Аналіз складу та імунологічна активність олігосахаридів, виділених із Cistanche Deserticola

Як поліпшити пам'ять без ліків?

За додатковою інформацією звертайтесьali.ma@wecistanche.com

Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China

Анотація:Олігосахарид (CDOS) був отриманий зCistanche deserticolaекстракцією лугом (pH{{0}}), осадженням етанолом і фракціонуванням на дві очищені фракції (тобто CDOS-1 і CDOS-2) за допомогою Sephadex G-100 та фільтраційна хроматографія на колонці Sephadex G-25. Моносахаридний склад CDOS аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (HPLC). Було виявлено, що CDOS-1 складається лише з сахарози, а CDOS-2 в основному складається з сахарози, рамнози та маніту з молярним співвідношенням 1:0,73:3,61. Імунологічні тести показали, що CDOS має значний вплив на індекс селезінки миші, підвищуючи активність фагоцитозу макрофагів і стимулюючи проліферацію клітин, що продукують антитіла. Є надія, що CDOS буде розроблено у функціональну їжу чи ліки.

Ключові слова:Cistanche deserticola, олігосахарид, очищення, склад, імунологічна активність.

Клацніть, щоб отримати корисні продукти для екстракту cistanche

1. Введення

Cistanche deserticolaYCMa.(Сім'яOrobanchaceae) — низькоросла рослина-паразит, що походить із північного заходу Китаю. Ціла висушена рослина (без квітів) відома як тонізуючий засіб і називається "Ру Конґронг«У східній медицині він класифікується як солодкий і солоний на смак, теплий за своєю природою і пов’язаний з нирками і товстим кишечником, з функцією активізації нирок і доповнення есенції, зволоження кишечника і розслаблення кишечника [1] Сучасні фармакологічні дослідження показали, що він може прискорювати синтез ДНК і сповільнювати процес старіння, підвищувати антиоксидантну дію [4], запобігати та лікувати серцево-судинні захворювання [3].Крім того, він також може спричиняти болезаспокійливу та протизапальну дію. -запальні ефекти [5], покращують навчання та пам'ять шляхом індукції факторів росту нервів Деякі дослідження показали, щоC. deserticola екстракти можуть активувати фагоцитарну функцію інтраабдомінальних макрофагів у мишей [7]-[9] і підвищити імунітет організму. Згідно з попередніми дослідженнями, ця рослина містить кілька активних компонентів, які включають фенілетаноїдні глікозиди, іридоїди, лігнани, сахариди, алкалоїди тощо [11].C. deserticola фенілетаноїдні глікозиди та полісахариди визнані основними активними компонентами, численні дослідження зосереджені на їх структурі та біоактивності протягом останніх десятиліть [12]-[17]. Що стосується цінних олігосахаридів вC. deserticola, звіти досить обмежені. Олігосахариди, коротколанцюгові сахариди, що містять гомо- або гетероцукри, добре відомі своїм благотворним впливом на життя людини і широко використовуються протягом тривалого часу [18]. Функціональні олігосахариди, які мають такі фізіологічні функції, як низька карієсогенність і фактор росту біфідобактерій [19], покращують здоров’я людей і тварин. Їх використовували як харчовий інгредієнт. Нещодавно було повідомлено про нові функції олігосахаридів, які мають здатність модулювати імунну систему людей, тварин і риб [20]. У цій статті ми повідомляємо першу частину результатів дослідницької програми, фракціонування від загальної кількості олігосахаридів, отриманих з лужного екстрактуC. deserticolaкомбінацією ультрафільтрації та гельпроникної хроматографії, а також аналіз їх складу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Крім того, ми також представляємо імунологічну активністьC. deserticolaолігосахариди. Наскільки нам відомо, опубліковано кілька звітів про дослідження імуностимулюючої активностіC. deserticola олігосахариди.

2. Експериментальний

2.1. Матеріали

TheC. deserticola був культивований і зібраний з Alexa League (Внутрішня Монголія, Китай). Мишей Куньмін (клас II, віком шість тижнів) придбали у Фармакологічному експериментальному центрі Університету Внутрішньої Монголії. Сефадекс G-100, Сефадекс G-25, трифтороцтова кислота (TFA), 1-феніл-3-метил-5- піразолон (PMP), D-глюкоза, D- галактоза, D-фруктоза, D-ксилоза, D-манноза, D-галактуронова кислота, D-глюкуронова кислота, сахароза, рамноза, маніт, фукоза, рамноза, були придбані у Sigma (Сент-Луїс, Міссурі, США). Середній RPMI-1640 був придбаний у Gibco Invitrogen Co. (Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Усі інші хімікати мали аналітичну чистоту.

