційних планшетів протягом 70–74 годин при 37 ◦ C в анаеробних банках, що містять систему створення атмосфери AnaeroGen™ Compact (Oxoid, Гемпшир, Великобританія).
Для кожного проаналізованого основного розчину позитивний контроль (CAMHB або BHI та розведений інокулят), контроль середньої стерильності (неінокульований CAMHB або BHI) і контроль стерильності екстракту (неінокульований 2-кратний екстракт екстракту маточного розчину в CAMHB або BHI) були виконані відповідно. Значення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) являли собою найнижчу концентрацію зразка, яка помітно пригнічувала ріст мікробів після інкубації. За потреби значення MIC підтверджували за допомогою реагенту життєздатності клітин PrestoBlue™ (Invitrogen, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) відповідно до вказівок виробника. Додаткове значення МІК, позначене МІК*, також було встановлено та визначено як найнижча концентрація зразка, при якій ріст бактерій візуально та диференційовано впливав порівняно з позитивним контролем. Значення мінімальної бактерицидної концентрації (MBC) вказувалися як найнижча концентрація зразка, що призвело до зменшення кількості життєздатних бактерій щонайменше на 99,9 відсотків порівняно з початковим інокулятом і за рівного часу інкубації. Результати виражали як медіану значень, отриманих після трьох біологічних повторень. Оскільки ДМСО використовувався для розчинення зразків S1 і S3, цей розчинник також перевіряли, щоб переконатися, що кінцева використана концентрація не заважає цільовому мікроорганізму, отже, аналізу.
2.6. Клітинні аналізи
2.6.1. Культура клітин
Клітинну лінію кератиноцитів людини HaCaT (CLS, Німеччина) культивували в стандартному середовищі Дульбекко, модифікованому Іглу (DMEM), доповненому 10 відсотками (об./об.) фетальної бичачої сироватки (FBS) і 1 відсотком (об./об.) пеніцилін-стрептоміцину. Клітини регулярно зберігали у вигляді моношарів у культуральних колбах об’ємом 75 см2 та інкубували при 37 ◦C з 5 відсотками CO2 у зволоженій атмосфері.
2.6.2. Цитотоксичність in vitro
Дослідження цитотоксичності проводили згідно з попередніми роботами [6]. Коротко, клітини HaCaT висівали з щільністю 1,4 × 105 клітин/см2 у 96-лункові планшети. Через 3 дні клітини інкубували з різними концентраціями кожного зразка (Cf1; Cf2; Cf3; Cf4; S2—50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, {{30} }.78, 0.39; S1—3, 1.5, 0.75, 0.38, {{40}}.19, {{51 }}.09, 0.05, 0.02; S3—5,5, 2,75, 1,38, 0,69, 0,34, 0,17, 0,09, 0,04 мг/мл), розведених у культуральному середовищі (середовище DMEM, що містить 0,5% FBS). Лунки, що містять клітини, інкубовані лише з культуральним середовищем, доповненим 0,5 відсотками (об./об.) FBS, використовували як контроль. Контроль розчинника з 50% води або 1% ДМСО в культуральному середовищі також проводили для виключення токсичності розчинника. Після 24 годин інкубації життєздатність клітин оцінювали за допомогою PrestoBlue® (5 відсотків об’єму в культуральному середовищі) протягом 2 годин при 37 ◦C, 5 відсотків CO2, згідно з інструкціями виробника. Після цього вимірювали флуоресценцію кожної лунки (Ex./Em. 560 ± 20/590 ± 20 нм) у флуоресцентному зчитувальному пристрої для мікропланшетів FLx800 (BioTek Instruments, Winooski, VT, США). Життєздатність клітин виражали як відсоток життєздатних клітин відносно контролю. Три незалежні експерименти проводили в трьох повторах.
2.6.3. Клітинна антиоксидантна активність
Антиоксидантну активність клітин оцінювали за раніше описаними методами [6,30] з деякими модифікаціями. Коротко, клітини HaCaT висівали з щільністю 1,4 × 105 клітин/см2 у 96-лункові планшети, а утворення внутрішньоклітинних АФК спостерігали за допомогою 20,70 -дихлорфлюоресцеїну діацетату ( DCFH-DA) як флуоресцентний зонд. Через 72 години після посіву клітини промивали PBS та інкубували з нетоксичними концентраціями зразків (0,1875 мг/мл; 0,375 мг/мл; 0,75 мг/мл) плюс 25 мкМ DCFH-DA у PBS протягом 1 години. Згодом клітини знову промивали PBS та інкубували з індуктором стресу (600 мкМ AAPH у PBS) протягом 1 години. Після цього флуоресценцію вимірювали в флуоресцентному рідері мікропланшетів FL800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, США) (Ex/Em 485 ± 20/528 ± 20 нм). Результати виражені у відсотках ROS відносно необробленого контролю (клітини, оброблені DCFH-DA та AAPH). Три незалежні експерименти проводили в трьох повторах.
