Клонування, функціональна ідентифікація та аналіз експресії халконсинтази з Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Анотація: Мета Вивчити функцію халконсинтази з Guanhuaroucongrong (Цистанка трубчаста) і модель експресії гена CtCHS у білих, червоних і фіолетових квітах.
Методи. Ген CtCHS клонували за допомогою ЗТ-ПЛР і проводили біоінформаційний аналіз. Плазміду pET-28a-CtCHS перенесли в Escherichia coli, щоб індукувати експресію білка за допомогою IPTG. Рекомбінантний білок CtCHS інкубували з субстратами п-кумароїл-КоА та малоніл-КоА, а продукти виявляли за допомогою ВЕРХ та МС. Плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS перенесли в протопласт Arabidopsis thaliana для спостереження за субклітинною локалізацією білка CtCHS. Модель експресії гена CtCHS у квіткахC. tubulosaз трьома кольорами було виявлено методом qRT-PCR.
Результати Було клоновано ген CtCHS. Довжина відкритої рамки зчитування (ORF) становила 1173 bp, що кодує 390 амінокислот, а молекулярна маса білка становила 42 8000. CtCHS містив каталітичні залишки Cys164, His303, Asn336, які були консервативними в халконсинтазі. Білок CtCHS експресували в E. coli та очищали для отримання рекомбінантного білка. Білок CtCHS може каталізувати п-кумароїл-CoA та малоніл-CoA для отримання халкону нарингеніну. Білок CtCHS був переважно локалізований у цитоплазмі. Ген CtCHS був сильно експресований у фіолетових і червоних квітах, а відносні рівні експресії були в 8,44 і 3,21 рази вищими, ніж у білих квітах відповідно.
Висновок Ген CtCHS був клонований з квіткиC. tubulosaі білок експресувався. Білок CtCHS виконує функцію халконсинтази, а експресія гена CtCHS вища в темніших квітах, що вказує на те, що ген CtCHS може регулювати колір квітки C. tubulosa, що закладає основу для подальших дослідженьмеханізм регуляції забарвлення квітки C. tubulosa.
Ключові слова:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; халконсинтаза; аналіз активності ферментів; субклітинна локалізація; експресійний аналіз
НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ З 30% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 12% АКТЕОЗИДУ
Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Біосинтетикшлях флавоноїдівпочинається з фенілпропаноїдного шляху.Фенілаланінспочатку перетворюється на коричну кислоту піддія фенілаланін-амоніаліази(PAL), а корична кислота 4-гідроксилюється коричною кислотою. Фермент (-4-гідроксилаза коричної кислоти, C4H) і 4-кумараткоензим А лігаза (4-кумараткоензим А лігаза, 4CL) каталізують реакцію з утворенням 4-кумароїл-КоА [11 ]. Одна молекула 4-кумароїл-КоА та три молекули малоніл-КоА каталізуються халконсинтазою (CHS) для утворення халкону нарингеніну, який містить флавоноїдні сполуки. Основний скелет халконізомерази, флаванон-3-гідроксилаза, дигідрофлавонол 4-редуктаза тощо генерує різноманітні флавоноїди, такі як ізофлавони, флавоноли, антоціани тощо [12]. Як ключовий фермент у шляху біосинтезу флавоноїдів, CHS регулює вміст флавоноїдів у рослинах, а також відіграє важливу роль у регуляції забарвлення квіток рослин [13]. Наприклад, посттранскрипційне мовчання генів Gentiana scabra Bunge CHS може пригнічувати біосинтез антоціанів і викликати специфічне відбілювання часток віночка [14]. Приглушення гена CHS Actinidia erianthaBenth. CHS знижує вміст антоціану в пелюстках і робить пелюстки червоними. Пелюстки стають світлішими[15]. Таким чином, у цьому дослідженні ген CtCHS був клонований із квіток Cistanche tubulosa, і на ньому було проведено біоінформаційний аналіз, експресію та очищення прокаріотів, аналіз активності ферментів, аналіз субклітинної локалізації та аналіз експресії в трьох кольорах квітів, щоб дослідити функцію CtCHS. протеїн і модель експресії гена CtCHS були використані для попереднього дослідження зв’язку між CtCHS і забарвленням квітки Cistanche tubulosa, що заклало основу для вивчення регуляторного механізмуЗабарвлення квітки цистанхи трубчастої.