2.2. Екстракція олігосахаридів

Висушені тілаC. deserticola нарізали на більш дрібні шматки і далі подрібнювали в порошок за допомогою млину, екстрагували безводним етанолом (3×5000 мл) при 70 градусах протягом 3 годин під атмосферним тиском. Для видалення ліпідів фіксували зворотний холодильник. Потім залишок екстрагували лугом (pH =10) при 60 градусах 3 рази (2 години кожного разу). Після центрифугування (2000 g протягом 15 хвилин при 20 градусах) супернатант концентрували до однієї десятої об'єму в роторному випарнику при зниженому тиску при 50 градусах і фільтрували. Потім фільтрат депротеїнізували за допомогою реактиву Sevag [21] і знебарвлювали активованим вугіллям.

2.3. Виділення та очищення олігосахаридів

Висушені заморожуванням неочищені олігосахариди розчиняли в дистильованій воді, центрифугували, а потім супернатант очищали за допомогою колонки Sephadex G-100 (1×50 см), врівноваженої надчистою водою. Після завантаження зразком колонку елюювали надчистою водою зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Різні фракції збирали за допомогою пробірок. Загальний вміст вуглеводів у кожній пробірці вимірювали при 490 нм фенол-Н₂ТОМУ₄метод [22]. Водний елюйований розчин розділяли на дві фракції CDOS-1 і CDOs-2. Дві фракції відповідно додатково очищали на колонці Sephadex G-25 (2,7×85 см) за допомогою надчистої води (зі швидкістю потоку 1 мл/хв). Після збору очищеної фракції її ліофілізували.

2.4. Аналіз моносахаридів склад

Моносахаридний склад CDO був досягнутий аналізом ВЕРХ. CDO (2 мг) гідролізували спочатку безводним метанолом, що містить 2 М HCl, при 80 градусах протягом 16 годин в атмосфері азоту, а потім 2 М TFA при 120 градусах протягом 1 години. Після видалення TFA шляхом випаровування гідролізати згодом дериватизували з PMP згідно з описаним методом [23] і аналізували за допомогою ВЕРХ. ВЕРХ-розділення проводили на системі EF-2002 HPLC (фірми KNAUER, Німеччина). Похідні PMP хроматографували з використанням об’єму Sugar-PAK (6,5×300 мм, компанія glasss of water, Америка), і оптичну густину вимірювали при 245 нм. Об’єм ін’єкції становив 20 мкл, і рухому фазу, що складається з PBS (розчинник A) і ацетонітрилу (розчинник B), використовували для ізократичного елюювання в об’ємному співвідношенні від 82 відсотків (A) до 18 відсотків (B). Загальний час роботи ВЕРХ становив 40 хв, а швидкість потоку становила 0,5 мл/хв.

2.5. Імунобіологічний Діяльності

2.5.1. Фагоцитарна функція моноцитів-макрофагів

Шістдесят мишей Куньмін (клас II, віком шість тижнів) були придбані у Фармакологічному експериментальному центрі Університету Внутрішньої Монголії та були акліматизовані протягом 1 тижня перед використанням. Усіх мишей випадковим чином розділили на чотири групи, що складалися з контрольної групи фізіологічного розчину, групи з високою дозою CDO, групи з помірною дозою та групи з низькою дозою CDO. Мишам вводили внутрішньочеревно 0.5 мл розчину олігосахаридів один раз на день протягом 5 днів. Група високого, середнього або низького дозування CDO отримувала 10{{10}}, 50 або 25 мг/кг/BW CDO відповідно; контрольній групі вводили 0,5 мл фізіологічного розчину. На сьомий день було проведено експеримент з очищення частинок вуглецю, згідно з Hou [24], і виміряно індекс селезінки та індекс тимуса. Коротко, 0,05 мл/10 г/маси тіла індійської фарби вводили кожній миші через хвостову вену, потім 20 мкл крові отримували із задньої орбітальної вени через 3 і 7 хвилин після ін’єкції. Зразки крові поміщали в пробірки з 2 мл 0,1% Na₂CO₃, а значення ОП вимірювали при 600 нм. Індекс кліренсу (K), фагоцитарний індекс ( ) та індекс імунних органів розраховували наступним чином (1), t₂і т₁означає 7 хвилин і 3 хвилини відповідно.

