Порівняння між QPCR і RNA‑seq розкриває проблеми кількісного визначення експресії HLA Частина 1

Анотація

Локуси лейкоцитарного антигену людини (HLA) класів I і II є важливими елементами вродженого та набутого імунітету. Їх функції включають презентацію антигену Т-клітинам, що призводить до клітинної та гуморальної імунної відповіді та модуляції NK-клітин. Їх винятковий вплив на наслідки захворювання тепер було зрозуміло завдяки дослідженням асоціацій у всьому геномі. Екзони, що кодують пептид-зв'язувальну борозенку, були основним фокусом для визначення впливу HLA на сприйнятливість/патогенез захворювання. Однак рівні експресії HLA також впливають на результати захворювання, додаючи ще один вимір до надзвичайного різноманіття HLA, який впливає на варіабельність імунних відповідей у ​​різних людей.

Між лейкоцитарними антигенами і імунітетом існує тісний зв'язок. Лейкоцитарний антиген відноситься до молекули на поверхні лейкоцитів людини, яка може ідентифікувати та розрізняти різні типи клітин і патогени. Це важлива частина імунної системи людини та важливий регулятор імунної відповіді.

Відмінності в лейкоцитарних антигенах можуть призвести до різних імунних реакцій і сприйнятливості до захворювань. Наприклад, певні лейкоцитарні антигени пов'язані з аутоімунними захворюваннями, інфекційними захворюваннями та пухлинами. Експресія певних лейкоцитарних антигенів також пов'язана з функцією та кількістю імунних клітин.

Тому розуміння молекулярних характеристик поверхні лейкоцитів індивіда має велике значення для оцінки імунного статусу індивіда, ризику та прогнозу захворювання. Водночас це також сприяє розробці індивідуального лікування та профілактичних заходів. З цієї точки зору нам потрібно підвищувати імунітет. Значний вплив на підвищення імунітету має цистанхея. Цистанхе багата різними антиоксидантними речовинами, такими як вітамін С, і каротиноїди. Ці інгредієнти можуть поглинати вільні радикали, зменшувати окислювальний стрес і підвищувати стійкість імунної системи.

Натисніть порошок екстракту цистанчи трубчастої

Для оцінки експресії HLA імуногенетичні дослідження традиційно покладаються на кількісну ПЛР (кПЦР). Запровадження альтернативних високопродуктивних технологій, таких як RNA-seq, ускладнюється технічними проблемами через надзвичайний поліморфізм генів HLA. Однак нещодавно було розроблено кілька біоінформаційних методів для точної оцінки експресії HLA на основі даних РНК-секвенування. Це відкриває захоплюючу можливість кількісно визначити експресію HLA у великих наборах даних, але також викликає питання про те, чи результати РНК-seq можна порівняти з результатами КПЦР. У цьому дослідженні ми аналізуємо три класи даних експресії генів HLA класу I для відповідного набору індивідуумів: (a) РНК-seq, (b) qPCR і (c) експресія HLA-C на клітинній поверхні. Ми спостерігали помірну кореляцію між оцінками експресії за допомогою КПЦР та РНК-секвенування для HLA-A, -B та -C ({{10}}).2 Менше або дорівнює rho Менше або дорівнює 0,53 ). Ми обговорюємо технічні та біологічні фактори, які необхідно враховувати під час порівняння кількісних показників для різних молекулярних фенотипів або використання різних методів.

Ключові слова

HLA · Експресія · ПЛР · РНК-секв.

вступ

Експресія генів забезпечує молекулярний фенотип, який займає проміжне положення між генетичними варіаціями та складними фенотипами, такими як стан захворювання. Розуміння генетичної основи експресії генів може мати стратегічне значення для встановлення зв’язків між генетичними варіаціями та складними фенотипами (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), включаючи сприйнятливість до аутоімунних та інфекційних захворювань. Незважаючи на те, що дослідження генетичної варіації в локусах людського лейкоцитарного антигену (HLA) і в області головного комплексу гістосумісності (MHC) загалом використовувалися для аналізу генетичної основи кількох складних захворювань (Trowsdale and Knight 2013; Dendrou et al. 2018), включення молекулярних фенотипів, зокрема тих, що пов’язані з експресією генів, є порівняно недавнім (Apps та ін. 2015; Вінс та ін. 2016; Рамсуран та ін. 2018; Йоханссон та ін. 2022).