1 Матеріали та інструменти
1.1 Матеріали
Квіти Cistanche tubulosa були зібрані з округу Юйтянь, префектура Хотан, Сіньцзян у травні 2018 року. Під час відбору зразків дотримувалися принципу випадкової вибірки, і були відібрані квіти Cistanche tubulosa з хорошим фізіологічним станом і постійною висотою рослин. Професор Ту Пенфей з фармацевтичної школи Пекінського університету взяв три сорти Cistanche tubulosa з трьома кольорами квіток білого, червоного та фіолетового і ідентифікував їх як Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Їх швидко заморозили в рідкому азоті, а потім транспортували до Пекіна в сховищі сухого льоду. Хімічно компетентні клітини E. coli DH5 були придбані у Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., а хімічно компетентні клітини E. coli BL21 (DE3) були придбані у Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP. Вектор було придбано в Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA було придбано в Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -халкон були придбані у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., а нарингенін був придбаний у Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Інструменти
спектрофотометр Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, США); прилад градієнтної ПЛР (компанія Eppendorf, Німеччина); Прилад для флуоресцентної кількісної ПЛР CFX 96, пристрій для зображення гелю UVP, прилад для електрофорезу в гелі, прилад для електрофорезу білка (компанія BioRad, США); EnSpire
Рідер мікропланшетів (PerkinElmer Company, США); інкубатор постійної температури (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Повнотемпературний генератор великої ємності DHZ-D (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Осцилятор постійної температури на водяній бані (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); Ультрачистий верстак AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); паровий стерилізатор високого тиску (компанія TOMY, Японія); Прилад для чистої води Milli Q (Millipore, США); LC-20Високоефективний рідинно-фазний хроматограф (Shimadzu Company, Японія); Мас-спектрометрія високої роздільної здатності UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, США); Лазерний конфокальний мікроскоп FV1200 (компанія Olympus, Японія).
2 Експериментальні методи
2.1 Екстракція РНК і синтез кДНК.
Квітки Cistanche tubulosa подрібнювали в рідкому азоті, а потім піддавали аналізу екстракції РНК.
Загальну РНК екстрагували за допомогою набору (Norgen, Cat 17200), концентрацію та якість РНК виявляли за допомогою NanoDrop 2000C, а зразки РНК із співвідношенням A260/A280 між 1,8 і 2,1 відбирали для зворотної транскрипції для синтезу кДНК. Зворотну транскриптазу M-MLV (Promega, M170B) використовували для зворотної транскрипції кваліфікованої загальної РНК у кДНК. Експериментальні роботи проводили відповідно до інструкції.
2.2 Клонування гена CtCHS
На основі даних транскриптома квітки Cistanche tubulosa нашої дослідницької групи [16] було відібрано CtCHS із повною відкритою рамкою зчитування, а програмне забезпечення SnapGene було використано для розробки специфічних праймерів на основі послідовності гена (табл. 1). ПЛР-ампліфікацію проводили з використанням кДНК квітки Cistanche tubulosa як матриці. Система ампліфікації: 2 × буфер Phanta Max 25 мкл, dNTPMix (10 ммоль/л) 1 мкл, праймери вище та нижче за течією (10 мкмоль/л) по 2 мкл кожен, кДНК 2 мкл, ДНК-полімераза Phanta Max SuperFidelity 1 мкл, ddH2O 17 мкл. Умови реакції були: попередня денатурація при 95 градусах протягом 3 хвилин; 25 циклів денатурації при 95 градусах протягом 15 секунд, відпалу при 55 градусах протягом 15 секунд і подовження при 72 градусах протягом 1 хвилини; розширення реакції при 72 градусах протягом 5 хв. Продукт ПЛР виявляли за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі, і набір для очищення ДНК (Novizan, Cat DC301-01) використовували для виділення гелю, а потім відновлену ДНК очищали за допомогою набору для швидкого клонування (Novizan, Cat C601-01). Фрагмент ДНК лігували з вектором pCE2TA/Blunt-Zero, трансформували в компетентні клітини Escherichia coli DH5, і після культивування протягом ночі при температурі 37 градусів одиничний штам клону відбирали та відправляли на компанію для секвенування.