2.5.2. Клітина, що виробляє антитіла поширення

Групи мишей Куньмін (по п'ять на групу) були імунізовані шляхом внутрішньочеревної ін'єкції 2 х 10⁷SRBC в 1.0 мл PBS, доданого до 50 мкг тестових матеріалів (у контролі немає). Через тиждень спленоцити (10⁶клітин на 2 мл на лунку) від мишей Kunming культивували з тестовими матеріалами або без них протягом 72 годин у 10% середовищі RPMI 1640 під 5% CO₂на повітрі, в трьох примірниках для кожної культури. Кількість PFC проти SRBC на 10⁶визначали спленоцити.

2.6. Статистичний аналіз

Дані були виражені як середні значення ±SD. Різницю між досліджуваними групами та контролем аналізували за t-критерієм Стьюдента. P < 0.05="" вважалося="">

3. Результати і Обговорення

3.1. Виділення та очищення олігосахаридів

CDO були виділені з лужного екстракту висушених тілC. deserticola із виходом 3.{14}}7 відсотків . Дві фракції CDOS-1 і CDOS-2 були виділені з елюенту дистильованої води колонкою Sephadex G-100 відповідно (рис.1). Очищені фракції CDOS-1 і CDOS-2 показали один пік на колонці Sephadex G-25, що вказує на відсутність інших олігосахаридів у зразку. Результати композицій моносахаридів показали, що CDOS-1 складається лише з сахарози (рис. 2), а CDOS-2 в основному складається з сахарози, рамнози та маніту (рис. 3), з мольним співвідношенням 1:0,73:3,61.

3.2. Імунобіологічна активність CDO

Багато доказів in vivo та in vitro показали, що природні олігосахариди демонструють імуномодулюючу функцію, стимулюючи як клітинну, так і гуморальну імунну відповідь [27], [28]. У цьому документі 100 мг/кг/маси тіла CDOs збільшили індекс селезінки мишей, але не було суттєвих відмінностей в індексі тимуса між групами лікування та контрольними групами (таблиця 1). Макрофаги є важливим компонентом захисту хазяїна від вірусної інфекції, пригнічуючи внутрішньоклітинну реплікацію вірусів і вбиваючи інфіковані вірусом клітини [29]. При активації різноманітні проміжні сполуки кисню або азоту та цитокіни вивільняються з макрофагів і беруть участь у різних важливих біологічних функціях, таких як протизапальна та протипухлинна діяльність [30]-[32]. Тому фагоцитарна активність макрофагів є важливим показником імунних функцій організму. У цьому дослідженні помірні та високі дози CDO підвищували активність фагоцитозу макрофагів (табл. 1). Проліферацію клітин, що продукують антитіла, індуковану CDOs, досліджували шляхом дослідження збільшення гемолітичного PFC у селезінках мишей Kunming, які були імунізовані SRBC плюс досліджуваний зразок. Результати показали, що помірні та високі дози CDO значно посилюють проліферацію клітин, що продукують антитіла (Таблиця 2). Високі дози CDOs викликали дуже значуще збільшення кількості PFC (P <>

Список літератури

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Розпізнавання змішаного біологічного сигналу на основі вейвлет-аналізу. У: Y. Jiang, et al (eds).Proc. британсько-китайської спортивної інженерної майстерні. Ліверпуль: Всесвітня академічна спілка. 2007, стор 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao та ін. Вплив рідкоземельних елементів на рістCistanche deserticolaклітин і вироблення фенілетаноїдних глікозидів.JB io-technol, 2003, 102 (2) : 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian та ін. Новий натуральний продукт відCistanche deserticolaYCMA. Журнал китайських фармацевтичних наук,1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Антиоксидантна дія глікозидівЦистанхев тканинах мишей.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRA Антиноцицептивна та протизапальна активність, викликанаCistanche deserticolaу гризунів.J Етнофармакоl. 2002, 83(3):177-82.

[6] Чой, Дж. Г.; Місяць, М; Jeong, HU; Кім, MC; Кім, С.Й.; О, MSCistanches Herbaпокращує навчання та пам'ять, індукуючи фактор росту нервів.Поведінкові дослідження мозку. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Порівняння міжCistanche deserticolaYC Ma і C,tubulosa(Шенк) Вайт про деякі фармакологічні дії.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ та ін. Дослідження підвищення статевої потенціїC. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL та ін. Порівняння міжCistanche deserticolaYC Ma і C.tubulosa впливають на деякі фармакологічні дії.J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Імуномодулюючі ефекти полісахаридуCistanche deserticolaYC Ma.J Zhejiang Univ, Med Sci.2002, 31(4): 284- 287.