Ділянка MHC людини на хромосомі 6p21 демонструє високу щільність генів, з унікальними моделями нерівноваги зчеплення (LD) і екстремального поліморфізму (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). Ділянка MHC містить локуси HLA I та II класу, які кодують молекули, що беруть участь у запуску та модулюванні імунної відповіді. Молекули HLA класу I експресуються більшістю ядерних клітин і, як правило, представляють внутрішньоклітинні пептиди для CD8 плюс Т-клітин. Навпаки, молекули HLA класу II в основному експресуються професійними антигенпрезентуючими клітинами та представляють CD4 плюс Т-клітинам екзогенні антигени, які були інтерналізовані шляхом ендоцитозу. Молекули класу I також розпізнаються рецепторами природних клітин-кілерів (NK), імуноглобуліноподібних рецепторів клітин-кілерів (KIR), які впливають як на утворення, так і на активацію NK-клітин (Colonna and Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Поєднання різних алотипів HLA класу I та специфічних молекул KIR впливає на активність NK-клітин (і підмножини CD8 плюс Т-клітин), що призводить до різного ризику розвитку раку, інфекційних захворювань та аутоімунітету (переглянуто в Kulkarni et al. 2008).

Асоціації захворювання HLA в основному пов’язані з алель-специфічними відмінностями в презентації антигену внаслідок обширних поліморфізмів у борозенці, що зв’язує пептид. Однак рівні експресії HLA сприяють певним зв’язкам, що спостерігаються між поліморфізмом HLA та результатами захворювання. Рівень експресії HLA є важливим модифікатором аутоімунітету та сили опосередкованої HLA імунної відповіді на рак та інфекції (переглянуто в René et al. 2016).

Є багато прикладів зв’язку між рівнями експресії HLA та наслідками вірусної інфекції. Добре задокументовано, наприклад, що більш високі рівні експресії HLA-C як на рівні мРНК, так і на рівні білка на поверхні клітини пов’язані з кращим контролем над ВІЛ -1 (Thomas та ін. 2009; Kulkarni та інші, 2011; Аппс та інші, 2013; Пароліні та інші, 2018; Бахтел та інші, 2018), тоді як підвищена експресія HLA-A пов’язана з порушенням контролю над ВІЛ (Ramsuran та інші, 2018). Інфекція SARS-CoV-2 знижує експресію гена HLA-C (Loi та ін. 2022) і експресію HLA класу I на поверхні клітин (Zhang та ін. 2021; Аршад та ін. 2023), а також класу HLA Експресія генів II, включаючи HLA-DPA1, -DPB1, -DRA та -DRB1 (Wilk та ін. 2020).

Крім того, існує зв’язок між рівнями експресії HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) і HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) із кліренсом HBV; Експресія HLA-DRA зі сприйнятливістю до інфікування вірусами грипу А кажанів у клітинних лініях людини (Karakus et al. 2019); і значні зв’язки між регуляторними варіантами та рівнями експресії генів HLA класу II, включаючи HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 і -DRB5, з відповіддю антитіл проти кількох поширених вірусів (Kachuri et al. 2020).

Рівні експресії локусів HLA також пов’язані з аутоімунітетом (огляд див. Johansson et al. 2022). Рівні експресії HLA-C на поверхні клітини (Apps та ін. 2013; Kulkarni та ін. 2013), а також рівні HLA-G на поверхні клітини та в плазмі (da Costa Ferreira та ін. 2021) були пов’язані з ризиком запальних захворювань кишечника. Підвищена експресія HLA-B27 на поверхні клітин спостерігалася у пацієнтів з анкілозуючим спондилітом (Cauli та ін. 2002), як і загальна експресія HLA класу I у пацієнтів із хворобою Грейвса (Weider та ін. 2021). Рівень експресії HLA класу II також впливає на ризик аутоімунних захворювань.