2.6.4. Оцінка секреції IL-6 та IL-8
Експерименти проводили, як описано раніше [31], з кількома модифікаціями. Коротко, клітини HaCaT висівали з щільністю 1 × 105 клітин/см2 у 12-лункові планшети. Через 3 дні клітини стимулювали 15 мкг/мл ліпополісахаридів (ЛПС) з Escherichia coli та спільно інкубували з трьома різними концентраціями кожного екстракту ({{10}}.1875 мг/мл; {{ 14}}.375 мг/мл; 0,75 мг/мл), розведений у культуральному середовищі (середовище DMEM, що містить 0,5% FBS). Клітини, інкубовані лише з LPS, і клітини, інкубовані лише з культуральним середовищем, використовували як позитивний і негативний контроль відповідно. Через 24 години супернатанти збирали, центрифугували протягом 10 хвилин при 2000 g і зберігали при -80 ◦C до подальшого аналізу. Рівні IL-6 та IL-8 оцінювали за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA), використовуючи комерційно доступні набори (PeproTech; Лондон, Великобританія), відповідно до інструкцій виробника, з вимірюванням абсорбції при 450 нм з корекцією довжини хвилі, встановленою на 620 нм у мікропланшетному спектрофотометрі (EPOCH 2, BioTek Instruments, Winooski, VT, США). Результати виражені у відсотках IL-6 або IL-8 відносно позитивного контролю (клітин, стимульованих LPS). Три незалежні експерименти проводили в трьох повторах.
2.7. Статистичний аналіз
Результати ORAC і клітинного аналізу виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення, отримане принаймні з трьох незалежних експериментів. Для ферментативного аналізу та аналізу цитотоксичності значення IC50 визначали з кривих доза-відповідь через графіки log10 за допомогою GraphPad Prism 8.4.3. програмне забезпечення (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, США). Результати представлені як IC50 з 95-відсотковим довірчим інтервалом. Статистичну обробку результатів проводили з використанням попереднього програмного забезпечення. Коли було перевірено однорідну дисперсію та нормальний розподіл даних, результати аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), а потім використовували тест Тьюкі для численних порівнянь. У разі неоднорідних дисперсій або якщо дані не були нормально розподілені, був виконаний відповідний непарний t-критерій Стьюдента, щоб визначити, чи були середні значення істотно різними. Р-значення менше або дорівнює 0,05 вважалося статистично значущим у всіх випадках. Результати тестування антимікробної чутливості виражаються як середнє значення, отримане принаймні з трьох незалежних експериментів.
3. Результати та їх обговорення
This study aims to investigate the cosmeceutical potential of protein-rich extracts that were produced by high-pressure technologies from fishery industry wastes, namely sardine wastes and codfish frames [11,22]. The selection of extracts was based on previous results regarding their characterization and process conditions. For codfish, all extracts were selected aiming at evaluating the impact of the extraction temperature on the recovery of compounds with promising bioactive effects on the skin. For sardine extracts, only three extracts derived from both defatted and non-defatted raw materials, processed at higher temperatures (190 and 250 ◦C) and with the highest extraction yield (>45,7 г/100 г). Результати щодо загального вмісту білка в кожному екстракті представлені в таблиці 1.
3.1. Антиоксидантна, антивікова та антигіперпігментаційна дія
Потенційний космецевтичний ефект екстрактів спочатку перевірявся за допомогою хімічних і ферментативних аналізів, щоб оцінити їх антиоксидантну дію, дію проти старіння та гіперпігментацію. Для визначення антиоксидантної здатності було обрано аналіз ORAC, оскільки він вимірює здатність зразків поглинати біологічно значущі АФК, а саме пероксильні радикали, які вважаються одним із основних індукторів старіння шкіри [2,32]. Ефект проти старіння також оцінювався через інгібування еластази, оскільки, як повідомляється, цей фермент відповідає за деградацію еластину та інших білків ECM [6]. Для ефекту проти гіперпігментації використовувався аналіз тирозинази, щоб оцінити здатність зразків пригнічувати вироблення меланіну. Таблиця 2 підсумовує значення ORAC та IC50 для всіх екстрактів.