Таблиця 1 Послідовності праймерів
2.3 Біоінформаційний аналіз
Використовуйте онлайн-програмне забезпечення ProtParam для аналізу фізичних і хімічних властивостей білка; використовувати онлайн-інструмент Prot Scale для аналізу гідрофільності/гідрофобності білка; використовувати онлайн-інструмент SOPMA для прогнозування вторинної структури білка; використовувати програмне забезпечення онлайн-аналізу SWISS-MODEL для прогнозування третинної структури білка; використовувати онлайн програмне забезпечення TMHMM Передбачити трансмембранну структуру білка; використовувати програмне забезпечення DNAMAN для порівняння гомології CtCHS з амінокислотними послідовностями CHS інших видів; використовуйте програмне забезпечення MEGA-X для побудови філогенетичного дерева, використовуючи об’єднання сусідів (NJ) і поправку Пуассона. Еволюційна відстань обчислюється за допомогою методу Bootstrap, а кількість повторень Bootstrap становить 1000 разів.
2.4 CtCHS прокаріотична експресія та очищення
Сконструюйте праймери з сайтами рестрикції BamHⅠ та XhoⅠ на основі послідовності CtCHS, а ПЛР ампліфікує відповідні цільові фрагменти. Вектор pET-28a та цільовий фрагмент розщеплювали за допомогою ендонуклеаз BamHI та. Клонований штам секвенували, а плазміду екстрагували після правильного секвенування. Плазміду pET-28a-CtCHS, підтверджену секвенуванням, перенесли в компетентні клітини Escherichia coli BL21 (DE3). Зверніться до методу Ding Ning та ін. [17] з ізопропілом
-D-тіогалактопіранозид (IPTG) використовували для індукції експресії білка при низькій температурі та очищали через колонку афінної хроматографії Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Білок концентрували центрифугуванням в ультрафільтраційній пробірці (Millipore, 30 000) і знесолювали. Зберігайте в 20 ммоль/л буфері KPB (pH 8,0, містить 1 ммоль/LEDTA) і зберігайте в холодильнику при температурі -80 градусів для тривалого зберігання.
2.5 Аналіз активності ферментів CtCHS
Ферментна реакційна система CtCHS: 100 ммоль/л KPB (pH 7,5) 468 мкл, 1 ммоль/л малоніл-КоА 10 мкл, 5 ммоль/л 4-кумароїл-КоА 2 мкл, рекомбінантний CtCHS білка 20 мкл, у Після реакції на водяній бані при 37 градусах протягом 12 годин суміш тричі екстрагували 800 мкл етилацетату, сушили потоком азоту, а потім розчиняли в 100 мкл метанолу. Для виявлення продукту використовуйте високоефективну рідинну хроматографію. Умови: колонка Ultimate LP-C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм), температура колонки 30 градусів, об’єм зразка 10 мкл, вода (A) і ацетонітрил (B) як потік. Фаза, градієнт елюції: 0~10
мін., 30% B; 10~20 хв, 30%~60% B; 20~25 хв, 60%~70% B; 25~30 хв, 70%~80% B; 30~35 хв, 80%~100% B; 35-40 хв, 100% B; 40-46 хв, 100%-30% B. Об’ємна швидкість потоку становить 1 мл/хв, а виявлення відбувається на довжині хвилі 290 нм.