Експресія генів HLA-DQA1 і -DRB1 і експресія молекул DQ і DR на поверхні клітин посилюється в моноцитах периферичної крові пацієнтів з вітіліго (Cavalli et al. 2016); регуляторні варіанти, пов’язані з вищою експресією генів HLA-DQA1, -DQB1 і -DRB1, а також експресією DQ і DR на поверхні клітини, пов’язані з ризиком системного червоного вовчака (Raj et al. 2016); Експресія гена HLA-DRB5 вища у пацієнтів зі склеродермією та інтерстиціальним захворюванням легенів (Odani et al. 2012); специфічні алелі HLA-DRB1 сильно експресуються у пацієнтів з ревматоїдним артритом (Houtman et al. 2021); і більш висока експресія DRB1*15:01 асоціюється з ризиком розвитку розсіяного склерозу (Alcina et al. 2012). Таким чином, розуміння варіацій експресії HLA серед індивідів і механізмів, що регулюють рівні експресії HLA, буде ключовим для розкриття генетичної основи фенотипів захворювань.

Традиційно експресію HLA оцінювали за допомогою методів на основі антитіл для рівня експресії на клітинній поверхні (Thomas та ін., 2012; Apps та ін., 2013) або за допомогою кількісної ПЛР (qPCR або RT-PCR) для рівнів транскрипції мРНК (Bettens et al. інші 2014; Рамсуран та інші 2015, 2017). Складно порівнювати результати різних досліджень або навіть порівнювати різні локуси HLA в одному дослідженні, оскільки для кожного аналізу та для кожного локусу HLA використовуються різні експериментальні процедури, що може призвести до різної ефективності ампліфікації в КПЦР або афінності антитіл у проточній цитометрії.

Високопродуктивні технології, такі як RNA-seq, забезпечують оцінку експресії для всіх генів у геномі, включаючи гени HLA, таким чином дозволяючи оцінювати експресію HLA в загальногеномному контексті. Однак ці технології створюють багато проблем, коли їх використовують для оцінки рівнів експресії генів HLA. На додаток до добре задокументованих відхилень, пов’язаних з аналізами RNA-seq (наприклад, пакетні ефекти, підготовка бібліотеки, вміст GC ('t Hoen et al. 2013), труднощі в оцінці рівнів експресії генів HLA виникають через те, що кількісна оцінка включає вирівнювання коротких зчитувань до еталонного генома, що не забезпечує повного представлення алельного різноманіття HLA.

Таким чином, деякі зчитування можуть не узгоджуватися через велику кількість відмінностей щодо еталонного геному (Brandt et al. 2015). Крім того, гени HLA є частиною сімейства генів, утвореного після послідовних раундів дублювання, і часто містять сегменти, які дуже схожі між паралогами, що призводить до перехресного вирівнювання між генами та упередженого кількісного визначення рівнів експресії. Ці труднощі спонукали до розробки обчислювальних конвеєрів (див. Johansson та ін. 2022 для огляду), які враховують відоме різноманіття HLA на етапі вирівнювання та, як було показано, забезпечують точні рівні експресії генів HLA (Boegel та ін. 2012; Lee та ін., 2018; Агіар та ін., 2019; Гутьєррес-Арселус та ін., 2020; Дарбі та ін., 2020).

У той час як підходи RNA-seq і qPCR оцінюють експресію HLA шляхом кількісного визначення великої кількості транскриптів, методи включають різні експериментальні та біоінформаційні процедури обробки. Наскільки нам відомо, кількісне порівняння результатів RNA-seq з результатами, отриманими за допомогою qPCR для генів HLA, не проводилося. У цьому дослідженні ми намагалися порівняти різні техніки та молекулярні фенотипи для кількісного визначення експресії HLA класу I, маючи на увазі, що жодна техніка не може вважатися золотим стандартом. Щоб зменшити вплив технічних і біологічних варіацій у порівнянні різних досліджень, ми провели аналіз РНК-секвенування на наборі з 96 осіб, для яких були доступні оцінки експресії qPCR (для HLA-A, -B, -C) і для підгрупи яких також була доступна експресія клітинної поверхні на основі антитіл HLA-C. Кількісне визначення RNA-seq було виконано за допомогою конвеєра, спеціально розробленого для HLA, який дозволяє точно оцінити експресію, мінімізуючи зміщення стандартних підходів, що покладаються на один еталонний геном.