[11] Лі Юань, Сон Юаньюань, Чжан Хунцюань. Досягнення в дослідженні хімічних складових і лікувальної активності цистанхеї.Ресурси диких рослин Китаю, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Виділення та ідентифікація фенілетаноїдних глікозидів зCistanche deserticola.

Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Визначення фенілетаноїдних глікозидів уCistanche deserticolaспектрофотометрією макровезикулярної смоли.Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T та ін. Інгібування оксиду азоту фенілетаноїдами в активованих макрофагах.

Європейський журнал фармакології, 2000, 400: 137- 144.

[15] Чжао Вей, Янь Хун, Лян Чжун-Янь та ін. Структурний аналіз водорозчинного полісахариду SPA, виділеного зі стебла Cistanche Deserticola Ma.Хімічний журнал китайських університетів, 2005, 26(3):461-463.

[16] Ван Сян'ян. Дослідження імунної фармакології та характеру всмоктування полісахаридівCistanche deserticola. 2011, №S1,Медицина та медичні науки, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotective activity of phenylethanoids fromCistanche deserticola. Планта Мед. 1998, 64(2):120-5.

[18] Довідник з амілаз і споріднених ферментів (вид. Товариства дослідження амілаз Японії), Pergamon Press (1988)

[19] Арая, С. (ред.) Праці 5^тисКонференція з питань карієсу зубів і цукру (японською мовою), Національний інститут здоров’я, Токіо (1980)

[20] Кодо Отака. Функціональний олігосахарид і його новий аспект як імуномодуляція.J. Biol. Macromol. 2006, 6

(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Полісахариди з гарячих водних екстрактів смажених бобів кави арабіка: виділення та характеристика. вуглеводний.полім.1999, 40:71–81.

[22] Дюбуа М., Жиль К.А., Гамільтон Дж.К., Реберс П.А., Сміт Ф. Колориметричний метод визначення цукру та споріднених речовин.анальний Chem. 1956, 28:350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Аналіз моносахаридних компонентів у полісахаридах дягелю за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.Anal Sci. 2005, 21:1177–1180.

[24] Юфан Хоу, Юбао Хоу, Лю Яньян та ін. Екстракція та очищення лектину з червоної квасолі та попередні дослідження імунної функції лектину та чотирьох китайських рослинних полісахаридів.Журнал біомедицини та біотехнології, 2010:1-9.

[25] Каннінгем, А. Дж. і А. Сзенберг. Подальші вдосконалення техніки бляшок для виявлення окремих клітин, що утворюють антитіло.Імунологія.1968, 14:599-600.

[26] Харухіко Такада, Томохіко Огава, Фумінобу Йосімура та ін. Імунобіологічна активність поринової фракції, виділеної з Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Інфекція та імунітет. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Імуномодулююча активність CVT-E002: запатентований екстракт північноамериканського женьшеню (Panax quinque folium).J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Структури та взаємозв’язки структура-активність трьох мітогенних і комплементфіксуючих пектинові арабіногалактани малийських противиразкових рослинCochlospermum tinctoriumА. Багатий іВернонія кощянаSch Bip. ex Walp.Біомакромолекули. 2006, 7:71–79.

[29] Є.-М. Чой, А.-Ж. Кім, Ю.-О. Кім і Ж.-К. Хван, Імуномодулююча активність арабіногалактану та фукоїдану in vitro.Журнал лікувального харчування. 2005, 8(4):446–453.

[30] Y. Chen, J.-A. Дуань, Д. Цянь та ін. Оцінка та порівняння імунорегуляторної активності чотирьох водорозчинних фракцій Angelica Sinensis in vitro на перитонеальних макрофагах мишей ICR.Міжнародна імунофармакологія. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park та ін. Експресія гена прозапальних цитокінів і регуляція оксиду азоту водно-екстрагованого кореня астрагалі в клітинах макрофагів RAW 264.7.Етнофармакологічний журнал. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee та YJ Jeon. Полісахариди, виділені зі склероції Poria cocos, індукують активацію NF-κB/Rel та експресію iNOS у мишачих макрофагах.Міжнародна імунофармакологія. 2003, 3(10-11):1353–1362.