Наші результати показують, що екстракти сардини та тріски демонструють антиоксидантну дію та пригнічують дію ферментів еластази та тирозинази. Серед зразків сардин S1 показав найвище значення ORAC (1,94 ± 0.08 мкмоль TEAC/мг екстракту), за ним йдуть S3 і S2. Ці результати отримані за попередньою оцінкою антиоксидантів за допомогою альтернативного методу (аналіз 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразил-DPPH), де екстракт S1 мав найнижчі значення IC50 [22]. Вищу здатність поглинати пероксильні радикали зразка S1 можна отримати з пептидів з різними амінокислотними послідовностями, присутніми в екстрактах, оскільки взаємодії між ними можуть впливати на здатність поглинати радикали [33]. Крім того, сполуки, що утворюються в реакціях Майяра або інших реакціях термоокислення, можуть впливати на антиоксидантну активність зразків [34]. Незважаючи на найнижче значення ORAC, зразки S2 і S3 мали найвищу здатність пригнічувати активності тирозинази та еластази відповідно.
Серед екстрактів тріски було показано, що Cf4 має найвищу антиоксидантну та антигіперпігментаційну активність. SEC-GPC аналіз екстрактів показав, що при підвищенні температури екстракції до 250 ◦C були отримані пептиди зі зменшенням молекулярної маси [11]. Здатність цього зразка до інгібування еластази знаходиться в діапазоні значень, знайдених для інших екстрактів Cf, а саме Cf1 і Cf3. Однак у досліджуваних концентраціях ці два екстракти не показали активності інгібування тирозинази.
У літературі деякі звіти показують, що екстракти морських побічних продуктів мають значну антиоксидантну активність та інгібують тирозиназу. Наприклад, екстракти, отримані з морських побічних продуктів (Scophthalmus maximus) шляхом лужного гідролізу, продемонстрували антиоксидантну активність, яку можна отримати за допомогою різних хімічних аналізів: 1,1-дифеніл-2- пікрилгідразил (DPPH) здатність поглинати радикали ( 36,12 відсотка відносно контролю), метод ABTS (2,20 -азінобіс-(3-етилбензотіазолін-6-сульфокислота) (12,81 мкг BHT/мл) і аналіз відбілювання кроцину (8.{ {28}}3 мкг тролокса/мл) [35]. В іншому дослідженні ферментативна екстракція солоної галуном медузи (Lobonema smithii) показала утворення гідролізатів із високою антиоксидантною активністю (IC{{20}}). 9 мг/мл для аналізів ABTS і DPPH) і інгібуючий потенціал тирозинази зі значеннями IC50 в діапазоні від 14,1 до 24,5 мг/мл [36], що є таким самим порядком величини, як отримані в цій роботі Крім того, екстракти з аналогічними антиоксидантними значеннями (значення ORAC – 0.4-3,5 мкмоль TEAC/мг екстракту) були отримані з іншого типу відходів харчової промисловості, а саме потоків відходів виноробства [6]. Однак ці екстракти виноробних залишків продемонстрували більш високу інгібуючу здатність тирозинази (IC50 від 4,0 до 0,14 мг екстракту/мл) і еластази (IC50 від 3,4 до 0,1 мг екстракту/мл), ніж отримані в цій роботі, ймовірно, через присутність фенольних сполук які, як визнано, мають кілька видів біоактивності. Важливо зазначити, що в нашому дослідженні ми використовували тирозиназу грибів для скринінгу антигіперпігментаційного ефекту екстрактів, оскільки цей фермент широко використовувався у високопродуктивних аналізах [37]. Тим не менш, оскільки існують деякі суперечності щодо подібності та гомології цього ферменту з тирозиназою ссавців/людини [38–40], слід розглянути майбутні дослідження за участю клітинних ліній ссавців, щоб оцінити потенційний ефект проти гіперпігментації екстрактів сардини та тріски.
Щоб визначити, які сполуки можуть бути відповідальними за біоактивну реакцію екстрактів, були проведені кореляційні дослідження між даними про біоактивність та амінокислотним складом екстрактів, про які повідомлялося раніше [11, 22] (Таблиця S1). Для антиоксидантної активності найвищі кореляції (R2 більше або дорівнює 0.7) були отримані між значенням ORAC і загальним вмістом треоніну, вільного валіну, а також вільного та загального лейцину для всіх екстрактів. У випадку зразків сардин була також отримана висока кореляція (R2 більше або дорівнює 0.94) для вільного та загального вмісту триптофану. Відповідно, раніше повідомлялося, що всі ці амінокислоти мають антиоксидантні властивості в кількох модельних системах [41–43]. Для активності інгібування еластази та тирозинази найвищі коефіцієнти кореляції (R2 більше або дорівнює 0.8) були отримані для загального вмісту білка та вільного аргініну відповідно, що свідчить про те, що ці сполуки можуть відігравати важливу роль у потенціалі Ефект проти старіння та гіперпігментації екстрактів відходів рибної промисловості.
【Додаткова інформація:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