Матеріали та методи

Зразки

Зразки крові були взяті у 96 здорових донорів крові, які брали участь у програмі добровільного донорства в Національній лабораторії дослідження раку Фредеріка (FNLCR). Письмова інформована згода була отримана від усіх суб’єктів, а зразки були анонімні за процедурами, затвердженими IRB Національного інституту раку. РНК екстрагували зі свіжоізольованих мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) за допомогою набору RNeasy Universal (Qiagen). РНК обробляли ДНКазою, вільною від РНКази, для видалення геномної ДНК. Загальну РНК, виділену з PBMCs, кількісно оцінювали за допомогою HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Усі зразки, які показали показник якості РНК більше 8, використовувалися в аналізі експресії генів.

HLA типування

Алелі HLA визначали секвенуванням Сенгера. Крім того, ми запустили HLApers (Aguiar et al. 2019) і Kourami (Lee and Kingsford 2018), щоб отримати висновок про алелі HLA безпосередньо з RNAseq і перевірили узгодження з викликами на основі секвенування Sanger. Якщо ми розглядаємо узгоджені дзвінки між HLApers і Kourami, ми спостерігали лише 10 розбіжностей із дзвінками Сенгера з 288 порівнянь (3 локуси × 96 осіб). Більшість із них (n=5) показали підтримку RNA-seq для алеля, дуже близького до того, що визначається секвенуванням Сенгера, тому ми вирішили зберегти виклики на основі RNA-seq. Для 3 генотипів ми спостерігаємо гомозиготні виклики від RNA-seq, ймовірно, тому, що один алель не був експресований, і ми зберегли виклики від секвенування Сенгера. Це не впливає на оцінку експресії, оскільки жодні зчитування не вирівнюються з алелем, не виявленим через RNA-seq. Для одного генотипу ми спостерігали хорошу підтримку гетерозиготного виклику, тоді як секвенування Сенгера було названо гомозиготним. У цьому випадку ми зберегли виклик на основі RNA-seq, оскільки він краще пояснював спостережувані зчитування. Для одного виклику алелі ми розглядали помилку викликів на основі РНК-seq через недостатнє охоплення читання.

Кількісна ПЛР (qPCR)

Рівні транскрипції мРНК HLA для HLA-A, -B і -C вимірювали за допомогою кПЦР в аналізі, який забезпечує неупереджену ампліфікацію загальних алелів у кожному локусі, уникаючи ампліфікації всіх інших локусів. Використані праймери: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Зворотну транскрипцію проводили за допомогою набору високої ємності РНК-кДНК (Applied Biosystems). Ампліфікацію кДНК HLA та мікроглобуліну гена 2 (B2M) проводили за допомогою Power SYBR green master mix (Applied Biosystems) на машині ABI 7900HT. Послідовності праймерів для B2M описані в таблиці S4 Kulkarni et al. (2013). Середній рівень експресії кожного гена HLA нормалізували до рівня B2M і розраховували за допомогою методу 2-∆∆Ct (де Ct — пороговий цикл).

Середні алель-специфічні рівні експресії звичайних алелей HLA оцінювали за допомогою лінійної моделі, як описано в Ramsuran et al. (2015). Зокрема, ми змоделювали експресію як лінійну функцію двох алелів, які несе кожна особина, і витягли вплив кожного алеля на експресію генів. Ми виконали цей крок у R (див. розділ Доступність коду).

Поверхневий вираз

Експресію клітинної поверхні HLA-C вимірювали на клітинах CD3 plus зі свіжоізольованих PBMC за допомогою проточної цитометрії з використанням HLA-C-специфічного моноклонального антитіла DT9 (Apps et al. 2013). Для аналізу HLA-A у підгрупі індивідуумів-носіїв A*03 і A*11 ми пофарбували клітини антитілом 0554HA (One Lambda, Inc.).