Для подальшого виявлення використовували UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Умови рідкої фази: колонка Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 мм × 3.0 мм, 1,7 мкм), температура колонки 40 градуси, нарингенін- контроль халкону та нарінгеніну. Об’єм завантаження продукту становить 4 мкл, а об’єм завантаження продукту ферментативної реакції становить 7 мкл. В якості рухомої фази використовується вода (А)-ацетонітрил (В). Градієнт елюції: від 0 до 5 хв, 30% В; 5–15 хв, 30 %-60% B; 15-20 хв, 60%-100% B; 20-25 хв, 100% B; 25-31 хв, 100%-30% B. Об’ємна швидкість потоку становить 0,3 мл/хв. Умови мас-спектрометрії: електророзпилювальне джерело іонів, азот як газ-носій, тиск оболонкового газу 3,5 МПа, тиск допоміжного газу 1,0 МПа, тиск розпилення 3500 В, температура капіляра 350 градусів, температура нагріву допоміжного газу 200 градусів, режими позитивних і негативних іонів, сканування діапазон іонів m/z становить 100-1500, повна роздільна здатність MS становить 35 000, роздільна здатність dd-MS2 становить 17 500, (N)
CE/stepped nce встановлено на 35, 60.
2.3 Біоінформаційний аналіз
Використовуйте онлайн-програмне забезпечення ProtParam для аналізу фізичних і хімічних властивостей білка; використовувати онлайн-інструмент Prot Scale для аналізу гідрофільності/гідрофобності білка; використовувати онлайн-інструмент SOPMA для прогнозування вторинної структури білка; використовувати програмне забезпечення онлайн-аналізу SWISS-MODEL для прогнозування третинної структури білка; використовувати онлайн програмне забезпечення TMHMM Передбачити трансмембранну структуру білка; використовувати програмне забезпечення DNAMAN для порівняння гомології CtCHS з амінокислотними послідовностями CHS інших видів; використовуйте програмне забезпечення MEGA-X для побудови філогенетичного дерева, використовуючи об’єднання сусідів (NJ) і поправку Пуассона. Еволюційна відстань обчислюється за допомогою методу Bootstrap, а кількість повторень Bootstrap становить 1000 разів.
2.4 CtCHS прокаріотична експресія та очищення
Сконструюйте праймери з сайтами рестрикції BamHⅠ та XhoⅠ на основі послідовності CtCHS, а ПЛР ампліфікує відповідні цільові фрагменти. Вектор pET-28a та цільовий фрагмент розщеплювали за допомогою ендонуклеаз BamHI та. Клонований штам секвенували, а плазміду екстрагували після правильного секвенування. Плазміду pET-28a-CtCHS, підтверджену секвенуванням, перенесли в компетентні клітини Escherichia coli BL21 (DE3). Зверніться до методу Ding Ning та ін. [17] з ізопропілом
-D-тіогалактопіранозид (IPTG) використовували для індукції експресії білка при низькій температурі та очищали через колонку афінної хроматографії Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Білок концентрували центрифугуванням в ультрафільтраційній пробірці (Millipore, 30 000) і знесолювали. Зберігайте в 20 ммоль/л буфері KPB (pH 8,0, містить 1 ммоль/LEDTA) і зберігайте в холодильнику при температурі -80 градусів для тривалого зберігання.
2.5 Аналіз активності ферментів CtCHS
Ферментна реакційна система CtCHS: 100 ммоль/л KPB (pH 7,5) 468 мкл, 1 ммоль/л малоніл-КоА 10 мкл, 5 ммоль/л 4-кумароїл-КоА 2 мкл, рекомбінантний CtCHS білка 20 мкл, у Після реакції на водяній бані при 37 градусах протягом 12 годин суміш тричі екстрагували 800 мкл етилацетату, сушили потоком азоту, а потім розчиняли в 100 мкл метанолу. Для виявлення продукту використовуйте високоефективну рідинну хроматографію. Умови: колонка Ultimate LP-C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм), температура колонки 30 градусів, об’єм зразка 10 мкл, вода (A) і ацетонітрил (B) як потік. Фаза, градієнт елюції: 0~10
мін., 30% B; 10~20 хв, 30%~60% B; 20~25 хв, 60%~70% B; 25~30 хв, 70%~80% B; 30~35 хв, 80%~100% B; 35-40 хв, 100% B; 40-46 хв, 100%-30% B. Об’ємна швидкість потоку становить 1 мл/хв, а виявлення відбувається на довжині хвилі 290 нм.