РНК-послідовність

Приготування РНК

RNA-seq проводили на РНК, що зберігалася при -80 градусах. Загальну РНК кількісно визначали за допомогою Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher). Якість РНК оцінювали за допомогою приладу 2100 Bioanalyzer і Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). Для кожного зразка 500 нг сумарної РНК використовували як вхідні дані для приготування бібліотек, збіднених рРНК цілих транскриптомів. Ліговану адаптером бібліотеку готували за допомогою набору KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Вілмінгтон, Массачусетс) з використанням адаптерів зі штрих-кодом ДНК Bioo Scientific NEXTfex™ (BioScientifc, Остін, Техас, США) відповідно до протоколу, наданого KAPA.

Деплеція рРНК за допомогою RiboErase

Рибосомальна РНК була виснажена шляхом інкубації загальної РНК із зондами, комплементарними послідовності рРНК. Після гібридизації РНКазу Н використовували для ферментативної деградації рРНК. Очищення та розщеплення ДНКазою проводили за допомогою Kapa Pure Beads і ДНКази згідно з протоколом Kapa.

Фрагментація, синтез кДНК та побудова бібліотеки

Зразки, збіднені рРНК, фрагментували при 85 градусах протягом 4,5 хвилин у присутності магнію перед синтезом 1-го та 2-го ланцюга та реакцією A-Tailing. ДНК-адаптери зі штрих-кодом NEXTfex (1,5 мкМ) лігували до кДНК з A-хвостом з унікальним штрих-кодом для кожного зразка. Продукти очищали за допомогою Kapa Pure Beads і проводили 8 циклів бібліотечної ампліфікації. Після ампліфікації було виконано остаточне очищення бібліотеки, кількісне визначення бібліотеки та КЯ оцінено за допомогою Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) і набору Agilent DNA HS на приладі 2100 Bioanalyzer.

Секвенування

Отримані бібліотеки мультиплексного секвенування використовували для формування кластерів на Illumina cBOT (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), а секвенування проводили за допомогою Illumina HiSeq 2500 відповідно до наданих Illumina протоколів для секвенування парних кінців 2×126 bp. Кожен транскриптом секвенували до цільової глибини 40–50 мільйонів читань.

RNA-seq на свіжих зразках від 11 осіб

Щоб дослідити можливість деградації зразка матеріалу, який зберігався при температурі -80 градусів до секвенування РНК, що є потенційним джерелом розбіжностей з оцінками КПЦР, ми повторно відібрали кров у 11 донорів і виконали РНК-секвенування нових зразків. Експеримент проводився з тими самими методами підготовки бібліотеки, що й раніше, але з секвенуванням за допомогою Illumina NextSeq із зчитуванням 2 × 150 pb.

Кількісне визначення експресії РНК-seq

Довідковий транскриптом

Ми використовували Salmon (Patro et al. 2017) для оцінки рівнів експресії для всіх транскриптів, анотованих у базі даних Gencode v37. Ми використали всі варіанти корекції зміщення на Salmon (зміщення GC, позиційне зміщення та зміщення, специфічне для послідовності).

Персоналізований

Те саме, що й «референтний транскриптом», але з персоналізованими транскриптами HLA відповідно до генотипів HLA-A, -B та -C, які несе кожна особа. Персоналізація була проведена шляхом вирівнювання послідовності алеля HLA еталонного геному з геномом для отримання координат. Потім, використовуючи багатопослідовне вирівнювання алеля, присутнього в еталонному геномі, з усіма іншими алелями (доступно з випуску IPD-IMGT/HLA 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), ми приписали геномну позицій до всіх алелей HLA. Нарешті, ми побудували персоналізований стенограму на основі комбінації інформації про координати транскрипту та послідовності алеля HLA. Цю процедуру було виконано в R (R Core Team 2020), використовуючи пакет Biostrings (Pagès та ін. 2020) і метапакет tidyverse (Wickham та ін. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com