Для подальшого виявлення використовували UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Умови рідкої фази: колонка Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 мм × 3.0 мм, 1,7 мкм), температура колонки 40 градуси, нарингенін- контроль халкону та нарінгеніну. Об’єм завантаження продукту становить 4 мкл, а об’єм завантаження продукту ферментативної реакції становить 7 мкл. В якості рухомої фази використовується вода (А)-ацетонітрил (В). Градієнт елюції: від 0 до 5 хв, 30% В; 5–15 хв, 30 %-60% B; 15-20 хв, 60%-100% B; 20-25 хв, 100% B; 25-31 хв, 100%-30% B. Об’ємна швидкість потоку становить 0,3 мл/хв. Умови мас-спектрометрії: електророзпилювальне джерело іонів, азот як газ-носій, тиск оболонкового газу 3,5 МПа, тиск допоміжного газу 1,0 МПа, тиск розпилення 3500 В, температура капіляра 350 градусів, температура нагріву допоміжного газу 200 градусів, режими позитивних і негативних іонів, сканування діапазон іонів m/z становить 100-1500, повна роздільна здатність MS становить 35 000, роздільна здатність dd-MS2 становить 17 500, (N)
CE/stepped nce встановлено на 35, 60.
2.6 Субклітинна локалізація білка CtCHS
На основі послідовності CtCHS і принципу безшовного клонування були сконструйовані праймери з сайтами різання ферментів Kpn Ⅰ і BamH Ⅰ, а відповідні цільові фрагменти ампліфіковані за допомогою ПЛР. Плазміду pCAMBIA1300-35S-GFP розщеплювали ендонуклеазами рестрикції Kpn Ⅰ та BamH Ⅰ, а цільовий фрагмент і вектор з’єднували через набір для безшовного клонування (Novizan, Cat C115-01), а потім переносили у компетентні клітини E. coli DH5. , виберіть окремі штами-клони для секвенування та витягніть плазміди з правильних штамів. Плазміди pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS і pCAMBIA 1300-35S-GFP трансформували в протопласти Arabidopsis thaliana за допомогою PEG4000 і культивували при слабкому освітленні протягом 8-10 годин. Субклітинну локалізацію білка CtCHS спостерігали під лазерним конфокальним мікроскопом.
2.7 Аналіз шаблону експресії CtCHS
Флуоресцентні кількісні праймери в режимі реального часу були розроблені з використанням DNAMAN на основі послідовності CtCHS, з F-box як внутрішнім еталонним геном. Послідовності праймерів наведені в таблиці 1. Відносну експресію CtCHS у квітках Cistanche tubulosa різних кольорів було виявлено за допомогою флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі. Використовуйте TransStart Green qPCR SuperMix (повне золото, AQ101-02) для вимірювання методом флуоресцентного барвника SYBRGreen. Реакційна система: 2 × TransStartGreen qPCR SuperMix 5 мкл, праймери вище та нижче за течією (10 мкмоль/л) 0.2 мкл кожен, матриця кДНК 0,5 мкл, 4,1 мкл води, вільної від нуклеотидаз, використовували для реакції двостадійним методом. Процедура реакції була заснована на методі Dong Xianjuan et al. [18]. Кожен зразок містив 3 біологічні повтори, і експеримент повторювався тричі. Експериментальні дані аналізували за допомогою Excel, відносний вираз CtCHS розраховували за допомогою методу 2−ΔΔCt, а GraphPadPrism 8 використовували для виконання аналізу значимості та малювання гістограм.
